pNTAP-PRAK真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的: 构建pNTAP-PRAK真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系。方法: 将人的PRAK亚克隆至串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-PRAK,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用PolyFect脂质体介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-PRAK融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-PRAK的表达及细胞内定位情况。结果: 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-PRAK主要分布在核内。结论: 成功构建pNTAP-PRAK真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对PRAK定位产生明显影响。     

结核分枝杆菌脂蛋白G在HEK293T细胞中的表达及纯化

目的构建含结核分枝杆菌(MTB)脂蛋白G(Lpr G)基因的真核表达载体pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG,并在HEK293T细胞中表达和纯化Lpr G融合蛋白。方法以MTB H37Rv基因组DNA为模板,用PCR法扩增Lpr G基因,并通过DNA重组构建真核表达载体pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG,酶切鉴定并测序。将重组质粒转染HEK293T细胞后,应用Western blot法检测His-Lpr G-FLAG融合蛋白的表达。利用Ni-NTA金属亲和层析柱从细胞上清和细胞裂解液中纯化融合蛋白His-Lpr G-FLAG,并用SDS-PAGE和Western blot法检测纯化后的蛋白。结果成功构建了pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG的真核表达载体,Western blot结果表明转染质粒后,HEK293T细胞裂解液中检测到目的蛋白,相对分子量(Mr)为27 000。经Ni-NTA金属亲和层析柱纯化后得到高纯度的融合蛋白His-Lpr G-FLAG。结论成功构建并在HEK293T细胞中表达和纯化了His-Lpr G-FLAG融合蛋白。     

2型登革病毒非结构蛋白NS3的表达及其相互作用蛋白的纯化

目的构建2型登革病毒(DENV2)非结构蛋白3(NS3)与亲和标签融合蛋白的表达质粒,串联亲和纯化(TAP)法获得与NS3相互作用的蛋白。方法根据DENV2基因序列,设计引物;以DENV2 c DNA为模板,PCR扩增出NS3基因,经酶切后克隆至含有串联亲和标签(FLAG-StrepⅡ)的哺乳真核表达载体p CI-SF,获得重组表达质粒p CI-NS3-SF;将上述重组质粒通过转染试剂LipofectamineTM2000瞬时转染进入HEK293T细胞,Western blot法验证NS3融合蛋白的表达;通过TAP法分离纯化与NS3相互作用的蛋白。结果成功构建了NS3融合蛋白表达载体,利用TAP系统分离得到与NS3蛋白相互作用的宿主蛋白。结论串联亲和纯化法可以有效的分离与DENV2 NS3相互作用的细胞蛋白。     

重组人平足蛋白基因在中国仓鼠卵巢细胞的稳定表达

目的构建平足蛋白(PDPN)真核表达质粒PDPN-pEGFP-N1,建立稳定高表达重组人PDPN的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对其进行生物学活性研究。方法通过反转录PCR和DNA重组技术从HEK293细胞中克隆PDPN cDNA,插入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的真核表达载体pEGFP-N1中。通过PCR、酶切及测序等方法鉴定重组载体;进而将该重组载体转染至CHO细胞中,通过荧光显微镜检测EGFP的表达,Western blot法检测PDPN在CHO细胞中的表达,流式细胞术分选高表达PDPN的CHO细胞,运用血小板聚集实验检测分选后细胞株的生物学活性。结果 DNA测序和酶切鉴定证明PDPN基因正确克隆至pEGFP-N1载体中,重组载体稳定转染CHO细胞后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光,流式细胞术分选后的细胞高表达PDPN;Western blot结果显示转染后CHO细胞膜表面表达PDPN蛋白;过表达PDPN的CHO细胞可以诱导人血小板聚集。结论成功构建了稳定高表达PDPN蛋白的CHO细胞株,该细胞株可表达PDPN,并诱导血小板聚集。     

小鼠FasL基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建含有小鼠Fas Ligand(FasL)基因的重组真核表达载体,并检测FasL蛋白在其稳定转染的HEK293细胞中的表达情况,为构建表达小鼠Fas L的树突状细胞(DC)模型,深入研究DC联合T细胞防治移植物抗宿主病(GVHD)的新方法奠定基础。方法从小鼠脾脏中提取RNA并逆转录为cDNA,以该cDNA为模板扩增FasL基因,插入pcDNA3.1(+)载体中构建pcDNA3.1(+)-FasL重组质粒,利用脂质体将其转染HEK293细胞,用G418筛选稳定表达细胞系,Western blot确定重组蛋白的表达。结果通过酶切及测序证实FasL序列正确插入表达载体pcDNA3.1(+),Western blot检测证实转染重组质粒的细胞能正确表达FasL蛋白,G418筛选后能够得到稳定表达FasL的抗性细胞株即FasL-HEK293。结论重组质粒pcDNA3.1(+)-FasL和稳定表达FasL的HEK 293细胞成功构建,为后续FasL-DC细胞的研究打下了坚实基础。     

可溶性CD20在HEK293T细胞中的高效表达

目的构建CD20真核表达载体,在HEK293T细胞中高效表达CD20蛋白。方法以人外周血单个核细胞(PBMC总RNA为模板,反转录PCR扩增得到CD20基因,并插入真核表达载体p CMV3-C-His,PCR初步验证后,再测序验证。将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞进行蛋白表达,ELISA、Western blot法检测CD20蛋白表达,优化表达条件。结果 PCR与测序均显示成功插入CD20基因。转染HEK293T细胞72 h后,Western blot法检测到细胞内和细胞培养上清液中的CD20蛋白。HEK293T细胞传代次数与细胞培养上清液中CD20表达量相关。结论成功构建CD20真核表达载体,高效表达CD20可溶性蛋白。     

人TRAF3IP3基因的克隆及真核表达

目的 构建人肿瘤坏死因子受体相关因子3相互作用蛋白3(TRAF3IP3)基因真核表达载体,并进行表达检测及鉴定.方法 RT-PCR扩增获得TRAF3IP3开放读码框区基因,双酶切连入真核表达载体pIRES2-EGFP,双酶切和测序鉴定阳性克隆;重组质粒磷酸钙法转染HEK293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,实时定量PCR和Western blot法鉴定TRAF3IP3基因的表达情况.结果 经限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,成功构建了TRAF3IP3真核表达质粒,荧光显微镜观察可见转染了重组质粒的HEK293细胞有绿色荧光蛋白的表达,实时定量PCR和Western blot结果证实TRAF3IP3蛋白高水平表达.结论 成功构建了pIRES-EGFP-TRAF3IP3真核表达质粒,为TRAF3IP3基因功能的研究奠定了基础.     

Salusin-a基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:研究增强型绿色荧光蛋白真核表达载体Salusin-a(pEG-FP-Salusin-a)的构建及在人胚胎肾细胞系293细胞(HEK293)中的表达。方法:提取人单核细胞系THP-1细胞Salusin-a的mRNA,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增Salusin-a基因,克隆入pEGFP-N3载体,双酶切、菌落PCR及测序鉴定pEGFP-Salusin-a质粒。用脂质体转染pEGFP-Salusin-a入HEK293细胞,分为转染细胞组、质粒对照组和空白对照组,检测分析各组荧光蛋白和Salusin-a基因的表达。结果:成功构建pEGFP-Salusin-a质粒,并转染HEK293,细胞转染效率86%,转染细胞组和质粒对照组绿色荧光蛋白的表达明显高于空白对照组(P0.05);转染细胞组Salusin-amRNA的表达明显高于质粒对照组和空白对照组(P0.05)。结论:重组pEGFP-Salusin-a质粒能转染HEK293细胞并表达Salusin-a,为Salusin-a基因功能的进一步研究提供了实验基础。     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的 克隆人类泛素水解酶22(ubiquitin-specific processing enzyme 22,USP22)基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体.方法 利用RT-PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP-N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布.结果 测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEGFP-USP22构建无误,质粒转染后有80 %左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布.结论 成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础.     

乙肝病毒HBsAg-EGFP融合蛋白真核表达载体构建及稳定转染Chang Liver细胞系的建立

目的 构建可表达乙型肝炎病毒(HBV)HBsAg-EGFP融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系.方法 利用PCR技术从HBV基因组中扩增出HBsAg基因片段,BamH I/EcoR l双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP-N1真核表达载体,转化TG1菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒pEGFPNl.HBsAg.将阳性克隆用脂质体法转染Chang Liver细胞,经持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系.结果 成功构建了真核表达载体pEGFPN1-HBsAg;建立了其重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系.结论 重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系可表达HBsAg-EGFP融合蛋白;该细胞系可以用于筛选HBsAg转染细胞后,差异表达的蛋白质研究,为深入研究HBsAg可能的致病机制提供依据.     

Trim6真核表达载体的构建及表达

目的:构建人Trim6的真核表达载体pcDNA3.1(+ )-Trim6,并观察其在HEK293T细胞中的表达.方法:提取HeLa细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增出Trim6编码区全长基因片段,克隆到pcDNA3.1(+),通过酶切、菌落PCR及测序进行鉴定.将该载体转染HEK293T细胞,用蛋白印迹检测Trim6蛋白的表达.结果:通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建人Trim6表达载体,该载体可以在HEK293T细胞细胞系中表达Trim6.结论:构建Trim6真核表达载体pcDNA3.1(+)-Trim6,为研究Trim6在固有免疫应答中的作用奠定了基础.     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建peDNA3．1（-）／NNMT（尼克酰胺-N-甲基化酶）真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1／NNMT重组质粒中克隆得到NNMT cDNA全长序列,并将扩增的eDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（-）中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT—PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功．经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。     

人类基因XAPC7真核表达载体的构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达.方法:采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7 cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中.构建好的pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达质粒经酶切鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再应用半定量RT-PCR技术检测转染前后该细胞株XAPC7基因的mRNA表达水平.结果:pcDNA3.1(-)/XAPC7经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR检测,重组质粒转染株的XAPC7基因mRNA表达水平高于对照组,证实XAPC7基因已经稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达.结论:成功地建立了人基因XAPC7的稳定转染细胞株,为进一步研究XAPC7的功能奠定了实验基础.     

汉滩病毒核衣壳蛋白与宿主相互作用蛋白的分离与纯化

目的构建带有亲和素标签的汉滩病毒(HTNV)核衣壳蛋白(NP)表达质粒,转染HEK293T细胞并表达后,鉴定与其相互作用的宿主蛋白。方法合成亲和素标签基因(SF)与HTNV NP基因,先后克隆入哺乳动物真核表达载体pCAGGS,构建带有亲和标签SF的HTNV NP表达质粒,酶切鉴定重组质粒,获得的重组质粒命名为pCAGGS-SF-NP。将重组表达质粒瞬时转染到HEK293T细胞中, Western blot法检测重组质粒的表达;瞬时转染并收获蛋白样品,与StrepTrap~(TM) HP琼脂珠混匀后, 4℃过夜孵育;转移到层析柱中,经缓冲液洗涤、脱硫生物素洗脱完成亲和层析,获得洗脱样本;洗脱样品进行SDS-PAGE,分离得到与NP相互作用的宿主蛋白。结果酶切鉴定结果表明成功构建pCAGGS-SF和pCAGGS-SF-NP,重组质粒成功表达串联SF与NP的融合蛋白;在亲和层析过程中,成功特异富集融合蛋白SF-NP;洗脱样品成功分离出与NP相互作用的宿主蛋白。结论构建的重组表达质粒可以在真核细胞中成功表达融合蛋白SF-NP并获得了与NP相互作用的宿主蛋白。     

Trim22缺失突变体真核表达载体的构建

目的构建Trim22缺失突变体的真核表达载体,为进一步研究Trim22与HIV-1衣壳蛋白的相互作用奠定基础。方法以野生型Trim22真核表达质粒为模板,用PCR方法扩增出5种类型Trim22缺失突变体的基因片段,克隆到5`-Flag-pcDNA3.1(+)真核表达载体,通过酶切、菌落PCR及测序进行鉴定。将该载体转染HEK293T细胞,用蛋白印迹及免疫沉淀检测Trim22缺失突变体的蛋白表达。结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建5种人Trim22缺失突变体的表达载体,载体均可以在HEK293T细胞中表达。结论成功构建5种人Trim22缺失突变体的真核表达载体,为探寻Trim22与HIV-1衣壳蛋白相互作用的关键结构域奠定了基础。     

表达丙型肝炎病毒核心蛋白的人肝癌稳定转染细胞株的建立与鉴定

目的建立能表达丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV core)的人肝癌细胞SMMC-7721的稳定转染细胞株。方法构建含目的基因HCV core的重组质粒,转染HEK293T细胞,包装获得含ZsGreen和HCV core基因的慢病毒后,感染SMMC-7721人肝癌细胞,采用实时荧光定量PCR检测HCV core mRNA表达,采用免疫荧光细胞化学染色和Western blot法检测HCV core蛋白表达,筛选稳定表达HCV core的细胞株。结果质粒酶切和序列测定证实重组载体构建正确;慢病毒包装48 h后可见清晰ZsGreen表达,感染SMMC-7721细胞后筛选获得稳定转染的细胞株,实时荧光定量PCR检测到HCV core mRNA,免疫荧光细胞化学染色和Western blot法均检测出HCV core蛋白表达。结论成功构建了表达HCV core蛋白的SMMC-7721人肝癌细胞的稳定转染细胞株。     

ureI和ctB-ureI真核质粒构建及表达分析

目的:构建ureI和ctB-ureI真核表达质粒并分析其在细胞的表达情况。方法:用pIRES-RD2真核表达载体分别在5′端连接ureI和ctB-ureI基因,经双酶切和测序鉴定正确后,相应质粒用脂质体转染HEK293T细胞,用荧光显微镜观察荧光标签,确定质粒的转染率;用人抗幽门螺旋杆菌抗体和马抗CtB抗体,采用免疫荧光和免疫酶组织化学等方法研究该两种真核表达质粒在细胞中目的蛋白表达情况。结果:成功构建了ureI和ctB-ureI的真核表达质粒pIRES-RD2-ureI和pIRES-RD2-ctB-ureI,用此质粒转染HEK293T细胞48～72h后,荧光显微镜显示该两种质粒的转染率约为80%;用免疫荧光和免疫酶组织化学方法表明了该两种基因均能在HEK293T细胞表达并有免疫反应性,表达的ureI主要分布在胞质内或细胞膜附近,ctB-ureI在CtB信号肽引导下分布于HEK293T细胞质、细胞膜附近以及细胞外。结论:成功构建了真核载体pIRES2-DsRed2-ureI和pIRES2-DsRed2-ctB-ureI,目的蛋白表达于HEK293T细胞胞质内并有一定免疫反应性。     

丙肝病毒NS5B-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及稳定转染HepG2细胞系的建立

目的　构建可表达丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B EGFP融合蛋白的真核表达载体 ;获得重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。方法　利用PCR技术从HCV基因组中扩增出ns5b基因片段 ,XhoⅠ KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP N3真核表达载体 ,转化TG1菌株感受态细胞 ,获得阳性重组质粒pEGFPN3 ns5b。将阳性克隆用脂质体法转染HepG2 细胞 ,经持续G4 18压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系。结果　成功构建了真核表达载体pEGFPN3 ns5b ;建立了其重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。结论　重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系可表达NS5B EGFP融合蛋白 ;该HepG2 细胞系可以应用于以ns5b基因为靶位的抗HCV感染研究     

过表达EB病毒潜伏期膜蛋白1(LMP1)的人B淋巴细胞株的建立

目的构建EB病毒潜伏期膜蛋白1(LMP1)基因的真核表达载体,通过电穿孔法转染人B淋巴瘤细胞株Ramos细胞,建立稳定的LMP1表达细胞株。方法扩增带有EcoRⅠ与BamHⅠ酶切位点的LMP1编码基因,克隆至pcDNA3.1-EF1a-mcs-3FLAG-CMV-EGFP真核表达载体,挑取阳性单克隆感受态细胞行PCR以及测序后将重组质粒通过电穿孔法转染Ramos细胞, G418筛选稳定表达LMP1的细胞株, PCR和Western blot法分别检测LMP1 mRNA和蛋白在Ramos细胞中的表达。结果 PCR与测序证实成功构建了LMP1重组质粒,建立了稳定转染的Ramos细胞,且LMP1蛋白可在细胞中成功表达。结论成功建立了稳定表达LMP1的Ramos细胞。     

HBV融合抗原真核表达载体pIRES-neo-HBAg的构建及表达

目的 构建HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg,并验证其在293T细胞中的表达.方法 以含有HBV融合抗原的质粒pVAX1-HBV为模板,PCR扩增该融合基因.PCR产物经纯化后,将其克隆至载体pMD18-T中,构建pMD18-T-HBV质粒,经酶切和测序鉴定后,将其定向克隆入真核表达载体pIRES-neo,获得真核表达质粒pIRES-neo-HBAg.将该重组表达质粒瞬时转染人293T细胞,采用Western blot法、流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术验证HBV融合抗原的表达.结果 成功构建了HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg,Western blot法、流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术结果显示融合抗原能够在293T细胞中表达.结论 成功构建了HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg.