核酶基因抑制肝癌细胞低氧诱导因子-1α表达的实验研究

目的探讨靶向HIF-1α核酶基因对肝癌细胞HIF-1α表达的调控。方法采用脂质体介导的方法，将靶向HIF-1α核酶基因真核表达载体转染肝癌细胞Hep3B2，并予低氧条件诱导。于转染后48h采用Western Blotting检测Hep3B2细胞中HIF-1α蛋白的表达水平；荧光报告基因方法检测HIF-1转录活性。结果Hep3B2细胞低氧诱导后，HIF-1α蛋白表达水平、HIF-1转录活性增高（1．0±0．02），转染核酶基因400μmol／L后48h，Hep3B2细胞低氧诱导的HIF-1α蛋白表达水平明显下降，HIF-1转录活性下调（0．12±0．025，P〈0．05）。结论核酶基因可特异性抑制低氧诱导的肝癌细胞HIF-1α表达，降低其转录活性。     

弓形虫ROP16蛋白诱导肝癌细胞凋亡的检测

目的观察弓形虫ROP16蛋白转染肝癌细胞Hep G2后,肝癌细胞的凋亡比率的变化以及细胞凋亡蛋白的表达水平变化。方法克隆弓形虫ROP16基因,构建真核转染质粒,并用脂质体转染的方式转染Hep G2细胞,48小时后,用流式细胞仪检测细胞凋亡比率,用western blotting和RT-PCR的方法检测细胞凋亡相关蛋白caspase-9、Bax、Bcl-2等的表达水平。结果与未转染细胞组相比,弓形虫ROP16转染Hep G2细胞后,肝癌细胞的凋亡比率明显升高。促细胞凋亡蛋白caspase-9、Bax的蛋白表达水平和基因转录水平均升高,而抑制细胞凋亡蛋白Bcl-2的表达水平和转录水平下降。结论 ROP16蛋白可以诱导肝癌细胞Hep G2发生凋亡。     

微环境诱导肝细胞癌多药耐药的形成及机制

目的探讨微环境在肝癌多药耐药（MDR）表型形成中的作用，并初探其作用机制，为逆转肝癌耐药提供有效的新的分子靶点。方法模拟肝癌体内生长的局部微环境，使HepG2细胞分别在缺氧、低糖的微环境下生长或稳定整合HBX基因。应用荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术和Westernblot技术分别检测这些局部微环境因素作用下的HepG2细胞内多药耐药相关基因mdr1、肺耐药相关蛋白基因（LRP）、多药耐药相关蛋白基因（MRP1）和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的mRNA和蛋白水平的表达。同时运用免疫细胞化学技术检测肝癌耐药细胞株中HIF-1α蛋白的表达。以及检测转染了HIF-1α质粒的HepG2细胞中上述相关多药耐药基因的表达。结果在缺氧、低糖环境下生长或稳定整合了HBX基因的HepG2细胞均不同程度地高表达多药耐药相关基因和HIF-1α；在肝癌耐药细胞株中HIF-1α蛋白高表达；稳定转染了HIF-1α质粒的HepG2细胞显著高表达多药耐药相关基因。结论肝癌生长的微环境可通过核转录因子HIF-1α调控多药耐药相关基因的表达。从而诱导肝癌多药耐药表型的形成；HIF-1α有望成为逆转肝癌耐药的新的分子靶点。     

HBX基因对人肝癌细胞系HepG2中HNF-4α及NF-κB表达的影响

目的通过检测转染X基因HepG2人肝癌细胞脂质体中NF-4α及NF-κB的表达,探讨X基因与HNF-4α,NF-κB及肝癌细胞的关系。方法将Hep G2成人肝癌细胞分成三组:将HBx真核表达载体pc DNA3/HBx转入Hep G2细胞做为实验组;以转染空载体细胞组和未转染Hep G2细胞组作为对照组。PCR检测各组X基因、HNF-4α及NF-κB的核内RNA表达情况,Western Blot检测NF-κB核内蛋白的表达情况。结果转染HBx细胞组中HNF-4α的表达值低于另两组,而NF-κB表达值高于另两组。同组中,HNF-4α的表达值与NF-κB表达值呈负相关。结论成功将X基因转染入Hep G2细胞,并在细胞中表达,转染HBx基因可通过X蛋白抑制HNF-4α的表达而增强NF-κB的活性,促进肝癌细胞增殖致其癌变及生长转移等方面加速。     

缺氧诱导因子1α在肝癌细胞上皮-间充质化中的作用

目的:探讨缺氧诱导因子1 α(HIF-1 α)在肝癌上皮-间充质化(EMT)中的作用.方法:采用可调控HIF-1 α表达的肝癌HepG2Tet-on-HIF-1α细胞系,首先用real-time PCR与Western blot方法检测低氧环境中HepG2Tet-on-HIF-1α细胞EMT相关分子(E-cadherin,vimentin,FSP-1)及HIF-1 α的mRNA和蛋白表达水平,然后在常氧环境下,采用强力霉素(Dox)诱导HepG2Tet-on-HIF-1α细胞HIF-1 α过表达,以及HepG2Tet-on-HIF-1α细胞经Dox处理后再转染HIF-1αsiRNA,观察上述分子的表达情况.结果:低氧处理后,HepG2Tet-on-HIF-1α细胞EMT相关分子及HIF-1 α的mRNA和蛋白表达水平较常氧状态下均明显增加(均P＜0.05);常氧环境下,Dox能诱导HepG2Tet-on-HIF-1α细胞HIF-1 α过表达,同时明显增加EMT相关分子的mRNA和蛋白表达水平(均P＜0.05),但转染HIF-1αsiRNA后,Dox的诱导作用被取消.结论:HIF-1α促进HepG2细胞EMT,并可能是肝癌基因治疗的有效靶点.     

急性低氧和低氧"习服"对人肝肿瘤细胞内血管内皮细胞生长因子和低氧诱导因子基因表达和蛋白含量的影响

目的观察急性低氧和低氧"习服"时,人肝肿瘤(HepG2)细胞内血管内皮生长因子(VEGF)和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因表达和蛋白含量的变化.方法细胞到达低氧"习服"状态后,用Northern杂交和Western杂交检测细胞内VEGF和HIF-1α基因表达以及蛋白含量的变化.结果急性低氧能够诱导VEGF、HIF-1基因表达和胞内蛋白含量升高;而低氧"习服"后再连续低氧48h,细胞内VEGF与HIF-1α的mRNA和蛋白含量都恢复到与对照相近的水平.结论HepG2细胞达到低氧"习服"状态后,耐低氧的能力明显增强,减轻或抑制急性低氧对VEGF基因表达的促进作用,其中HIF-1α可能起着重要的调节作用.     

HIF-1α基因沉默对人肝癌SMMC-7721细胞VEGF和MMP-2基因表达的影响

目的探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因沉默对人肝癌SMMC-7721细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)基因表达的影响。方法构建HIF-1α基因的RNA干扰(RNAi)表达载体(HIF-1α-shRNA-pGenesil-1)和阴性对照载体(shRNA-HK-pGenesil-1),并将其与质粒结合。将人肝癌SMMC-7721细胞分为沉默组、阴性对照组和空白对照组,分别转染HIF-1α-shRNA-pGenesil-1重组载体、shRNA-HK-pGenesil-1重组载体和空载体pGenesil-1。转染细胞经浓度为500μg/mL的G418溶液筛选后获得带有转染重组载体的细胞克隆,分别于常氧、低氧6 h、低氧12 h及低氧24 h条件下培养,再采用实时定量逆转录聚合链式反应(RT-PCR)检测细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达。结果常氧条件下,沉默组、阴性对照组和空白对照组细胞中均无HIF-1α mRNA的表达,且3组细胞中VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平比较差异均无统计学意义(P0.05)。低氧培养6、12及24 h时,沉默组细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平均低于同时点空白对照组和阴性对照组(P0.05),但同时点空白对照组和阴性对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。与常氧条件对应组别比较,沉默组、阴性对照组和空白对照组各低氧条件组细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平均较高(P0.05);低氧条件下,3组细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平均呈下降趋势,同组内3个时点间两两比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论利用RNAi技术有效沉默人肝癌SMMC-7721细胞中HIF-1α基因的表达后,VEGF mRNA和MMP-2 mRNA的表达水平均降低,提示沉默HIF-1α基因可抑制原发性肝癌的浸润和转移。     

缺氧诱导因子1a依赖性缺氧诱导人肝癌细胞多药耐药相关基因的表达及意义

目的探讨缺氧环境下人肝癌细胞中多药耐药相关基因和缺氧诱导因子1a(HIF-1a)的表达和意义，从而部分阐明肝细胞癌发生多药耐药的机制，为逆转肝癌耐药提供新的分子靶点。方法将人肝癌细胞系HepG2细胞分别行不同时间低氧培养和转染HIF-1a/PCDNA3质粒；应用荧光定量聚合酶链反应技术和蛋白免疫印迹技术分别检测每组HepG2细胞中多药耐药相关基因(mdr1)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)和肺耐药相关蛋白(LRP)在mRNA和蛋白水平的表达。结果在缺氧组，随着缺氧时间的延长HepG2细胞中多药耐药相关基因mdr1、MRP1和LRP的表达均逐渐增高，且以MRP1变化更为显著；而且这些多药耐药相关基因的表达升高与缺氧诱导因子-1a的表达呈同步化改变。在HIF-1a/PCDNA3质粒转染细胞中这些多药耐药相关基因的表达亦明显升高。结论缺氧可通过核转录因子HIF-1a上调肝癌细胞内mdr1，LRP、MRP1等多药耐药相关基因的表达，从而使肝细胞癌获得多药耐药性。生长局部微环境的缺氧是诱导肝癌产生多药耐药性的重要原因之一。核转录因子HIF-1a和这些多药耐药相关基因将可能成为逆转肝癌耐药的新的分子靶点。     

乏氧环境下HIF-1α对肝癌细胞逆向分化影响的实验研究

目的探讨体外乏氧环境下低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)对诱导肝癌细胞逆向分化为肝癌干细胞并维持恶性生物学行为的影响。方法采用免疫磁珠分选出HepG2细胞中的CD133阴性细胞,分为2个大组:转染组转染siRNA-HIF-1α以沉默HIF-1α基因的表达,空白对照组不转染任何siRNA片段。2类细胞分别进行常氧及乏氧条件培养,本实验共分4组。采用MTT、克隆形成实验及Transwell小室实验检测细胞的增殖和侵袭能力,采用Western blot法及RT-PCR法检测细胞中HIF-1α、CD133、CD90及CD44的mRNA及其蛋白的表达。结果 MTT实验结果显示:4组细胞的增殖率随乏氧培养时间延长而增高;24 h及以后,与空白对照组相比,经siRNA-HIF-1α转染后,转染常氧组和乏氧组的细胞增殖率降低(P0.05)。平板克隆实验结果显示:转染常氧组与转染乏氧组、空白对照常氧组与空白对照乏氧组比较其细胞形成克隆数的差异均有统计学意义(P0.05)。Transwell小室实验结果显示:乏氧培养后,转染组与空白对照组相比,迁移至下室的细胞数目减少(P0.05)。Western blot及RT-PCR结果显示:空白对照乏氧组中HIF-1α及肿瘤干细胞标志物(CD133、CD90、CD44)蛋白及其mRNA的表达水平均高于其余3组(P0.05);经siRNA-HIF-1α转染后,转染乏氧组中HIF-1α及肿瘤干细胞标志物(CD133、CD90、CD44)蛋白及mRNA的表达水平均较转染常氧组和空白对照常氧组降低(P0.05)。结论在乏氧环境下,低氧诱导因子HIF-1α可促进肝癌细胞逆向分化为肝癌干细胞并增强其恶性生物学行为。     

受体作用蛋白在肝癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导凋亡耐受中的作用

目的 观察受体作用蛋白(RIP)基因的表达变化在肝癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导凋亡耐受中的作用.方法 以肝癌细胞HepG2、Hep3B为研究对象,制备RIP siRNA的细胞模型,应用流式细胞仪分析两种细胞模型对TRAIL作用后细胞周期的变化,Western blot检测其在RIP基因沉默前后凋亡信号传导蛋白Caspase-8、Caspase-3、DFF-45的表达变化.结果 转染RIP siRNA后,细胞恢复了对TRAIL诱导凋亡的敏感性,当TRAIL浓度为100 μg/L时,HepG2及Hep3B转染组的细胞生存率为(60.02±5.23)％和(50.78±3.76)％,显著低于对照组的(96.44±5.43)％和(101.85±6.41)％(P＜0.01);细胞生存周期SubG1期为(76.89±6.68)％和(72.45±7.31)％,显著高于对照组的(0.78±0.07)％和(3.62±0.38)％(P＜0.01).转染组TRAIL单独作用,可以引起HepG2 siRNA及Hep3B siRNA凋亡传导通路上传导蛋白Caspase-8、Caspase-3的裂解.结论 肝癌细胞对TRAI诱导凋亡的耐受可能与其传导通路上RIP蛋白的表达相关,抑制其表达可以导致凋亡传导蛋白Caspase-8、Caspase-3的裂解,促使凋亡的发生,恢复肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性.     

结直肠癌中缺氧诱导因子-1α与Survivin表达的关系

目的 探讨结肠癌LS174T细胞及结直肠腺癌组织中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达及与Survivin的关系.方法 构建靶向HIF-1α的质粒pSilence-2.1-U6-siRNA并鉴定,采用阳离子脂质体转染法将其转染LS174T细胞,低氧培养24h,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测siRNA对HIF-1α的抑制作用.Western blot检测Survivin蛋白表达.应用免疫组织化学方法检测69例人结直肠腺癌组织中HIF-1α、Survivin蛋白的表达.结果 LS174T细胞转染靶向HIF-1α的siRNA表达载体后,HIF-1α、Survivin表达显著下降.69例结直肠腺癌组织中,HIF-1α、Survivin蛋白的阳性表达率为66.7％ (46/69)和56.5％ (39/69).腺癌组HIF-1α蛋白阳性表达率显著高于腺瘤组(P＜0.01).Ⅲ期腺癌HIF-1α蛋白表达显著高于Ⅰ～Ⅱ患者(P＜0.05).结直肠腺癌中HIF-1α表达与Survivin显著正相关.结论 结直肠腺癌发展过程中HIF-1α与Survivin表达密切相关.     

肝癌组织中PD-L1和HIF-1α的相关性研究

目的:探讨细胞程序化死亡-配体1(PD-L1)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在肝癌组织中的相关性,研究缺氧信号通路阻断剂YC-1对肝癌细胞中的PD-L1表达的影响。方法:采用免疫组化染色法检测90例肝癌组织中PD-L1和HIF-1α的表达,分析两者之间的相关性。将肝癌细胞Huh7和Hep3B细胞分别置于乏氧培养箱中,对照组加入DMSO,实验组加入50μmol/L的YC-1,作用48 h后分别提取总RNA和蛋白。用Real-time PCR和Western blot分别检测两组细胞中PD-L1的表达水平。结果:PD-L1和HIF-1α的表达在肝癌组织中呈正相关,阻断缺氧信号通路后PD-L1的表达下调。结论:HIF-1α信号通路激活是导致肝癌组织中PD-L1表达升高的原因之一,加以阻断可以抑制PD-L1的表达。     

缺氧诱导因子-1α对HepG2细胞生长的影响及其初步机制

目的观察缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对HepG2细胞生长及凋亡相关蛋白的影响,并探讨其意义。方法将H1F-1α转染入人肝癌细胞HepG2中,观察HepG2细胞生长。建立人肝癌裸鼠模型,随机将其分为两组：对照组(A组,10只),HIF-1α转染细胞组(B组,10只)。1个月后,切除瘤灶、称瘤重、计算促瘤率。标本用Western blot检测HIF-1α、凋亡相关蛋白Survivin、bcl-2和Caspase-3的表达。结果HIF-1α转染HepG2细胞后,细胞生长速率加快。转染HIF-α的裸鼠肿瘤生长较对照组快,A组、B组的瘤重分别为(3．51±0．33)、(4．64±0．40)g,促瘤率为32%。B组HIF-1α、Survivin和bcl-2的蛋白水平明显高于A组,但Caspase-3的水平则低于A组。结论转染HIF-1α体内、外均可促进肝癌HepG2细胞的生长,其机制除促进血管生成外,还可能与其能抑制凋亡有关。     

结直肠癌中缺氧诱导因子1-α与FasL 表达相关性的研允

目的 探讨结直肠癌侵袭转移过程中缺氧诱导因子1-α(alpha,HIF-1α)与FasL表达的相关性.方法 采用分子克隆方法,将我室已构建的FasL-pcD-NA3.1(+)质粒与pcDNA3.1(一)质粒进行重组,得到新的FasL-pcDNA3.1(一)质粒并加以鉴定;通过脂质体转染法将空质粒、FasL-pcDNA3.1(+)与FasL-pcDNA3.1(一)质粒分别转染人直肠癌HR-8348细胞,构建侵袭力不同的结直肠癌细胞HR-8348L、HR一8348F和HR一8348As,未转染细胞HR一8348B为空白对照,应用Tran-swell,小室检测各组细胞的侵袭能力;采用化学缺氧法构建四组细胞的缺氧模型,Western blot方法定量检测缺氧0h、6h、12h及24h各组细胞内HIF-1α的表达.结果 FasL-pcDNA3.1(一)质粒符合要求,FasL片段大小约900bp,测序结果正确率99.2%;单层细胞体外侵袭实验见HR一8348F细胞穿透Transwell滤膜的细胞数目为(12.930±2.434),显著多于HR-8348B(8.133±1.959)、HR-8348L(7.670±2.093)和HR-8348As(7.870±1.685)细胞(P<0.05);Western blot检测示HIF-1α蛋白于120kD处显色,缺氧0h与6h,各组样品中HIF-α仅表达微量,HIF-1α水平无显著性差异(P>0.05);缺氧12h与24h,HR一8348F细胞内HIF-1α水平较0h和6h时明显增高(P<0.05),而HR-8348B、HR-8348L及HR-8348As细胞内HIF-1α表达与6h时无明显变化(P>0.05),HR-8348F细胞HIF-1α水平显著高于HR-8348B、HR-8348L及HR-8348As细胞(P<0.01).结论 缺氧环境中结直肠癌细胞FasL表达增强是除低氧分压外另一个诱导HIF-1α表达增高的因素,FasL与 HIF-1α水平呈正相关,高侵袭能力的结直肠癌细胞对缺氧的适应能力加强,促进肿瘤的远处转移.     

缺氧诱导因子1α依赖性缺氧诱导人肝癌细胞多药耐药相关基因的表达及意义

目的探讨缺氧环境下人肝癌细胞中多药耐药相关基因和缺氧诱导因子1α(HIF1α)的表达和意义,从而部分阐明肝细胞癌发生多药耐药的机制,为逆转肝癌耐药提供新的分子靶点。方法将人肝癌细胞系HepG2细胞分别行不同时间低氧培养和转染HIF1α/PCDNA3质粒;应用荧光定量聚合酶链反应技术和蛋白免疫印迹技术分别检测每组HepG2细胞中多药耐药相关基因(mdr1)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)和肺耐药相关蛋白(LRP)在mRNA和蛋白水平的表达。结果在缺氧组,随着缺氧时间的延长HepG2细胞中多药耐药相关基因mdr1、MRP1和LRP的表达均逐渐增高,且以MRP1变化更为显著;而且这些多药耐药相关基因的表达升高与缺氧诱导因子1α的表达呈同步化改变。在HIF1α/PCDNA3质粒转染细胞中这些多药耐药相关基因的表达亦明显升高。结论缺氧可通过核转录因子HIF1α上调肝癌细胞内mdr1,LRP、MRP1等多药耐药相关基因的表达,从而使肝细胞癌获得多药耐药性。生长局部微环境的缺氧是诱导肝癌产生多药耐药性的重要原因之一。核转录因子HIF1α和这些多药耐药相关基因将可能成为逆转肝癌耐药的新的分子靶点。     

乙型肝炎病毒X蛋白上调肝癌多药耐药相关基因表达的研究

目的　研究乙型肝炎病毒 X蛋白 (HBX)对肝癌耐药相关基因 MDRI,MRP1 ,MRP2 3,MRP3,L RP的影响从而探讨 HBX基因影响肝癌多药耐药性状的分子机制。方法　应用脂质体介导技术对人肝癌细胞株 Hep G2瞬时转染 HBX基因 ,然后用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)和 Westernblot技术分别检测转染后多药耐药相关基因和蛋白水平的表达情况。再使用 MTT检测阿霉素及丝裂霉素诱导后细胞存活率的变化。结果　转染前后相比 ,转染 HBX基因的 Hep G2细胞多药耐药相关基因和蛋白表达水平比转染前均明显上调 (P<0 .0 5 )转染后 PRP1基因表达量与转染前比为 3.1 1 ,PRP2为 1 .6 9,L RP3为 1 .4 6 ,MDR1为 3.6 4 ,L RP为 1 .90。 Westernblot显示转染后 L DR1蛋白水平上升 1 .1 0倍 ,MRP1蛋白上升 1 .2 8倍 ,L RP蛋白上升 1 .0 8倍。MTT结果显示阿霉素和丝裂霉素 IC50 转染组明显高于对照组。结论　乙型肝炎病毒 X蛋白可能促进肝癌多药耐药的产生     

HIF-2α对PDCD5的调节及其对肝癌细胞凋亡影响的研究

目的研究缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)在肝癌组织中的表达,探讨其对凋亡蛋白PDCD5及肝癌细胞凋亡的影响。方法采用免疫组织化学染色法检测60例原发性肝癌及癌旁组织中HIF-2α的表达,分析HIF-2α的表达同肝癌临床参数的关系。MTT法检测肝癌细胞的增殖能力,Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡。Real-time PCR检测基因表达水平。Western Blot检测蛋白表达水平。结果 HIF-2α在肝癌组织中的表达明显低于其在癌旁组织中的表达,且HIF-2α的异常表达和肝癌的大小呈负相关(P0.05)。转染HIF-2α表达质粒后肝癌细胞中PDCD5表达水平升高(P0.05),肝癌细胞凋亡增加,干扰HIF-2α表达后肝癌细胞中PDCD5表达水平降低(P0.05),肝癌细胞凋亡减少。转染PDCD5表达载体后肝癌细胞凋亡增加。结论 HIF-2α在肝癌的低表达异常可能是肝癌发生、发展的推动因素之一;HIF-2α可通过上调PDCD5的表达促进肝癌细胞产生凋亡。     

肾癌ACHN细胞HIF-1α基因siRNA真核表达质粒的构建与筛选

目的采用RNA干扰方法,构建及筛选对肾透明细胞癌ACHN细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因有干扰沉默作用的真核表达质粒。方法 CoCl2缺氧诱导培养ACHN细胞高表达HIF-1α,设计并化学合成4条针对HIF-1α基因的小干扰RNA（siRNA）序列,构建相应真核表达质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2/3/4,经测序分析,质粒构建成功后,分别转染ACHN细胞后培养24h,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计算转染效率,采用荧光实时定量PCR（real time-PCR）和免疫印记杂交法（Western blot）分别检测HIF-1α的mRNA与蛋白表达水平。结果质粒构建后经测序显示与设计完全一致;荧光显微镜下观察到ACHN细胞表达绿色荧光蛋白,证实重组质粒已转入细胞,转染效率约为78%;实时定量PCR与Western blot结果显示,siRNA-1/2组HIF-1α的mRNA与蛋白表达较对照组均明显下降（P〈0.05）,质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2明显干扰抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达,其中以质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1效果最佳。结论本实验成功构建靶向HIF-1α基因的真核表达质粒,并筛选出能有效抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达的质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2,这为肾癌的基因治疗提供了新的方法和手段。     

RNA干扰抑制缺氧诱导因子1α表达对缺氧内皮细胞通透性的影响

目的 了解RNA干扰技术特异性抑制缺氧诱导因子1α(HIF-1α)表达对缺氧血管内皮细胞通透性的影响.方法 利用质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR构建针对人HIF-1α基因的RNA干扰表达载体.将VE细胞分为正常对照组、缺氧组(置于含体积分数1%O_2的混合气体环境中缺氧处理6 h)、转染组、转染缺氧组(转染载体后再进行缺氧处理).采用RT-PCR法检测正常对照组、转染组HIF-1αmRNA表达,采用蛋白质印迹法检测4组细胞HIF-1α蛋白表达.荧光分光光度计检测单层VE细胞的通透性.将上述缺氧处理替换为HIF-1α特异性诱导剂1 mmol/L二甲氧乙二酰甘氨酸(DMOG),分为DMOG组、转染DMOG组、正常对照组、转染组,采用蛋白质印迹法观察各组HIF-1α蛋白表达.除通透性检测数据用荧光强度值表示外,其他数据用密度比值表示.实验结果进行组间两两t检验.结果 正常对照组细胞HIF-1α mRNA相对含量为0.765±0.069,转染组细胞HIF-1α mRNA相对含量为0.093±0.007,组间比较,差异有统计学意义(t=16.696,P<0.05).转染缺氧组细胞HIF-1α蛋白含量为0.591±0.029,显著低于缺氧组(2.612±0.259,t=13.415,P<0.05);转染DMOG组HIF-1α蛋白含量为0.566±0.008,显著低于DMOG组(3.243±0.551,t=6.975,P<0.05).缺氧组单层血管内皮细胞通透性(41.6±11.1)较正常对照组(9.4±1.5)显著升高(t=6.238,P<0.05),转染缺氧组单层血管内皮细胞通透性(13.3±4.5)显著低于缺氧组(t=5.430,P<0.05).结论 采用特异性针对HIF-1α基因的RNA干扰技术,能有效抑制内皮细胞HIF-1α表达,并明显抑制缺氧引起的血管内皮细胞通透性增强.     

奥沙利铂对不同p53状态肝癌细胞中DNA损伤修复基因GADD45β的诱导差异及调控机制

目的 探索奥沙利铂对不同p53状态肝癌细胞的DNA损伤修复基因(GADD45β)诱导差异及可能调控机制.方法 转染p53全序列建立Hep3B+p53.体外合成GADD45β近端启动子序列群(-618至-314),构建荧光素表达质粒,转染肝癌细胞株HepG2、Hep3B和Hep3B+p53.以实时荧光定量PCR比较奥沙利铂对GADD45β表达诱导及其近端启动子活性影响差异;比较对DNA合成和细胞克隆形成能力抑制差异;通过Caspase-3的表达变化测定凋亡的发生和发展.结果 奥沙利铂对Hep3B中GADD45β诱导并不明显.转染p53全基因序列后,Hep3B+p53对奥沙利铂的敏感性明显增加,并呈现出剂量-效应的正相关关系.荧光素分析提示奥沙利铂作用Hep3B+p53后的启动子NF-κB(-618/+6)和E2F-1(-470/+6)活性较Hep3B明显增强约1.5倍和0.8倍.奥沙利铂能够更加明显地抑制Hep3B+p53的DNA合成能力和细胞克隆形成能力,100 μmol/L奥沙利铂作用后Hep3B+p53DNA合成率为30.41％,对细胞克隆形成能力的抑制率则达到75.60％,与Hep3B相比差异显著.奥沙利铂作用后Hep3B+p53的Caspase-3能够迅速地启动凋亡的发生和发展.结论 p53对铂类化疗药物对肝癌细胞的GADD45β诱导具有重要作用,增强转录调节因子的表达水平是其可能的作用机制.