使用人骨钙素启动子实现在体研究成骨细胞特定基因的功能

目的:使用骨钙素启动子构建骨组织特异性小发卡状RNA表达载体。方法:实验于2003-11/2004-09在解放军第四军医大学全军骨科研究所和全军整形外科中心完成。以HEK293细胞基因组为模板,利用聚合酶链反应扩增人骨钙素启动子。将骨钙素启动子、针对虫荧光素酶的小发卡状RNA编码序列和多腺苷酸信号依次克隆至pGL3-control载体的相应酶切位点,经双酶切鉴定和DNA测序证实后命名为pGL3-OCP-shLuc。将pGL3-OCP-shLuc与pGL3-control分别共转染人胚胎肾细胞HEK293和人骨肉瘤细胞MG-63,48h后测定虫荧光素酶活性,计算相对活性。结果:使用特异性引物成功扩增出长度为830bp的人骨钙素启动子聚合酶链反应产物。DNA测序结果证实pGL3-OCP-shLuc中的小发卡状RNA表达框与设计完全一致。pGL3-OCP-shLuc与pGL3-control共转染HEK293细胞后,虫荧光素酶相对活性与对照组相比没有明显差异,而共转染MG-63细胞后虫荧光素酶相对活性显著降低,剔出效率约为69.8%。结论:成功使用人骨钙素启动子构建了小发卡状RNA表达载体,并实现了骨组织特异性RNA干扰,为将RNA干扰技术引入骨肉瘤基因治疗领域奠定了基础。     

FLT3基因3＇-非翻译区-荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定

为分析FMS样酪氨酸激酶3（FMS—like tyrosine kinase3,FLT3）基因3i非翻译区（3’untranslated region,3’-UTR）可能的微小RNA（miRNA）调控位点,构建FLT3基因3’-UTR-荧光素酶报告载体,与miRNA共转染293T细胞,分析miRNA对其调控作用。采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增FLT3基因3,-UTR区序列,插入经PstI和EcoRI双酶切的经过改造的荧光素酶报告载体pGL3-control（pGL3-control—ITI）;通过Target Scan5．1软件预测可能与FLT3基因3’-UTR作用的miRNA;采用FuGENEHD转染试剂包裹荧光素酶报告重组子和miRNA真核表达载体共转染293T细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。结果表明,成功构建了含有804bp的FLT3基因3’-UTR序列的荧光素酶报告重组子,通过酶切和基因测序的方法鉴定正确;miRNA靶位点预测显示,FLT3基因3’-UTR可能是miRNA-15a、miRNA-15b、miRNA-16、miRNA-195、miRNA-424、miRNA-497的作用靶点;与对照组相比,miRNA-15a、15b、195可使荧光素酶报告重组子的荧光素酶活性降低20％左右。结论：成功构建了FLT3基因3’-UTR-荧光素酶报告载体,而miRNA-15a、miRNA-15b、miRNA-195可抑制其荧光素酶活性。     

小鼠adam10基因启动子克隆和双荧光素酶报告基因系统构建及鉴定

本研究旨在克隆小鼠adam10基因启动子,构建以adam10基因启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统并分析其活性,为研究adam10基因转录调控提供有效工具。以BALB/c小鼠脑组织为模板,采用PCR方法克隆小鼠adam10基因启动子序列至pCR-Blunt载体,酶切后连接至荧光素酶报告质粒pGL4.10启动子区域,构建重组荧光素酶报告质粒pGL4.10-adam10,采用阳离子脂质体法与阳性对照质粒pGL4.74共转染真核细胞293FT,以离子霉素刺激为刺激组、DMSO为未加干预组,同时以不含启动子的pGL4.10与阳性对照质粒pGL4.74共转染组为阴性对照组,化学发光仪检测荧光强度及比例。结果表明,酶切及测序验证克隆的adam10启动子序列正确且无突变,构建的重组荧光素酶报告质粒pGL4.10-adam10与阳性对照质粒pGL4.74载体成功共转染293FT细胞,pGL4.10-adam10转染细胞后具有转录活性。离子霉素刺激组活性明显高于DMSO组,荧光比值约为DMSO组2倍(P<0.05),阴性对照组不具备转录活性。结论:成功克隆了adam10启动子并构建了重组荧光素酶报告质粒pGL4.10-adam10,离子霉素可增强adam10基因启动子转录活性。     

人骨碱性磷酸酶基因启动子的克隆及高水平尿酸对其活性影响的实验研究

目的克隆人骨碱性磷酸酶(BALP)基因的启动子序列并构建荧光素酶报告基因重组质粒,初步探索高水平尿酸(UA)对BALP基因启动子活性是否产生影响。方法首先用聚合酶链反应扩增目的基因5′端侧翼上游627bp(距转录起始位点-473bp至154bp)的片段,纯化扩增产物后行双酶切,后亚克隆至pGL3-basic质粒,构建BALP基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒。通过质粒转染到HEK293细胞内,最后借助双荧光素酶报告基因活性检测的方法,比较3种UA水平条件下(0.0、0.2和0.4mmol/L)对基因启动子活性的影响。结果通过双酶切电泳、基因组测序比对分析,成功构建了BALP启动子荧光素酶报告基因重组质粒。随着UA水平的升高,HEK293细胞中启动子重组质粒的相对荧光素酶活性明显降低,差异有统计学差异(P0.05)。结论高水平UA能够抑制BALP基因启动子的活性。     

应用Gibson Assembly法快速构建人组蛋白甲基化转移酶启动子荧光素酶报告载体

目的:快速构建人组蛋白甲基转移酶(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)启动子荧光素酶报告载体并验证其活性。方法:因EZH2启动子富含GC,故应用Gibson Assembly方法设计分两段扩增,然后将片段一步法连入pGL3-Basic质粒,构建荧光素酶报告载体,进行酶切鉴定。与p RL-TK内参照质粒共转染C4-2细胞,双荧光素酶分析法检测启动子的活性。结果:经酶切鉴定证实成功构建了EZH2启动子报告载体,双荧光索酶报告基因检测结果显示构建的报告载体具有启动子活性。结论:快速成功构建了具有启动子活性的EZH2启动子荧光素酶报告载体,为进一步研究前列腺癌中EZH2表达调控机制提供必要的实验材料。     

转录因子E2F1调控KIR3DL1基因表达的分子机制

目的 研究转录因子E2F1对KIR3DL1基因启动子转录活性的影响,明确其调控KIR3DL1基因表达的分子机制.方法 采用PCR方法 从K562细胞基因组DNA中扩增突变型KIR3DL1基因启动子序列,将产物连接到pGL3-Basic荧光素酶载体,构建报告重组子;采用染色质免疫共沉淀方法 检测E2F1与KIR3DL1启动子在细胞内的结合;采用阳离子脂质体SuperFect包裹突变型和野生型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子,然后转染K562细胞,染色质免疫共沉淀方法 检测E2F1与重组子在细胞内的结合,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性;将E2F1真核表达载体与野生型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子共转染K562细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性.结果 成功构建突变型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子,测序证实,在K562细胞KIR3DL1启动子区1个潜在的转录因子E2F1结合位点有1个自然发生的点突变(TTTGGCGC→TTCGGCGC);E2F1完全不能与K562细胞中突变型KIR3DL1启动子结合,但能与NK-92MI细胞中没有突变的野生型KIR3DL1启动子结合;突变型KIR3DL1启动子.荧光素酶报告重组子保留了部分与E2F1的结合能力,但其相对荧光素酶活性较野生型降低了50%;共转染E2F1真核表达载体使野生型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子的相对荧光素酶活性增加为对照组的2倍以上.结论 转录因子E2F1参与调控KIR3DL1基因转录激活,E2F1结合位点上CpG二核苷酸的数量和甲基化模式可能影响转录因子E2F1与靶序列的结合.     

脂质体载体法转染FPRL1基因到HEK293细胞及其鉴定

目的验证脂质体载体法将FPRL1基因有效转染到HEK293细胞.方法G418筛选,RT-PCR和趋化试验.结果用脂质体载体法将FPRL1基因转染HEK293细胞,G418筛选,3周形成集落状细胞克隆;RT-PCR以FPRL1特异性引物扩增,凝胶电泳可见1条约700 bp的目的片段,对照组为阴性;趋化实验显示HEK293/FPRL1细胞在一定浓度的fMLP的刺激下有趋化活性,而HEK293细胞无反应.结论初步证实脂质体载体法能有效地将FPRL1基因导入HEK293细胞,且FPRL1在细胞中有表达.     

甲胎蛋白特异性小干扰RNA重组腺病毒载体的构建

背景:RNA干扰技术的应用,关键在于能够采用1个有效的基因转移系统将小干扰RNA转入至靶细胞,目前广泛应用的是构建小干扰RNA表达载体.目的:利用AdMax腺病毒载体系统构建表达人甲胎蛋白-小干扰RNA的腺病毒载体.设计、时间及地点:开放性实验,于2007-03/10在山东大学附属济南市中心医院中心实验室完成.材料:穿梭质粒pDC316-EGFP-U6为本元正阳基因技术公司产品;AdMax KitD试剂盒与低代数HEK293细胞为Microbix Biosystems Inc.(Canada)公司产品.方法:选择针对甲胎蛋白 mRNA的特异性小干扰RNA靶序列,设计合成为相应的双链DNA,并将其与酶切线性化的pDC316-EGFP-U6载体片段连接,构建好的穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-AFP-siRNA和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组产生重组腺病毒.主要观察指标:对重组腺病毒进行聚合酶链反应鉴定及扩增、纯化、滴度测定.结果:构建的穿梭质粒载体经聚合酶链反应鉴定和测序分析,证实与设计一致.重组腺病毒Ad-AFP-siRNA经聚合酶链反应和绿色荧光蛋白表达检测证实构建成功,测定滴度为1.4×109 nfu/L.结论:实验成功构建了Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA重组腺病毒.     

构建创伤修复相关基因p21表达载体

目的:构建创伤修复相关基因p21启动子驱动的荧光素酶报告基因表达载体,并评估其稳定性和可靠性.方法:实验于2004-06/08在第三军医大学西南医院烧伤研究所内皮细胞室完成.野生型p21基因启动子全序列经酶切亚克隆入pGL3-basic荧光素酶报告基因载体,重组载体pGL3-p21p转染ECV304细胞,并应用双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性,排除转染过程误差.结果:①目的片段克隆载体与p21基因启动子cDNA序列高度同源.②转染重组载体pGL3-p21p和E47 IPTG诱导细胞荧光素酶活性明显增强,而空载体pGL3-basic的荧光素酶表达处于基础水平,两比较差异有显性意义(P＜0.05).结论:构建的野生型p21基因启动子驱动的荧光素酶报告基因载体,转染ECV304细胞后能够表达荧光素酶蛋白,具有稳定和可靠性能.     

构建创伤修复相关基因p21表达载体

目的:构建创伤修复相关基因p21启动子驱动的荧光素酶报告基因表达载体,并评估其稳定性和可靠性.方法:实验于2004-06/08在第三军医大学西南医院烧伤研究所内皮细胞室完成.野生型p21基因启动子全序列经酶切亚克隆入pGL3-basic荧光素酶报告基因载体,重组载体pGL3-p21p转染ECV304细胞,并应用双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性,排除转染过程误差.结果:①目的片段克隆载体与p21基因启动子cDNA序列高度同源.②转染重组载体pGL3-p21p和E47 IPTG诱导细胞荧光素酶活性明显增强,而空载体pGL3-basic的荧光素酶表达处于基础水平,两者比较差异有显著性意义(P＜0.05).结论:构建的野生型p21基因启动子驱动的荧光素酶报告基因载体,转染ECV304细胞后能够表达荧光素酶蛋白,具有稳定和可靠性能.     

慢病毒荧光素酶载体介导的miRNA靶向基因筛选系统的建立及应用

本研究旨在建立miRNA靶基因高通量筛选系统,筛选出能调控p21NAs,以便试验验证及探索这些miRNA的生物学功能及意义。利用分子克隆技术构建并鉴定2个慢病毒表达载体-pWPXL-Luc及pWPXL-Luc-P21-3’UTR,分别与包装载体psPAX-2及PDM2G共转染HEK 293T细胞;包装病毒颗粒,感染HEK 293细胞,获得稳定单表达荧光素酶及共表达荧光素酶与P21-3’UTR的细胞株,前者在后续实验中作为对照;采用荧光素酶检测试剂检测pWPXL-Luc病毒感染后的293细胞的荧光素酶活性。结果表明:包装出高滴度的病毒颗粒,成功建立稳定株,且在一定范围内稳定株细胞的荧光素酶活性与细胞数目成正比。结论:成功建立了miRNA靶基因高通量筛选系统;利用本筛选系统,成功筛选出靶向细胞周期调控基因P21(CIP1/WAF1)的miRNA。     

脂质体载体法转染FPRL1基因到HEK293细胞及其鉴定

[目的]验证脂质体载体法将FPRL1基因有效转染到HEK293细胞。[方法]G418筛选，RT-PCR和趋化试验。[结果]用脂质体载体法将FPRL1基因转染HEK293细胞，G418筛选，3周形成集落状细胞克隆；RT-PCR以FPRL1特异性引物扩增，凝胶电泳可见1条约700bp的目的片段，对照组为阴性；趋化实验显示HEK293/FPRL1细胞在一定浓度的fMLP的刺激下有趋化活性，而HEK293细胞无反应。[结论]初步证实脂质体载体法能有效地将FPRL1基因导入HEK293细胞，且FPRL1在细胞中有表达。     

kir3dl1启动子表达调控载体的构建及其在K562细胞中的活性

为了分析kir3dl1基因核心启动子区域的功能并明确其表达调控机制，构建了kir3dl1基因启动子．荧光素酶报告载体，分析其在K562细胞中的活性。采用PCR方法从含有kit3dl1基因转录起始位点5’侧翼区的质粒中扩增kir3dl1基因核心启动子序列，插入经Bg1II和NcoI双酶切的荧光素酶报告载体pGL3-Basic；采用阳离子脂质体SuperFect包裹荧光素酶报告重组子转染K562细胞，应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性；采用MTT法检测脂质体-DNA复合物对细胞存活率的影响。结果表明：成功构建了含有254bp的kir3dl1基因核心启动子序列的荧光素酶报告重组子3DL1-luc254并通过酶切及基因测序方法的鉴定；荧光素酶报告重组子在K562细胞中的荧光素酶活性明显高于阴性对照，且荧光素酶活性、相对活性持续3天无明显衰减。转染了3DLl-luc254报告质粒的K562细胞存活率在76％-92％之间。结论：成功构建了kir3dl1基因启动子-荧光素酶报告载体，本研究采用的转染系统能够有效地在K562细胞中进行基因转染，kir3dl1基因核心启动子在K562细胞中具有较高活性。     

克隆并应用计算机软件分析小鼠LASS1基因启动子区的特征

目的:克隆并应用计算机分析小鼠LASS1基因启动子,为进一步研究在细胞衰老过程中LAG1基因的转录调控奠定基础。方法:实验于2006-03/07在汕头大学医学院细胞衰老实验室完成。培养EC109细胞株,预测小鼠LASS1基因启动子所在区域,用PCR技术扩增启动子区序列,构建重组质粒pGEM-T-501、pGEM-T-181、pGEM-T-26,并转化JM109感受态菌,并分别克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic及增强型绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1,酶切pGEM-T-501、181、26重组质粒及pGL3-Basic、pEGFP-1载体,制备插入片段和载体,构建重组表达质粒pGL3-501、pGL3-181和pGL3-26及pEGFP-501、pEGFP-181和pEGFP-26,转化JM109感受态菌。用脂质体介导的方法瞬时转染EC109细胞,测定荧光素酶表达活性及观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果:①在预测启动子区构建了3种荧光素酶报告基因表达体系及3种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系,分别为pGL3-501(-501bp～ 106bp)、pGL3-181(-181bp～ 106bp)、pGL3-26( 26～ 106)、pEGFP-501、pEGFP-181和pEGFP-26。②pGL3-501表达载体与pGL3-181表达载体荧光素酶表达活性相近,pGL3-26表达载体荧光素酶表达活性极低,与阴性对照活性相近, 26bp～ 106bp无启动子活性。绿色荧光蛋白的表达情况也类似,pEGFP-501和pEGFP-181有明显的绿色荧光蛋白表达,pEGFP-26和空载体pEGFP-1无表达活性。结论:-181bp～ 26bp区域含有小鼠LASS1基因转录所必需的基本启动子序列。其中2个SP1保守序列是小鼠LASS1基因启动子所必需的。     

体外构建血管内皮生长因子短发夹状RNA表达载体及其对人骨肉瘤细胞相应因子mRNA及蛋白的抑制

目的:设计并构建血管内皮生长因子短发夹状RNA表达载体,检测其对人骨肉瘤细胞血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达的影响。方法:实验于2006-01/07在青岛市市立医院试验中心完成。人骨肉瘤细胞系MG-63购自武汉大学生命科学院;pSilence2.1-neo载体带有U6启动子和neo基因(Ambin公司)。①以人血管内皮生长因子的mRNA序列5’-GATAACGCGGATACCTTGG-3’为靶点,体外构建血管内皮生长因子短发夹状RNA表达载体pSilence2.1-neo-VEGF。②人骨肉瘤细胞MG-63常规培养,消化传代后分为3组:短发夹状RNA载体组转染pSilence2.1-neo-VEGF载体,空载体组转染pSilence2.1-neo载体,空白组无特殊处理。③转染后48h收集各组细胞,采用RT-PCR检测血管内皮生长因子mRNA的表达,免疫组化法检测血管内皮生长因子蛋白的表达。结果:①各组细胞血管内皮生长因子mRNA的表达情况:短发夹状RNA载体组VEGF165mRNA的相对含量显著低于空白组、空载体组(0.181±0.010,1.064±0.019,1.052±0.036,P<0.01),而空白组和空载体组之间差异无显著性意义。②各组细胞血管内皮生长因子蛋白的表达:空白组、空载体组多数细胞中出现明显的棕黄色颗粒状细胞质着色,而短发夹状RNA载体组细胞着色较淡。短发夹状RNA载体组的阳性细胞率显著低于空白组、空载体组[(20.12±2.63)%,(92.45±7.56)%,(91.76±5.26)%,P<0.01],而空白组和空载体组之间差异无显著性意义。结论:pSilence2.1-neo-VEGF可显著抑制人骨肉瘤细胞MG-63血管内皮生长因子mRNA及蛋白的表达,为靶向血管的骨肉瘤基因治疗提供了参考依据。     

Fra-1在乳腺癌细胞中高表达原因及其启动子高转录活性的分子机制研究

目的探讨Fra-1在乳腺癌细胞中高表达原因,以及Fra-1启动子高转录活性的分子机制。方法选取2株人乳腺癌细胞株MDA231和MCF-7、1株人脐静脉内皮细胞株ECV304进行研究。采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应法和蛋白质印迹法分别检测Fra-1mRNA和蛋白的表达情况;构建Fra-1双荧光报告载体,检测Fra-1启动子转录活性;构建Fra-1启动子短截报告载体及相关位点的突变型报告载体,检测短截报告载体及突变型载体转录活性;通过凝胶迁移阻滞试验观察生物素标记的特异性探针与活化因子蛋白-1(AP1)结合情况。结果乳腺癌细胞株MDA231和MCF-7中,Fra-1的mRNA和蛋白的相对表达量及其启动子全长报告载体转录活性均高于人脐静脉内皮细胞株ECV304,差异有统计学意义(P0.05);在构建的一系列Fra-1启动子短截报告载体中,只有pGL3B-256活性明显下降,差异有统计学意义(P0.05);AP1突变型报告载体pGL3B-M2、特异性蛋白1及AP1双突变报告载体pGL3B-M3活性明显低于野生型报告载体pGL3B-M1,差异有统计学意义(P0.05);凝胶迁移阻滞试验观察到生物素标记的特异性探针与AP1结合发生了明显的阻滞效应。结论在体外培养的乳腺癌细胞株MDA231和MCF-7中,反式作用因子AP1通过激活Fra-1基因启动子上调其表达。     

异丙酚对脂多糖诱导肺泡巨噬细胞高迁移率族蛋白B1启动子转录活性的影响

目的 探讨异丙酚对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导肺泡巨噬细胞(alveolar maerophages,AM)高迁移率族蛋白B1(high mobility group box l protein,HMGB1)启动子转录激活的影响.方法 以基因重组技术将HMGB1启动子克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGl3-Basic,得到重组质粒pGL3-HMGB1P,采用脂质体介导的转染技术将质粒转染AM细胞.根据转染质粒和施加刺激的不同分为以下各组:未转染组;转染pGL3-Basic组;转染pGL3-HMGB1P组;转染pGL3-HMGB1P+LPS(100 mg/L)刺激组;转染pGL3-HMGB1P+LPS(100 mg/L)+异丙酚(5 mg/L)处理组.通过检测荧光素酶活性米观察启动子活性变化,分别采用Western blot和RT-PCR方法检测细胞HMGB1蛋白和mRNA的表达.应用单因素方差分析进行不同组别问的比较.结果 酶切和测序结果证实重组体pGL3-HMGB1P构建止确,荧光素酶活性检测显永pGL3-HMGB1P在AM细胞中有效表达.与转染pGL3-HMGB1P组比较,转染pGL3-HMGB1P+LPS刺激组HMGB1启动子的转录活性(423±27),HMGB1蛋白(0.49±0.03)和mRNA(0.48±0.04)的表达均显著增加(P＜0.05);与转染pGL3-HMGB1P+LPS刺激组比较,转染pGL3-HMGB1P+LPS+异丙酚处理组HMGB1启动子的转录活性(207±13),HMGB1蛋白(0.17±0.02)和mRNA(0.13±0.02)的表达均显著降低(P＜0.05).结论 异丙酚在转录水平通过抑制LPS诱导HMGB1启动子的转录激活而影响HMGB1的表达.     

RNA干扰表皮生长因子受体对骨肉瘤细胞凋亡的影响

目的:探讨小发夹RNA载体介导抑制骨肉瘤细胞中表皮生长因子受体(EGFR)的表达和对骨肉瘤细胞增殖与凋亡的影响.方法:构建pSilencer-EGFR短发夹状小干扰RNA(siRNA)真核基因表达载体,采用脂质体介导的方法将其转染到骨肉瘤细胞中,用Western印迹法、RT-PCR检测EGFR基因在骨肉瘤细胞中的表达;通过原位末端标记 (TUNEL)法,DNA片段化检测观察其对骨肉瘤细胞凋亡的影响.结果:成功构建pSilencer-EGFR短发夹状siRNA真核基因表达载体,转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的骨肉瘤细胞中EGFR基因表达显著抑制(60%).与对照组比较,pSilencer-EGFR转染组骨肉瘤细胞培养 48 h后,DNA片段化检测出"DNA ladder"和TUNEL法显示细胞典型凋亡特征.结论:EGFR小发夹RNA质粒载体可显著抑制骨肉瘤细胞中EGFR基因的表达,促进骨肉瘤细胞凋亡,EGFR基因具有抑制凋亡的作用.     

X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子的克隆及其转录活性检测

目的:X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1能够诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3凋亡,其具体转录调控机制尚不十分清楚.克隆X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子,检测干扰素对其转录活性的影响.方法:实验于2006-05/2007-07在香港大学分子生物学研究所和洛阳华美生物工程公司完成.①材料:结肠癌细胞株Lovo和Sw1116来自美国 American Type Culture Col-lection.pGL3 basic载体,内参照pRL-CMV载体和Dual-luciferase reporter Kit,T4 DNA连接酶,限制性内切酶Kpn I和XhoI均由Promega公司提供.②实验方法:采用PCR法扩增获得X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因的启动子片段,将之定向克隆到含荧光素酶报告基因的pGL3 basic载体上,获得的报告基因质粒命名为pLUC107,瞬时转染Lovo和Sw1116细胞株,经α-干扰素刺激处理,启动子转录活性用荧光素酶相对表达活性表示.结果:①PCR扩增结果:在预期的271 bp处出现清晰DNA片段,无非特异扩增现象,证明其为X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子的PCR扩增产物.②重组质粒的酶切鉴定及测序:重组质粒pLUC107双酶切后可见约为271 bp的DNA片段,与理论值相一致.DNA测序证实含X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功.③干扰素对X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子转录活性的影响:与未经α-干扰素处理的含pLUC107的Lovo和Sw1116细胞的荧光素酶相对活性值比较,经α-干扰素处理后两种细胞的荧光素酶相对活性值均明显升高(P均 < 0.05),且升高幅度与α-干扰素呈剂量依赖性.结论:成功克隆出X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子片段,并利用荧光素酶报告基因证实α-干扰素可上调其转录活性.     

低氧诱导因子1α对钾-氯协同转运子1启动子调控作用的研究

目的:钾-氯共同转运子1(KCC1)启动子中有一推断的低氧诱导因子1α(HIF-1α)的结合位点,通过表达HIF-1α,探索该位点是否为真正的低氧诱导因子结合位点.方法:分别用KCC1野生型启动子和HIF-1α位点变异的KCC1启动子,与HIF-1α质粒或对照载体共转染HEK293细胞,用荧光素酶功能分析的方法观测HIF-1α对KCC1启动子活性的影响,用RT-PCR方法比较转染与不转染HIF-1α对KCC1表达水平的差异.结果:转染HIF-1α后野生型KCC1启动子荧光素酶活性为对照Z组的2.39倍,而变异的HIF-1α位点的KCC1启动子荧光素酶活性则在转染与不转染HIF-1α条件下差异无统计学意义,在HIF-1α转染条件下KCC1表达水平高于对照组的水平,HIF-1α转染条件下是HIF-1α不转染条件下表达量的3.19倍.结论:首次证实了HIF-1α可直接增强KCC1启动子的活性,HIF-1α可调节KCC1的表达水平.