DNA序列测定法与实时荧光PCR法检测YMDD突变结果的比较

目的比较DNA序列测定法与实时荧光法检测YMDD突变的结果,并对除YMDD突变之外的耐药相关基因突变及其意义进行讨论。方法收集89例慢性乙肝患者的92份血清样本,均用实时荧光PCR法做YMDD突变检测。采用巢式PCR法扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,采用NTI软件比对结果,并对RT基因上其他11个已知耐药相关突变位点进行分析。结果在37份YMDD突变阴性的样本中,DNA测序法检测结果为33份M204M(未突变)、1份M204I、3份M204V;4份YMDD突变阳性样本均为突变/未突变序列共存;另检出7份样本存在ADV耐药相关突变,占18.9%(7/37)。在55份YMDD突变阳性样本中,DNA测序法检测到52份,阳性结果符合率为94.5%(52/55);另检出5例存在ADV或ETV耐药相关突变,占9.1%(5/55)。结论DNA序列测定法检测HBVRT基因耐药相关突变敏感性高,重复性好,与实时荧光PCR方法的检测结果有较高的符合率,可同时检出YMDD突变以外的各种耐药相关突变,有助于临床全面了解患者对核苷(酸)类似物的耐药情况,合理地制订抗HBV治疗方案。     

PCR结合地高辛标记探针杂交检验乙型肝炎病毒C基因启动子

应用聚合酶链式反应结合地高辛标记探针杂交方法检测乙型肝炎病毒C基因启动(HBV,CP)。对聚合酶链反应(PCR)法扩增的HBV DNA直接测序进行DNA同源性分析。并运用探针杂交对结果进行进一步鉴定;应用PCR法扩增20份患者血清,阳性率达95％(19/20),同时运用探针杂交进行进一步检验,与PCR结果符合率达90％以上,并选择中度、重度乙肝患者血清和pGEM,7Z—HBV质粒扩增的HBV.CP各一份分别进行测序,与报告基因的同源性分别为72％、66.5％、90％。建立了特异敏感的检测乙型肝炎病毒C基因启动子(HBV.CP)的PCR方法,可用于HBV基因变异规律的研究。同时初步的研究结果表明,肝炎病人的HBV.CP区存在较多的变异,可能与病情轻重有一定的相关性。     

血清HBV-DNA定量水平与拉米夫定抗HBV感染中YMDD变异的相关性研究

观察拉米夫定治疗慢性乙型肝炎 (CHB)YMDD变异的产生与血清HBV DNA水平的关系。方法　选择应用拉米夫定治疗并产生YMDD变异的CHB患者 5 3例 ,分析血清HBV DNA水平与YMDD变异类型、产生时间的关系。另选择具有可比性的应用拉米夫定治疗但并未产生YMDD变异的CHB患者 5 3例 (1:1配对 )对比分析治疗前血清HBV DNA定量水平。结果　YMDD变异组治疗前血清HBV DNA定量水平显著高于未产生YMDD变异组 (P <0 .0 1)。YMDD变异类型与血清HBV DNA定量水平不相关 (P >0 .0 5 ) ,但YMDD变异产生时间与血清HBV DNA定量水平相关 (P <0 .0 5 )。结论　CHB患者血清HBV DNA水平越高 ,应用拉米夫定治疗越容易产生YMDD变异 ,且产生时间越早。血清HBV DNA水平可作为应用拉米夫定治疗YMDD变异产生的早期预测指标。YMDD变异类型与血清HBV DNA水平不相关。     

拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者HBV聚合酶基因的突变模式分析

目的 分析慢性乙型肝炎患者在拉米夫定(LAM)治疗过程中出现LAM耐药后,HBV聚合酶基因的突变模式及临床特征.方法 对2005年12月-2007年12月于第二军医大学长海医院住院或感染科门诊诊治的慢性乙型肝炎LAM耐药患者进行HBV聚合酶基因测序,回顾性分析LAM耐药时HBV聚合酶基因的不同突变模式及患者临床特征.结果 215例患者诊断为LAM耐药,192例患者检测到LAM相关的HBV聚合酶基因突变.患者血清HBV DNA水平为6.25±1.31(log10拷贝/ml),ALT中位水平为75U/L(19～821U/L),72.4%(139/192)的患者出现ALT升高、肝炎发作.99.0%(190/192)的患者存在YMDD基序突变,其中4种主要突变类型是:rtM204I(33.9%),rtL180M rttM204V(26.0%),rtLl80M rtM204I(21.9%)rtV173L rtL180M rtM204V(11.5%).与rtM204I相比,rtM204V多以联合rtL180M突变的形式存在(P<0.05).LAM耐药时,4种突变类型患者的血清HBVDNA、ALT岍差异均无统计学意义(P>0.05).结论 YMDD基序突变是LAM耐药后HBV聚合酶基因突变的主要模式,LAM耐药后患者临床病情轻重可能与HBV聚合酶基因突变类型无关.     

PCR法检测慢性乙肝患者外周血单个核细胞中HBV-DNA

目的：了解慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMCs）HBV的感染情况及其与血清HBV的关系。方法：采用聚合酶链反应（PCR）检测55例慢性乙型肝炎患者PBMCs和血清中HBV。结果：PBMCsHBV－DNA检出率为69％（38例／55例），血清HBV－DNA检出蓄为36％（20例／55例），PBMCsHBV－DNA与血清HBV－DNA无一致性，P＜0．05，PCR法检测慢性乙型肝炎患者HBV－DNA、PBMCs检出率优于血清检出率，P＜0．05。结论：在慢性乙型肝炎患者中，PBMCs存在HBV－DNA。     

血清病毒检出核苷(酸)类似物耐药突变的慢性乙肝患者PBMCs中HBV cccDNA基因突变特点分析

目的分析经核苷(酸)类似物治疗并已在血清病毒中产生耐药基因突变的慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMCs)中HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)反转录酶(RT)区的基因突变特点。方法收集2010年7月-2011年8月于解放军302医院住院的慢性乙肝患者30例,均经6个月以上的核苷(酸)类似物抗病毒治疗并已在血清中检测到耐药相关突变。采集与血清检测同一时间点的全血标本30份并分离PBMCs,提取总DNA,以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)消化+滚环扩增+跨缺口PCR方法扩增HBV cccDNA的RT区,分析9个位点的核苷(酸)类似物耐药相关变异。结果 30份样本中,16例检出HBV cccDNA,检出率为53.3%,PBMCs中HBV cccDNA检出率与HBeAg阳性率、血清ALT水平及血清HBVDNA载量均无显著相关性。在16例HBV cccDNA检出者中,B基因型5例,占31.3%,C基因型11例,占68.8%,与血清HBV基因分型结果一致。但是,与血清HBV均检出耐药突变株不同,16例PBMCs cccDNA中检出的病毒均是无核苷(酸)类似物耐药相关突变的野生株。结论在经核苷(酸)类似物治疗的慢性乙肝患者血清中HBV DNA产生耐药突变的情况下,PBMCs中HBV cccDNA仍以原始野生株为优势种群,推测PBMCs可能是体内HBV野生株的"存储库"。     

1121例慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区的耐药突变分析

目的 分析大样本慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶基因上的多位点核苷(酸)类似物的耐药相关突变情况及其临床意义.方法 提取1 121例患者血清HBV DNA,采用巢式PCR方法 扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,对12个位点上的耐药相关突变进行检测,并结合临床资料进行分析.结果 检出拉米夫定(LAM)耐药突变228例,阿德福韦(ADV)耐药突变32例,恩替卡韦(ETV)耐药突变13例,替比夫定(L-dT)耐药突变4例.多药耐药5例.LAM耐药突变中以M204V和M2041最常见,前者通常伴随U80M突变,后者常单独出现;ADV耐药突变中以N236T±A181位碱基替换为主;ETV耐药突变发生在LAM耐药基础上,以T184位碱基替换为主;L-dT的耐药突变为M2041.结论 用基因序列测定法检测HBV RT基因多位点耐药相关突变,有助于临床及时发现乙肝患者是否存在HBV基因耐药,合理进行抗病毒治疗.     

先天性甲状腺功能减退症钠碘转运体基因突变研究

目的研究天津市区先天性甲状腺功能减退症(简称甲低)患者钠碘转运体(NIS)基因突变情况。方法用TKM法提取18例先天性甲低、35例随机正常对照者外周血DNA，分别聚合酶链反应(PCR)扩增NIS基因第1～15外显子，单链构象多态性分析(SSCP)筛查NIS基因15个外显子突变，突变经直接测序证实。结果所有研究对象NIS基因15个外显子均可以PCR扩增，经SSCP分析无异常电泳条带，表明18例先天性甲低无NIS基因突变。结论所研究的天津市区先天性甲低患者无NIS基因突变。     

96例急性乙型肝炎患者HBV多聚酶区的耐药变异分析

目的检测未接受过核苷(酸)类似物(NA)治疗的急性乙型肝炎患者感染的HBV是否存在耐药变异。方法收集96例急性乙型肝炎患者住院早期血清,提取HBV DNA,采用巢式PCR方法扩增HBV反转录酶(RT)全基因,对PCR产物进行DNA双向测序,对RT/S基因序列进行分子进化树分析反基因分型,对rt80、rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt236和rt250等位点上的耐药相关变异进行分析,并用克隆测序法进行验证,每个样本测定10～20个克隆。结果用直接测序法检出NA耐药变异8例(8.3%),C型6例,B型2例。其中6例为拉米夫定(LAM)耐药变异,包括4例rtM204I、1例rtL80I+rtM204I和1例rtL180M+rtM204I;另2例检出与阿德福韦酯(ADV)耐药相关的rtA181V变异。变异株多数与野生型病毒株共存。克隆测序法的结果与直接测序法的结果大体相符,部分样本中有2种或多种耐药变异株共存,其中1例患者的样本中除LAM变异株外,还检出了ADV和恩替卡韦(ETV)耐药变异株,变异形式分别为rtA181T+rtN236T和rtL180M+rtS202G+rtM204V。结论未接受过NA治疗的急性乙型肝炎患者可以感染NA耐药株病毒,NA耐药病毒可以在人群中传播引起急性乙型肝炎,变异病毒的传播致病不只局限于LAM耐药株。     

室内氡暴露居民肺癌p53和k-ras基因突变

目的：检测室内高氡暴露地区居民肺癌P53和k-ras基因突变,方法：采用PCR扩增,PCR－SSCP电泳和序列分析方法。结果：9例标本中有5例p53PCR-SSCP电泳呈阳性结果,其中3例经克隆测序发现有碱基置换,结论：室内氡浓度在200－350Bq.m^-3.a^-1范围内的7例肺癌病例中有5例发生P53基因突变,P53基因突变还可能与肺癌患者的年龄吸烟史有关。     

拉米夫定治疗中国乙型肝炎患者中发现YMDD耐药变异株

为了监测拉米夫定临床治疗过程中耐药性的产生,更好地指导临床用药。采用ＰＣＲ产物克隆后测序的方法,对２０例服用拉米夫定病人进行随访观察,检测其体内乙型肝炎病毒聚合酶基因酷氨酸－蛋氨酸－天门冬氨酸－天门冬氨酸区域变异情况,同时观察其ＨＢＶＤＮＡ定量和肝功能指标变化。     

慢性乙型肝炎表面抗原携带者前S1基因的高度异质性

应用半巢式聚合酶链式反应（ＰＣＲ）从一例慢性ＨＢｓＡｇ携带者血清中扩增出ＨＢＶ前Ｓ１基因，将其克隆于噬菌体Ｍ１３ｍｐ１９中进行序列分析。结果发现：与同源性最好的ＨＢＶａｄｒ野生林相比，所测的１０个克隆均有替代和插入突变，９个克隆有缺失突变，１０个克隆的核苷酸变异率为５．０％－１７．０％，氨基酸的变异率为１３．０－６０．０％；１０个克隆之间的核苷酸变异率为２．３％－２４．３％，氨基酸的变异率为１４．     

重型肝炎病人的乙肝病毒前C基因变异研究

对１１例重型肝炎病人乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ直接序列进行分析以阐述变异特点。一次或套式ＰＣＲ扩增到的ＨＢＶＤＮＡ，以不对称ＰＣＲ法制备成单链模板后直接作序列分析。结果１１个病例中，９例有１～２个氨基酸替代变异：Ｇ１８９６→Ａ的替代，产生一个终止密码，见于１例抗－ＨＢｅ阳性的病人，第１７位（ＡＡ１７）缬氨酸被苯丙氨酸替代，见于１例ＨＢｅＡｇ阴性的病人，ＡＡ１５和ＡＡ２９的丝氨酸替代变异见于２例ＨＢｅＡｇ阴性、ＨＢＶ含量甚低的病例，１８５８Ｃ→Ｔ替代见于４例病人，与ＨＢｅＡｇ表型无关，无一伴有终２８变异，呈相互排斥现象。说明重型肝炎病人的ＨＢＶ前Ｃ基因存在多种变异类型。这些变异点只见于１～２例病人，似乎不是引发重型肝炎的重要原因，Ｇ１８９６→Ａ替代变异和ＡＡ１７的苯丙氨酸替代与ＨＢｅＡｇ阴性表型相关     

慢性乙型肝炎血清学标志、HBV DNA定量分析及HBV前C/C变异的临床研究

目的 :探讨慢性乙型肝炎患者血清学标志、HBVDNA载量及HBV前C/C变异与临床病变的关系。方法 :随机选取慢性乙型肝炎患者 2 4 6例 ,其中轻度 10 2例、中度 88例、重度 5 6例 ,分别应用ELISA、实时PCR法检测其血清中的HBV免疫学标志及HBVDNA含量。同时对HBeAg阴性而HBVDNA含量高拷贝的 3例轻度、6例中度及 8例重度患者血清 ,应用巢式PCR方法分离前C/C区全长基因 ,纯化后克隆入T载体 ,鉴定后进行序列测定。结果 :10 2例轻度、88例中度及 5 6例重度患者中血清学标志HBsAg ,HBeAg,抗 -HBc阳性模式分别为 5 3例 (5 1.9% )、4 6例(5 2 .3% )、33例 (5 8.9% ) ;HBsAg ,抗 -HBe,抗 -HBc阳性模式分别为 37例 (36 .3% )、32例 (37.5 % )、2 1例 (37.5 % ) ;单独HBsAg阳性为 8例 (7.8% )、5例 (5 .6 % )、1例 (1.7% ) ;其他模式分别为 4例、5例、1例。HBVDNA含量平均值分别为 10E 5 .5 3拷贝 /ml、10E 6 .0 3拷贝 /ml、10E 6 .5 8拷贝 /ml。HBeAg阴性而HBVDNA含量 >10E 6拷贝 /ml的病例数分别为 3例、6例、8例。统计分析表明 ,轻、中、重慢性乙肝患者间血清学标志及HBVDNA含量差异均不具统计学意义 ,而HBeAg阴性HBVDNA含量高拷贝的患者出现频率差异具有统计学意义。序列测定结果显示 17例患者血清的HBV分离株的前C/C     

慢性乙肝患者HBV反转录酶区新变异rtL180M+A181C+M204V的鉴定及表型耐药特点分析

目的鉴定经核苷(酸)类似物序贯治疗的慢性乙肝患者HBV反转录酶(RT)区的新变异rtA181C,并分析其表型耐药特点。方法 2010年6月解放军302医院确诊的慢性乙肝患者1例,提取血清HBV DNA,巢式PCR扩增HBVRT全基因,采用PCR产物直接双向测序结合克隆测序分析HBV RT区12个耐药相关突变位点。构建代表性克隆重组表达载体pTriEx-HBV1.1,瞬时转染人肝癌细胞系HepG2细胞,转染4h后加入不同浓度拉米夫定(LAM,终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)、阿德福韦(ADV,终浓度为0、0.033、0.1、0.33、1、3.3μmol/L)、恩替卡韦(ETV,终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L)和替诺福韦(TDF,终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L),4d后采用实时荧光定量PCR检测不同药物浓度作用下培养细胞上清中HBV DNA的复制水平并分析其表型耐药特点。结果此例慢性乙肝患者序贯接受LAM治疗36个月→ADV治疗14个月→ETV治疗29个月,而后发生病毒学突破,HBV DNA由阴性升高至1.1×106IU/ml,ALT由正常升高至235U/L。直接测序显示HBV RT基因rtL180M+A181V+M204V变异,克隆测序得到18个克隆,其中9个为rtL180M+A181V+M204V变异株,7个为rtL180M+A181C+M204V变异株,1个为rtV173L+L180M+A181V变异株,1个为野生株。病毒复制力检测结果从高到低依次为:野生株>rtV173L+L180M+A181V>rtL180M+A181C+M204V>rtL180M+A181V+M204V。表型耐药分析显示,与野生株比较,rtL180M+A181V+M204V变异株和rtV173L+L180M+A181V变异株对LAM和ADV不敏感,rtL180M+A181C+M204V变异株对LAM和ETV不敏感。结论长期核苷(酸)类似物序贯治疗可引起多重耐药;rt181位点新的变异rtA181C与ETV长期用药有关,可能是新的ETV耐药变异位点。     

YMDD突变株HBV转基因小鼠的制备及检测

目的建立YMDD耐药突变株HBV转基因小鼠,为乙肝防治研究提供转基因动物模型。方法采用受精卵显微注射法,将带有YMDD突变的对拉米夫定有耐药性的1.3拷贝HBV基因注入FVB/N单细胞受精卵的原核内,制备YMDD耐药突变株HBV转基因小鼠。采用PCR检测外源基因的整合和传代情况,采用ELISA和免疫组化等方法检测HBsAg在肝、肾中的复制和表达情况。结果注射受精卵3401枚,产269只F0代仔鼠,PCR阳性33只,外源基因的整合率12.3%。9只转基因鼠血清HBVDNA弱阳性,拷贝数低于103拷贝/ml;免疫组化结果显示肝组织和肾组织均有HBsAg表达,且肾组织中的表达强于肝组织。经传代产下47只F1代转基因鼠,目的基因PCR阳性率为27.6%,且肝组织和肾组织中HBsAg均有表达,分布特性与F0代一致。结论成功制备出体内有复制表达而且可以传代YMDD耐药突变株HBV的转基因小鼠。     

乙型肝炎、丁型肝炎病毒联合诊断芯片制备的初步研究

目的制备联合检测乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)基因芯片并进行杂交验证。方法利用Primer Premier 5．0分别针对HBV、HDV基因保守区域设计多对PCR引物,扩增后的产物克隆至pMD18-T载体,提取阳性克隆质粒进行测序分析鉴定。用PixSys5500芯片打印仪将PCR产物打印在氨基修饰的玻片上制备成检测芯片。样品荧光标记采用限制性显示(RD)技术,标记后进行杂交验证分析。结果序列分析表明,运用PCR技术得到的多个基因片段均属于HBV、HDV特异基因。杂交结果显示,敏感性、特异性、重复性等指标均佳。结论利用PCR扩增产物作为探针制备HBV、HDV联合诊断芯片是一种快速、简便的实用方法,有着广阔的应用前景;利用RD技术标记样品可提高多种肝炎病毒混合检测的敏感性。