HPV L1 C-末端保守序列短肽诱导HPV多型别交叉抗体的初步研究

通过对HPV L1序列进行比对,发现HPV L1 C-末端存在长30个氨基酸残基的保守序列短肽;出于检测短肽是否可以诱生HPV多种型别交叉抗体的目的,将该序列短肽加弗氏佐剂用于日本大耳白兔和BALB/c小鼠免疫,然后用ELISA方法检测此免疫动物血清及其分泌物中的IgG抗体滴度,发现此免疫动物体内已诱生出高滴度的血清IgG抗体(>1∶20000);再用ELISA、免疫组织化学和Western blot的方法对此诱生血清抗体与HPV阳性宫颈癌细胞株的反应情况进行检测,发现这些短肽抗血清可与16、18型HPV L1很好地进行反应,其对照组呈现阴性。这一研究结果表明短肽可以诱生HPV多种型别交叉抗体。它对后续研发HPV L1广谱疫苗或检测试剂盒具有重要意义。     

HPV L1 C-末端保守序列短肽体液免疫学特性

目的 探讨一段位于HPV L1 C-末端、长30个氨基酸残基的保守序列的体液免疫学性质而进行此实验.方法 以此序列为基础人工合成短肽,以该短肽免疫小鼠和兔,获得抗血清,通过ELISA,Western Blot及免疫组织化学的方法,分别对含HPV6b,16及18 L1的细胞裂解物、重组蛋白或HPV阳性临床标本进行反应.结果 抗短肽抗血清能与含HPV6b,16及18 L1的细胞裂解物、重组蛋白发生针对HPV L1的反应,能使HPV6和16阳性的临床标本呈现阳性反应,而抗HPV16及抗重组HPV16 L1抗血清对此短肽的反应则较弱.结论结果表明由该保守序列短肽诱导的抗血清具有一定的型间交叉反应特征,这一特性可能对研究检测用广谱HPV L1抗体有一定的意义.该序列短肽抗血清对不同型HPV L1反应的差异性及抗血清对多型别HPV L1的反应是否具有中和性,尚需进一步的研究.     

HPV31型L2保守中和表位可诱发广谱中和抗体

目的研究人乳头瘤病毒31型(HPV31)次要外壳蛋白L2保守中和表位的免疫活性及诱发抗体的中和范围。方法合成法获得HPV31 L2 aa.17-40多肽,用EDC法偶联KLH,联合弗氏佐剂免疫新西兰大白兔,用假病毒中和实验检测免疫血清对来自α4、α7、α9、α10及β1亚属的多个HPV型别的中和抗体。结果 HPV31 L2-KLH偶联肽可在新西兰大白兔体内诱发针对至少17种HPV型别的广谱中和抗体,其中HPV31的中和抗体滴度最高,HPV5/45/57的次之。结论首次发现HPV31 L2保守中和表位免疫血清具有广谱中和活性,为基于该表位的广谱HPV疫苗研发奠定了基础。     

HPV 18 L1病毒样颗粒的表达纯化及其豚鼠抗血清制备

目的 优化人乳头瘤病毒(HPV)18型晚期基因L1并在昆虫细胞中表达,获得HPV 18 L1病毒样颗粒(VLP),制备豚鼠抗血清。方法 联合利用昆虫细胞偏性密码子、C末端截短32个氨基酸、降低mRNA二级结构等策略优化HPV 18 L1基因,合成后克隆入pFastBac1载体,构建重组病毒,感染sf9昆虫细胞72h后进行Western blot表达鉴定,密度梯度离心法纯化后进行纯度鉴定及形态学鉴定,获得HPV 18 L1 VLP,联合弗氏佐剂免疫豚鼠制备抗血清。结果 HPV 18 L1优化基因在昆虫细胞中可有效表达,纯化的HPV 18 L1蛋白纯度达90%以上,电镜观察可见直径约为50nm的VLP,豚鼠免疫血清中HPV 18 L1 VLP 特异性抗体滴度达5.12×105。结论 HPV 18 L1优化基因可在昆虫细胞中高效表达并组装成VLP,制备的高滴度抗血清为HPV 18 L1 VLP疫苗的进一步研究打下基础。     

人磷脂转移蛋白的原核表达及其抗体的制备与鉴定

目的利用大肠杆菌表达人磷脂转移蛋白(PLTP),制备兔抗人PLTP的多克隆抗血清。方法采用RT-PCR技术,将人PLTP蛋白编码序列克隆入pET-30b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备PLTP抗血清。用间接ELISA法、Western blot、细胞免疫荧光检测对抗血清效价及特异性进行鉴定。结果SDS-PAGE分析表明,PLTP基因在大肠杆菌BL21(DE3)菌株的包涵体中高效表达,最佳诱导表达时间为3h;将纯化的蛋白免疫家兔,ELISA法测定的抗血清效价为1∶256000;Western blot及细胞免疫荧光检测显示,抗血清可以与PLTP原核及真核表达蛋白特异结合。结论成功地将PLTP进行了原核表达,制备了高效价、高特异性的兔抗人PLTP抗血清,为PLTP的临床检测及其结构与功能的进一步研究提供了有力工具。     

DNA免疫诱导小鼠产生抗人心肌肌钙蛋白T抗血清的研究

目的 通过基因免疫诱导BALB／c小鼠产生抗人心肌肌钙蛋白T(cTnT)的抗体应答，并比较不同免疫佐剂、预处理方法对免疫应答的影响。方法 构建cTnT的真核表达质粒pCI-cTnT，大量提取、PEG纯化质粒，通过肌肉注射免疫BALB／c小鼠并加强免疫，每隔2周取血，ELISA法分析抗cTnT的体液应答，免疫印迹检测抗血清的特异性。并比较布吡卡因预处理、CpG ODN核酸佐剂、弗氏不完全佐剂对抗体应答效果的影响。结果 接种pCI-cTnT质粒的小鼠血清中检测出抗cTnT特异性抗体，加强免疫使抗体滴度提高；使用CpGODN后免疫应答增强，弗氏不完全佐剂可明显增强免疫效果，而吡卡因预处理使应答水平下降；初次免疫后14周仍可测得较高的抗体应答。结论 采用含cTnT基因的质粒DNA免疫，成功地诱导小鼠产生抗cTnT的抗体；传统的弗氏不完全佐剂可作为核酸免疫的佐剂使用。     

兔抗人唾液酸转运蛋白抗体的制备及特性鉴定

目的：制备兔抗人唾液酸转运蛋白（sialin）的抗体，并进行特性鉴定。方法：应用RT—PCR从培养的人颌下腺细胞系HSG中扩增编码sialin N端1～38氨基酸的DNA序列，构建重组表达质粒pGEX-5X-1-sialin，测序鉴定后，转化大肠杆菌JM109，在0．1 mmol／L IPTG的诱导下表达GST—sialin融合蛋白。经SDS-PAGE鉴定后，利用GSTrap FF^TM柱纯化融合蛋白，并以其免疫家兔制备抗人sialin抗体。用ELISA法测定兔抗sialin血清的效价；用Western blot及免疫细胞化学等方法鉴定抗血清的特异性。结果：构建了重组表达质粒pGEX-5X-1-sialin；以其转化大肠杆菌在IPTG诱导下，获得以可溶性形式表达的GST-sialin融合蛋白；表达的GST—sialin经GSTrap FF^TM柱纯化后，免疫家兔制备出抗sialin抗血清，ELISA法测定抗血清的效价为1：32000。Western blot鉴定表明，制备的抗sialin抗体可特异地识别HSG细胞中相对分子质量（Mr）约55000的sialin蛋白。免疫细胞化学检测表明，sialin抗血清识别的抗原定位于HSG细胞的细胞质和胞核。结论：成功地制备出兔抗人sialin抗血清，为进一步研究sialin在涎腺组织的功能奠定了基础。     

QKI蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:获得原核表达的RNA结合蛋白QKI-7蛋白,并制备其兔抗QKI多克隆抗体。方法:将成功插入QKI-7编码区cDNA的PET32b( )原核表达载体用热休克法转化BL21(DE3)感受态细菌,以IPTG诱导6×His-QKI-7融合蛋白的表达,分别经金属鳌合柱、反向柱和强阴离子交换柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,应用纯化的融合蛋白,分别以弗氏佐剂、聚丙烯酰胺凝胶、NC膜作为佐剂免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并以Western blot进行检测。结果:经表达并纯化的QKI-7蛋白纯度达到95%以上,应用纯化的融合蛋白以弗氏佐剂作为佐剂免疫新西兰大白兔后获得高滴度,特异性的抗QKI的多克隆抗体。结论:成功地表达并纯化了QKI-7蛋白,并制备了高滴度、高特异性的抗QKI多克隆抗体。采用弗氏佐剂作为免疫佐剂进行免疫的效果优于聚丙烯酰胺凝胶和NC膜。     

人胆固醇酯转运蛋白的eDNA克隆、原核表达及抗血清制备

目的:克隆人胆固醇酯转运蛋白(CETP)eDNA序列,利用大肠杆菌表达人CETP,制备兔抗人CETP的多克隆抗血清.方法:采用RT-PCR方法,将人CETP基因克隆到pET-30b( )上,构建CETP原核表达载体并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备CETP抗血清,以ELISA、Western blot、细胞免疫荧光方法对抗血清效价及特异性进行鉴定.结果:SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CETP基因在大肠杆菌BL21(DE3)的包涵体中高效表达,最佳诱导表达时间为4 h.将切胶纯化的蛋白免疫家兔,ELISA法测定的抗血清效价为1∶5.12×105.Western blot及细胞免疫荧光检测结果显示,抗血清可以与CETP原核及真核表达蛋白特异结合.结论:成功地将CETP进行了原核表达并制备了高效价、高特异性的兔抗人CETP抗血清,为进一步研究CETP的结构与功能奠定了基础.     

重组荞麦rBTI的多克隆抗体制备及鉴定

目的: 制备重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)的多克隆抗体.方法: 通过大肠杆菌原核表达系统制备高纯度的rBTI蛋白, 免疫大白鼠, 制备多克隆抗体.用Western blot、间接ELISA及免疫细胞组织化学法检测该抗体的效价和特异性.结果: 间接ELISA法检测所制备抗体的效价达1∶ 128 000以上;Western blot显示该抗体能与BTI蛋白特异结合;免疫组织化学法检测结果显示rBTI主要存在于EC9706细胞的胞质和细胞核内.结论: 所制备的大鼠抗rBTI的抗血清具有较高的免疫反应性和特异性, 为rBTI诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究及进一步揭示荞麦胰蛋白酶抑制剂的结构与功能的关系提供重要的基础.     

Preliminary research of induction of the multiple HPV antibody by HPV L1 type conserved sequence aimed at human papillomavirus major protein

To investigate whether a conserved sequence of the human papillomavirus(HPV) L1 protein consisted of 12 amino acid residue can induce the antibody aimed at multiple HPV types, we screened a conserved sequence of the HPV L1 protein by forecasting B cell epitope and comparing multiple sequences. The peptide was synthesized, mixed with Freund adjuvant, and used to immunize rabbits, and those in the control group were only immunized with Freund adjuvant. Then the antibody titer was identified by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). And immunocytochemistry, immunofluorescence, western blot and immunohistochemistry were used to detect whether the antibody could react with cervical cancer cell lines and cervical tissue that had been identified with HPV infections. We found that the antibody titer was greater than 1:25600. Moreover, we confirmed that the antibody could react with cervical cancer cell lines and cervical tissue with HPV infections. The results showed that the peptide could induce antibody aimed at multiple HPV types. Our findings have great significance in further research of the broad spectrum HPV, HPV L1 diagnosis kits.     

5'-RACE法扩增抗人乳头瘤病毒16型L1蛋白单克隆抗体轻链可变区基因及序列分析

目的 获得抗人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1蛋白单克隆抗体的轻链可变区(VL)基因并分析序列.方法 从分泌抗HPV16L1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,逆转录形成cDNA,用5'-RACE策略扩增抗体轻链可变区基因,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,并测序及进行序列分析.结果 VL基因全长336bp,编码112个氨基酸,基因测序结果符合小鼠抗体轻链可变区特征.结论 5'-RACE法成功获得了抗HPV16L1蛋白的单克隆抗体轻链可变区基因的真实序列,为基因工程抗体研究奠定了良好基础.     

人乳头状瘤病毒(HPV)16L1病毒样颗粒蛋白与HPV16L1基因联合免疫的体液免疫反应及其抗体的体外中和实验

目的用含有编码人乳头状瘤病毒(HPV)16L1和HPV16L1病毒样颗粒(VLP)蛋白联合免疫小鼠,与用HPV16L1重组表达质粒比较,观察VLP蛋白免疫对免疫小鼠产生抗体的增强作用,以及抗体的体外中和作用,寻找研制HPV16感染的预防性疫苗的有效途径。方法将c57BL／6小鼠,随机分为4组：Ⅰ组：pcDNA-L1(100μl/鼠),Ⅱ组：pcDNA—L1(70μl/鼠) HPV16K1 VLP,Ⅲ组：pcDNA3.1(100μl/鼠)空质粒,Ⅳ组：PBS缓冲液。质粒免疫3次,间隔3周。ELISA法检测其血清抗体,红细胞凝集实验和HPV16病毒样颗粒结合抑制实验体外检测抗体的中和活性。结果pcDNA-L1 HPV16L1 VLP较pcDNA—L1免疫组,3次免疫后的抗体水平均增高,尤其以第2次和第3次免疫后的抗体水平增加更显著。pcDNA—L1 HPV16L1 VLP联合免疫组血清的抑制活性高于pcDNA—L1免疫组,且．He[a细胞结合抑制实验染色呈阴性。结论HPV16L1 VLP联合免疫可以增加目的抗原的中和抗体产生,可能是HPV16有效预防性疫苗研制的更有希望的策略。     

人乳头瘤病毒58型L1壳蛋白在原核细胞中的高效表达及抗体制备

目的 人乳头瘤病毒58型（HPV58）是重要的高度致瘤性病毒之一。用原核细胞表达HPV58L1主要壳蛋白（McP）,并制备相应抗体血清,为基因工程疫苗研制打下基础。方法 用聚合酶链反应(PCR）扩增HPV58L1完整编码区基因,并克隆、测序。构建原核表达载体pRSETB58L1,表达的L1蛋白经SDS－PAGE纯化,免疫BALB／c小鼠。结果 在原核细胞中表达了HPV58L1壳蛋白,该壳蛋白的相对分子质量为60000,此蛋白与HPV16L1抗有交叉反应。获得抗HPV58L1壳蛋白特异性抗体,抗体滴度为1：80,并用该抗体屯昆虫细胞中表达的HPV58L1壳蛋白。结论 HPV58壳蛋白在原核细胞中获得的有效表达,纯化免疫小鼠后能产生抗HPV58L1特异性抗体,此抗体可用于鉴定真核细胞表达的HPV58L1壳蛋白。     

Neutralization of HPV16, 18, 31, and 58 pseudovirions with antisera induced by immunizing rabbits with synthetic peptides representing segments of the HPV16 minor capsid protein L2 surface region

Neutralizing antibody against human papillomavirus (HPV) minor capsid protein L2 can cross-neutralize different HPV genotypes in vitro. To identify the segments containing the cross-neutralization epitopes of HPV16 L2, we characterized antisera obtained by immunizing two rabbits with each of the ten synthetic peptides of 14 to 20 amino acids (aa) long, which represents a part of the HPV16 L2 sequence from aa 14 to 144. The antisera against the peptides within the region from aa 18 to 144 efficiently bound to HPV16 L1/L2-capsids and neutralized HPV16 pseudovirions, indicating that the region is displayed on the surface of the capsids and contains several neutralization epitopes. Antiserum against the peptide from aa 18 to 38 (anti-P18/38) cross-neutralized HPV18. Anti-P56/75 cross-neutralized HPV18, 31, and 58. Anti-P61/75 and anti-P64/81 cross-neutralized HPV18 and 58. Anti-P96/115 and the antiserum induced by a mutant P96/115 (S and T at aa 101 and 112 were replaced with L and S, respectively) cross-neutralized HPV31 and 58. The mixture of equal volumes of three antisera, anti-P18/38, anti-P56/75, and anti-mutant P96/115, neutralized HPV16, 18, 31, and 58 more efficiently than anti-P56/75 alone, suggesting that there is a synergistic effect of antibodies on the cross-neutralization. The cross-neutralization appears to be correlated with conserved aa sequences among HPV types. The data in this study provide a basis for designing vaccine antigens effective against a broader spectrum of the high-risk HPVs.     

人乳头瘤病毒16L1原核表达质粒的构建

目的：构建人乳头瘤病毒16L1的原核表达质粒，为下一步探讨蛋白的表达以及蛋白的功能研究作准备。方法：以临床HPV16阳性标本为模板，PCR扩增L1的片段，L1片段经EcoRI和SalⅠ双酶切后，插入载体pGEX4T-1，转化JM109感受态细胞，平板筛选获得pGEX4T-1／HPV L1的阳性质粒。通过酶切、测序验证质粒的正确性。结果：构建了原核表达质粒pGEX4T-1／HPV16L1，并通过酶切、测序等方法验证其完全正确。结论：成功构建的pGEX4T-1／HPVL1为今后的蛋白的表达和功能研究打好了坚实的基础，为HPV16的疫苗研究提供了有益的支持。     

HPV18 L1基因重组DNA构建及其免疫小鼠体内特异抗体的测定

目的：人类乳头瘤病毒１８型（ＬＰＶ１８）感染与宫颈癌的发生高度相关。其晚期基因Ｌ１编码的Ｌ１结构蛋白是刺激机体产生中和抗体的主要抗原。利用ＨＰＶ Ｌ１基因重组质粒进行ＤＮＡ疫苗的初步免疫学实验研究。方法：从ＨＰＶ１８－ｐＢＲ３２２质粒中扩增ＨＰＶ１８ Ｌ１基因,测序证明扩增片段的可靠性,构建了两个真核表达重组质粒ＨＰＶ１８ Ｌ１－ｐｃＤＮＡ３和ＨＰＶ１８Ｌ１－ｐｃＥＰ４。将提纯的质粒ＤＮＡ直接免疫     

Candidate human papillomavirus (HPV) type 27b: nucleotide sequence and heterogeneity with HPV 27

More than 100 human papillomavirus (HPV) types have been reported as tumorigenic agents. HPV types 2 and 27 were identified in benign tumors and classified closely according to the sequence homology. An HPV type 2 related sequence was identified previously in an oral papilloma. However, the correct typing and sequencing was impossible at that time. A candidate HPV was cloned by the long-PCR technique from an oral papilloma and characterized by nucleotide sequence. This virus was basically HPV type 27, but there was some heterogeneity in comparison with the prototype. Most differences were nucleotide-sequence variations. Two of four-nucleotide insertions were frame shift, resulting in longer L1 protein than that of HPV 27.     

含HPV16L1基因重组腺病毒和1型重组AAV载体联合免疫效果的研究

目的 对表达HPV16L1抗原的重组腺病毒及1型重组AAV载体联合免疫效果进行研究.方法 分别构建含密码子优化型HPVl6LI基因重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1及1型重组从V载体rAAV1-mod-HPV 16L1,将纯化的重组AAV病毒载体以肌注及滴鼻途径单独及联合免疫C57BL/6小鼠,使用体外中和实验检测各组小鼠血清中特异性中和抗体.结果 rAAV1-med-HPV16L1单独及与rAd-mod-HPV16L1联合肌注可诱导高滴度的血清中和抗体,在初免后第16周抗体滴度显著高于其他免疫组,联合肌注组诱导的抗体滴度高于单独肌注组;重组病毒联合滴鼻虽能产生一定的免疫加强作用,但抗体滴度仍显著低于rAAV1-mod-HPV16L1单独及联合肌注组.结论 型重组从V载体联合重组腺病毒以初免.加强模式肌注可诱导更高滴度的血清中和抗体.