慢性乙型肝炎患者外周血单个核淋巴细胞不同洗涤方法对HBV DNA检测的影响

目的：慢性乙型肝炎患者外周血单个核淋巴细胞(Peipheral blood mononuclear cells,PBMC)不同洗涤方法对HBVDNA检测的影响。方法：淋巴细胞分离液常规密度梯度法分离1例血清HBVDNA阳性慢性乙型肝炎患者。PBMC后,分别采用常规洗涤法和改良洗涤法(后者即在常规洗涤法的基础上第2、4次洗涤前不重悬细胞,直接加入洗液后离心),计算细胞收获得率和细胞存活率,荧光定量PCR法检测1、3、5次洗液样本和细胞样本的HBVDNA,重复实验3次。结果：常规法第1、3、5次洗液样本HBVDNA均阳性,改良法洗涤5次后洗液样本HBVDNA均阴性;改良法洗涤的细胞得率和细胞存活率分别为95％和98％,常规法洗涤的细胞得率和细胞存活率分别为71％和83％;不论常规洗涤法和改良洗涤法收获的PBMC均可检出HBVDNA。结论：慢性乙型肝炎患者PBMC改良洗涤法优于常规洗涤法,适用于PBMC中HBVDNA荧光定量PCR检测。     

体外培养中性粒细胞的活力、凋亡、活性氧变化趋势研究

目的:探讨中性粒细胞分离培养后细胞活力、凋亡、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成的变化。方法:采用密度梯度离心法分离健康人外周血中性粒细胞,在含10%胎牛血清的培养液于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养至96 h。应用流式细胞仪检测0、24、48、72和96 h的细胞活力、凋亡;在0、12、24和36 h检测ROS的生成。结果:中性粒细胞在体外培养24 h内,细胞活力可保持90%以上,24 h凋亡细胞比例与0 h相比差异无统计学意义(P0.05),在体外培养72 h后细胞活力明显下降和细胞凋亡增加,在体外培养96 h细胞几乎全部死亡;中性粒细胞产生ROS的能力在12 h已显著下降。结论:中性粒细胞在24 h内处于相对稳定的状态,细胞活力大于90%,凋亡细胞数变化不明显,可用于一般体外的实验研究。然而,中性粒细胞在体外培养12 h产生ROS的能力显著下降,ROS功能实验要在细胞分离后立即进行。     

分离外周血单个核细胞的条件优化

目的比较不同抗凝剂、离心力及离心时间对葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll)密度梯度离心法分离单个核细胞的影响,优化实验方案。方法取肝素、EDTA及2种抗凝剂混合后的3种不同抗凝血,采用Ficoll法进行分离,用血细胞分析仪进行分类和计数,计算回收率和纯度;同时对EDTA抗凝血进行不同离心力及离心时间的处理,优化分离效果。结果 EDTA组获得PBMC回收率为(51.32±50.21)%,纯度为(45.38±22.14)%;肝素组获得PBMC回收率为(24.52±19.10)%,纯度为(78.46±11.91)%;EDTA+肝素组获得PBMC回收率为(56.32±24.30)%,纯度为(80.27±12.44)%。经单因素方差分析,PBMC回收率方面,EDTA组与肝素组比较差异有统计学意义(P0.05),EDTA组回收率较高,而肝素+EDTA组与EDTA组回收率比较,差异无统计学意义(P0.05);PBMC纯度方面,EDTA组与肝素组比较差异有统计学意义(P0.05),肝素组PBMC纯度较高,而肝素+EDTA组与肝素组比较,纯度则差异无统计学意义(P0.05);PBMC存活率方面,肝素+EDTA组与肝素组、EDTA组比较,均差异无统计学意义(P0.05)。对EDTA抗凝血进行单个核细胞分离实验表明,在离心力为600×g(1 800r/min),离心时间为25min时分离效果最佳。结论肝素+EDTA组回收率、纯度与单种抗凝剂实验组相比,结果差异无统计学意义(P0.05),故在实验过程中可以混合两种抗凝全血进行细胞分离。EDTA抗凝血在离心力为600g(1 800r/min)、离心时间为25min时,分离单个核细胞效果最佳。     

重组人血管内皮抑素抗白血病作用的初步研究

目的 探索重组人血管内皮抑素(rhES,商品名恩度)体外对急性白血病细胞生长的抑制作用.方法 应用锥虫蓝拒染法、MTT法、透射电子显微镜(电镜)及Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术等方法 检测rhES体外对正常人及急性白血病患者骨髓原代细胞增殖和凋亡的影响.结果 50、100和200μg/ml rhEs作用HL-60细胞72 h,细胞增殖抑制率分别为11.6%、30.4%和33.5%;100和200μg/ml rhES作用NB4细胞72 h,细胞增殖抑制率分别为12.4%和16.4%,其抑制急性白血病细胞株增殖作用呈浓度及时间依赖性;rhES体外浓度0～400μg/ml对正常人骨髓单个核细胞的生长活性无明显抑制作用;50～200 μg/ml rhES对急性白血病患者原代细胞有抑制生长活性的作用,并且其抑制作用呈浓度及时间依赖性.rhES在体外浓度为100 μg/ml时,与HL-60和NB4细胞作用72 h,透射电镜观察可见典型的细胞凋亡的表现,流式细胞术检测凋亡率分别为19.6%和20.8%.结论 rhES在体外有抑制急性白血病细胞增殖和诱导凋亡的作用,是治疗急性白血病潜在的有效药物.     

白血病细胞对外周血钾、葡萄糖检测的影响

目的 探讨白血病细胞是否引起血清(浆)钾、葡萄糖假性升高/降低,可能的原因以及解决措施。方法 白血病患者按诊断及外周血白细胞数(20、20～50、50～100、100)×10~9/L分组,检测血清(浆)钾、葡萄糖;白血病细胞离体后经PI、Annexin V染色,流式细胞仪检测其坏死及凋亡状态;分离血清后,检测血清(浆)钾、葡萄糖。结果 与对照组(白细胞数20×10~9/L)比较,白细胞数较高组(20～50、50～100、100)×10~9/L组白血病患者的血钾显著升高(P0.05,P0.01),(50～100、100)×10~9/L组血糖显著降低(P0.05)。白血病治疗过程中,随白细胞数量下降,白血病患者的血钾降低,血糖升高。白血病细胞离体后,随时间延长,坏死细胞比例升高。分离血清后,白血病细胞对血钾、血糖影响差异无显著性。采用分离胶管能够在6 h内延缓白血病细胞引起的对血钾、血糖假性升高/降低。结论 白血病患者外周血内白细胞数量升高,引起血钾假性升高、血葡萄糖假性降低;离体后外周血内白细胞坏死增加;分离血清可降低白细胞对血清(浆)钾、葡萄糖检测的影响;建议使用分离胶管采集并及时检测临床血液样本。     

梯度渗透压对大鼠内髓集合管细胞增殖的影响

目的 研究氯化钠梯度渗透压对内髓集合管（Inner medullary collecting duct,IMCD）细胞增殖的影响。方法采用胶原酶消化和低渗溶解法分离培养SD大鼠原代IMCD细胞。在正常培养基中培养至90％以上细胞融合后,将细胞分为低渗（200mosmol／kg）,等渗（300mosmol／kg）和高渗（600mosmol／kg）培养基组。在12h和24h分别应用MTT法（甲基噻唑基四唑）细胞毒性检测活细胞数目和流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率,评价细胞的梯度渗透压耐受性。结果IMCD细胞有很强的渗透压耐受性,IMCD细胞在改变渗透压环境12h时,高渗环境下细胞凋亡率显著高于低渗和等渗环境（1．1％±0．10％V80．565％±0．096％,P〈0．05;0．104％±0．08％,P〈0．05）;而24h时高渗环境下细胞凋亡率略低于低渗环境（P〉0．05）,但仍高于等渗环境（P〉0．05）。结论高渗环境可以抑制IMCD细胞的生长,12h作用较显著;而24h低渗环境对IMCD细胞的抑制作用增加。     

氯化钴诱导心肌细胞化学性缺氧HIF-1α表达的研究

目的：观察不同浓度的氯化钴（CoCl2）对H9C2心肌细胞的影响及其诱导化学性缺氧的最佳浓度和时间。方法：用100、300、600、900、1200μmol／L的CoCI2处理H9C2心肌细胞,建立化学性缺氧诱导心肌细胞损伤的实验模型,分别于12、18、24、36、48h用Hoechst33342细胞核染色法检测心肌细胞凋亡：CCK-8试剂盒检测心肌细胞存活率;确定最佳诱导浓度600μmol／L后,分别于0、3、6、9、12、18、24、36、48h采用蛋白印迹法检测缺氧诱导因子1α（HIF-1α）蛋白的表达;确定最佳诱导时间后,用蛋白印迹法检测100、300、600、900、1200μmol／LCoCl2处理H9C2心肌细胞12h后HIF-1α蛋白的表达情况。结果：在600～1200μmo1／L浓度范围内,CoCl2呈剂量依赖性地抑制H9C2心肌细胞的存活。600μmol／LCoCl2诱导12h后H9C2心肌细胞产生明显凋亡．诱导12～48h范围内．12h时H9C2心肌细胞表达的HIF-1α蛋白最高：100～1200μmoI／LCoCl2诱导H9C2心肌细胞12h．其中600μmol／LCoCl2诱导时H9C2心肌细胞表达的HIF-α蛋白最高。结论：CoCl2诱导H9C2心肌细胞化学性缺氧的最佳浓度为600μmol／L．此时最佳时间为12h。     

一次离心法制备大、小鼠富血小板血浆实验条件的优化

目的探讨一次离心法制备大、小鼠富血小板血浆(PRP)的最佳离心条件。方法分别采用股动脉插管和心脏穿刺的方法获取大、小鼠动脉血,14%CPDA-1抗凝,滤除白细胞后分装入无菌EP管中,不同条件下(离心力:300×g～600×g,离心时间:4～12min)离心制备大、小鼠PRP,利用血液分析仪分别对抗凝全血、滤除白细胞后的血样及PRP进行细胞计数,比较不同方法间的血小板回收率。结果大、小鼠抗凝全血滤除白细胞后分别以400×g和300×g的离心力离心8min时,血小板回收率最高。结论选择合适的离心力和离心时间,达到白膜形成前的临界状态,是一次离心法制备PRP的关键。     

慢性乙型肝炎病毒负荷与外周血单个核细胞激活诱导细胞死亡及FasL表达的关系

目的 探讨慢性乙型肝炎不同HBV DNA负荷与外周血单个核细胞(PBMC)激活诱导细胞死亡(AICD) 及FasL表达的关系.方法 常规无茵分离30例慢性乙型肝炎患者和13例健康献血员PBMC,各分两组培养72小时,其中一组加入植物血凝素(PHA)培养后经碘化丙啶(PI)染色,另一组未加PHA经PE-抗FasL标记,流式细胞仪分别检测PBMC凋亡率及FasL表达阳性细胞的百分率.结果 慢性乙型肝炎患者与健康对照组PBMC凋亡率及其FasL表达阳性细胞的百分率比较差异均有统计学意义,(26.06±7.77)% vs (14.66±3.27)%, (0.846±0.299)% vs (0.432±0.126)%(t值分别为4.93,4.65,P<0.01).HBV DNA高水平组慢性乙型肝炎患者PBMC凋亡率及其FasL表达阳性细胞的百分率显著高于低水平组,分别为(33.73±5.44)% vs (25.61±5.05)% vs (18.85±4.05)%,(1.055±0.224)% vs (0.880±0.285)% vs (0.603±0.208)%(H值分别为23.29,8.92,P<0.05).慢性乙型肝炎患者PBMC凋亡率与其FasL表达呈正相关(r值为0.70,P<0.05).结论 慢性乙型肝炎患者PBMC存在AICD现象,HBV感染可激发外周血单个核细胞FasL的表达;慢性乙型肝炎患者HBV DNA负荷与外周血单个核细胞AICD及FasL表达水平呈正相关.     

超抗原葡萄球菌肠毒素B对人外周血单个核细胞的抑制作用

目的探讨葡萄球菌肠毒素B(SEB)初次和再次刺激对人外周血单个核细胞(PBMC)的影响。方法以不同浓度100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml、0.0001μg/ml的葡萄球菌肠毒素B刺激人外周血单个核细胞,同时设阴性对照及阳性对照植物血凝素(PHA)组,培养48 h后MTT比色法检测单个核细胞的增殖情况。10μg/ml葡萄球菌肠毒素B间隔48 h重复刺激两次后,同时设阴性对照及PHA组,于第二次刺激后培养48 h,MTT比色法检测单个核细胞的增殖情况。结果不同浓度组葡萄球菌肠毒素B初次刺激人外周血单个核细胞,10μg/ml组PBMC增殖最强,与PHA组间无显著性差异,刺激增殖率分别达23.1%和24.3%。间隔48 h再次刺激后,PHA组可继续促进PBMC增殖,而10μg/ml SEB组可抑制PBMC增殖,抑制率达19.7%。结论 SEB初次刺激人PBMC可引起其增殖,反复刺激可抑制其增殖。     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸增强髓系白血病细胞对三尖杉酯碱敏感性

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸对急性髓系白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CML)细胞的三尖杉酯碱敏感性的影响及其可能的机制。方法采用以前实验筛选所获得的VEGF最优反义寡核苷酸A7，长度为20个脱氧核糖核苷酸，全硫代修饰；在低血清(2％)条件下，以脂质体介导转染细胞8h，调整培养液血清浓度至10％。24h后加入三尖杉酯碱继续培养至72h，用锥虫蓝拒染法计数活细胞，用ELISA法检测培养液中VEGF蛋白的浓度，用流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。结果与随机对照序列联合三尖杉酯碱组相比，VEGF反义寡核苷酸与三尖杉酯碱联用可显著抑制AML、CML细胞存活(AML组存活细胞数下降38％，CML组存活细胞数下降25％)，并下调VEGF蛋白的表达(AML组蛋白表达下降25．44％，CML组蛋白表达下降30．81％)，增加三尖杉酯碱诱导的AML、CML细胞凋亡百分率(AML组凋亡细胞百分率增加48．29％，CML组凋亡细胞百分率增加52．76％)。结论VEGF反义寡核苷酸可提高AML、CML细胞对三尖杉酯碱的敏感性；白血病细胞分泌的内源性VEGF蛋白具有抵抗药物杀伤作用。     

青藤碱对人外周血单个核细胞的抑制作用及机制探讨

目的:探讨青藤碱对人外周血单个核细胞(PBMC)的作用,进而研究其抑制作用与凋亡的关系.方法采用MTT比色及磷脂酰丝氨酸外翻分析法.结果:青藤碱能够显著地抑制植物血凝素(PHA)和混合淋巴细胞激活的PBMC增殖,随着浓度的增加其抑制作用加强,环孢素A能够显著的抑制PHA激活PBMC增殖,加入低剂量的青藤碱后其抑制作用明显增加,青藤碱不能诱导PBMC的凋亡.结论:青藤碱通过抑制PBMC增殖来发挥免疫抑制作用,且与环孢素A有协同作用,但其作用途径不是通过促进淋巴细胞凋亡.     

次声对大鼠骨髓间充质干细胞分泌存活素能力影响的研究

目的:探讨次声对骨髓间充质干细胞(BMSCs)分泌存活素(survivin)能力的影响,初步探讨次声提高BMSCs增殖活性和抑制凋亡的机制。方法:应用全骨髓培养法获取SD大鼠原代的BMSCs,培养传代,取第三代细胞分为次声干预组与空气暴露组,两组的处理时间均为60min。采用免疫荧光技术检测两组细胞存活素表达的情况。结果:次声处理组的存活素阳性细胞率(59.9±6.1),空白对照组存活素阳性细胞率(24.3±5.8),两组具有显著性差异(P<0.05)。从荧光发光强度来看次声处理组BMSC单个细胞表达存活素的荧光强度也明显大于对照组。结论:经次声作用的BMSCs在培养72h后其存活素的表达能力明显大于空气暴露组,说明次声促进BMSCs增殖、抑制其凋亡的可能机制之一为次声提高了BMSCs分泌存活素的能力。     

Ag85B/IL-2融合蛋白在体外对PBMC增殖及Th1型细胞因子分泌的影响

[目的]研究Ag85B/IL-2融合蛋白对人外周血单个核细胞（PBMC）增殖及Th1型细胞因子分泌的影响.[方法]MTT法测定不同浓度的Ag85B/IL-2融合蛋白在不同时相对人PBMC的增殖活性,ELISA法检测Ag85B/IL-2融合蛋白作用人PBMC不同时间后IL-12和IFN-γ的分泌水平,并与Ag85B和BCG作对比.[结果]以0.8 μg/ml Ag85B/IL-2融合蛋白刺激组的人PBMC增殖活性为最强,此组在各时段均显著高于空白对照组（P〈0.01,P〈0.05）;各浓度Ag85B/IL-2融合蛋白刺激48 h后的IL-12水平均显著高于空白对照组（P〈0.01,P〈0.05）,以0.8 μg/ml的浓度刺激PBMC 72 h时,IL-12的分泌达最高;0.8 μg/ml和1.6 μg/ml刺激组的IFN-γ浓度在各个时相点均显著高于空白对照组（P〈0.01,P〈0.05）.Ag85B/IL-2融合蛋白刺激PBMC 分泌IL-12和IFN-γ的作用,均显著强于Ag85B和BCG（P〈0.01）.[结论]Ag85B/IL-2融合蛋白具有促人PBMC增殖和Th1型细胞因子分泌的作用.     

两步和三步法分离样本资源库抗凝血单个核细胞和血浆效果比较

目的比较两步和三步法分离外周血单个核细胞(PBMC)和血浆的效果。方法对送至样本资源库的16例抗凝血标本分别采用两步法和三步法分离PBMC及血浆,并对2种不同处理方法的分离效果进行比较。两步法为将抗凝血加入淋巴细胞分离液,离心后分别分离PBMC和血浆;三步法则先离心分离血浆后再加入淋巴细胞分离液,离心后分离PBMC。结果 2种处理方法处理后检测的活细胞数、总细胞数及活细胞比例结果相近,差异均无统计学意义(P0.05)。两步法血浆中细胞因子水平均低于三步法,其中25种细胞因子比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论两步法省时,操作少,在分离PBMC方面效果与三步法类似;但两步法在分离血浆方面会影响血浆细胞因子水平。     

感染性脑损伤中的细胞凋亡及凋亡诱导因子的表达及意义

目的:探讨凋亡在感染性脑损伤的发生发展以及caspase非依赖性途径在感染性脑损伤机制中的作用。方法:SD大鼠160只,随机分为NS组和LPS组各80只,LPS组颈内动脉注射LPS制作感染性脑损伤模型,NS组颈内动脉注射NS,2组均观察注射后6、12、24、48及72h5个时间点,检测各组不同时间点脑组织的EB含量,免疫组化检测脑组织NSE、GFAP蛋白及凋亡诱导因子(AIF)的表达,并应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)技术检测细胞凋亡数。结果:LPS组NSE、GFAP、AIF表达及细胞凋亡数均为6h开始增加,12h表达进一步增强,24h达高峰,48-72h时渐减少,但均明显高于NS组。结论:细胞凋亡参与感染性脑损伤细胞发展过程,Caspase非依赖性途径通过AIF的表达发挥重要作用。     

镁对健康人外周血CD4~＋T细胞凋亡和自噬的影响

背景：研究表明镁参与了机体免疫系统的调节,包括细胞增殖、凋亡等过程。目前国内外尚未见报道镁浓度对健康人外周血CD4＋T淋巴细胞的凋亡和自噬有何影响。目的：拟观察镁离子浓度对体外培养的健康人外周血CD4＋T淋巴细胞凋亡和自噬的影响。方法：分离20名健康人外周血CD4＋T淋巴细胞,与不同浓度的镁共培养24-72h,分别为低浓度镁（0.2和0.4mmol/L）、生理浓度镁（0.8mmol/L）和高浓度镁（5和10mmol/L）,然后以流式细胞术检测细胞的凋亡和自噬水平。结果与结论：①CD4＋T细胞与低浓度镁共培养后,细胞的凋亡和自噬水平均显著增加（P〈0.05）。②高浓度镁则显著下调CD4＋T细胞的凋亡和自噬水平（P〈0.05）。③非生理浓度的镁对CD4＋T细胞凋亡和自噬的影响呈浓度依赖性和时间依赖性,但是生理浓度镁（0.8mmol/L）对健康人外周血CD4＋T细胞的凋亡和自噬无影响（P〉0.05）。结果提示细胞外镁缺乏可以诱导健康人外周血CD4＋T细胞的凋亡和自噬,而补充镁可以下调其凋亡和自噬水平,生理浓度的镁不影响其凋亡和自噬水平。     

Sorafenib对前列腺癌DU145细胞的抑制作用的研究

目的观察索拉非尼（Sorafenib）对雄激素非依赖性前列腺癌Du145细胞的抑制作用。方法用不同浓度Sorafenib处理前列腺癌DU145细胞24、48和72h后,MTT法检测Sorafenib对DUl45细胞的抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡变化,Westernblot检测不同浓度Sorafenib处理72h后DU145细胞内ERK和Bcl-2的表达。结果Sorafenib能显著抑制DU145细胞的体外生长,呈时间与剂量依赖性。DUl45细胞凋亡率随着Sorafenib剂量的增加而增大,具有良好的量效关系（P〈0．01）;Sorafenib处理DU145细胞72h后,ERK和Bcl-2蛋白的表达明显下调（P〈0．01）。结论Sorafenib抑制DU145细胞增殖、诱导细胞凋亡,可显著抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞的体外生长。     

人参总皂甙对HL-60细胞凋亡相关基因bax、bcl-xl表达的影响

本研究探讨人参总皂甙对凋亡相关基因表达的影响及其诱导HL-60细胞凋亡的作用机制。用人参总皂甙0、100、200、400、800及1600μg／ml作用于HL-60细胞48小时。用荧光显微镜检测HL-60细胞形态的变化，流式细胞仪、DNA凝胶电泳检测HL-60细胞凋亡，RT—PCR检测bax、bcl—xl基因表达的变化。结果表明：人参总皂甙浓度在100—400μg／ml时，HL-60细胞凋亡逐渐增加，可见典型的凋亡细胞形态和明显的DNA梯度。在该浓度范围内，bax表达逐渐增加、而bcl—xl表达逐渐减少；当人参总皂甙浓度大于400μg／ml时，出现细胞坏死．细胞凋亡下降．结论：一定浓度的人参总皂甙能诱导HL-60细胞发生凋亡，且细胞凋亡率与人参总皂甙浓度呈一定的量效依赖关系，bax、bcl—xl基因的表达变化在人参总皂甙诱导HL-60细胞凋亡可能起重要作用。     

LDH释放法检测肿瘤患者PBMC和CIK细胞的细胞毒活性

目的建立检测细胞毒活性的乳酸脱氢酶（LDH）测定法，了解肿瘤患者外周血单个核细胞（PBMC）和细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）的抗肿瘤活性，为肿瘤的免疫细胞治疗提供参考。方法采集肿瘤患者和健康成人外周血，常规分离PBMC，体外进行CIK的培养，用LDH释放法分别检测PBMC和CIK对肿瘤细胞K562的细胞毒活性。结果肿瘤患者PBMC对K562的杀伤活力比正常人显著降低（P〈0．05）。经多种细胞因子诱导培养7～10d后，健康人和肿瘤患者的CIK对K562的杀伤活力都有显著提高（P〈0．01），肿瘤患者CIK杀伤活力接近于健康人。结论肿瘤患者PBMC细胞毒活性显著降低，但经诱导培养成CIK后则显著提高。用LDH释放法检测肿瘤病人CIK细胞毒活力，有助于CIK疗法适应病人的选择及个体疗效观察。