基于报告基因检测的β3肾上腺素受体激动剂筛选模型的建立与应用

目的：建立基于双荧光素酶报告基因检测的β3肾上腺素受体（β3-AR）激动剂筛选模型,并用于β3-AR激动剂的筛选。方法：应用免疫细胞化学法鉴定β3-AR在β3-CHO细胞上的稳定表达,并将pCRE-luc质粒与pRL-TK质粒共同瞬时转染β3-CHO细胞,建立一种基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型。通过检测报告基因萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值,来间接反映配体对β3-AR的激动活性。并以β-AR激动剂异丙肾上腺素刺激对模型的有效性进行验证,在此基础上以此模型对20种新化合物的β3-AR激动活性进行筛选。结果：β3-CHO细胞经免疫细胞化学法鉴定有特异性受体蛋白表达。通过将两个报告基因质粒转染该细胞后,与加入溶剂对照相比,加入异丙肾上腺素可显著促进荧光素酶报告基因的表达,表明该模型有效、可靠。以此模型从20个化合物中初筛出8个活性较强的β3-AR激动剂。结论：本研究建立了基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型,并以此模型筛选发现了几个活性较强的β3-AR激动剂。     

基于报告基因和PPARγ信号通路的药物筛选模型的建立

目的　建立基于报告基因和PPARγ(peroxisomeprolif erator activatedreceptorγ)信号通路的药物筛选模型,用此模型筛选具有胰岛素增敏活性的小分子化合物。方法　五种细胞分别进行瞬时转染,将含有目的片段PPRE(peroxisomeproliferatorresponseelement)和报告基因荧光素酶(Luc)的质粒及表达PPARγ的质粒共转染到细胞中,通过测定荧光素酶活力来考察马来酸罗格列酮对PPARγ信号通路的影响,选取诱导表达倍数最高的细胞株建立模型。用其他类型核受体激动剂对此模型进行特异性考察。结果　293T细胞中,荧光素酶的表达受马来酸罗格列酮的诱导倍数最高,可达4 9倍,并呈现一定的剂量依赖关系,Z′因子为0 .72。而其他各类核受体激动剂的诱导表达率均在1倍左右。马来酸罗格列酮在转染剂量范围内无促进细胞增殖的作用。结论　马来酸罗格列酮对共转染报告基因质粒和表达PPARγ质粒的293T细胞Luc的表达具有较强的诱导作用,此模型具有较好的特异性和稳定性,适用于建立筛选PPARγ激动剂的高通量筛选模型。     

基于COL1A1启动子的抗肝纤维化药物高通量筛选模型的建立及应用

为了有效筛选潜在的抗肝纤维化药物,本实验室建立了基于COL1A1启动子的高通量筛选细胞模型。该细胞模型在TGF-β1的刺激下,激活COL1A1启动子及荧光素酶报告基因的表达,而该激活作用可以被候选化合物抑制。作者首先构建COL1A1启动子和荧光素酶报告载体p GL4.17的重组质粒。采用双荧光素酶报告基因检测系统对该启动子的活性进行检测,发现重组质粒比对照组荧光素酶活性高15.98倍。该质粒转染到人肝星状细胞株LX2中,用无限稀释法得到单克隆细胞株,并利用活体成像仪筛选出稳定表达COL1A1启动子的单克隆细胞株LX2-COL。经TGF-β1诱导后检测该单克隆细胞株LX2-COL对候选化合物(S1~S7)的反应性,其中S7对启动子活性抑制作用最强。Real-time RT-PCR和Western blotting验证了经该细胞模型筛选得到的化合物S7能够抑制Ⅰ型胶原m RNA和蛋白水平的表达。结果表明,该细胞模型的建立能够实现对潜在的抗肝纤维化化合物的高通量筛选。     

Nfic 基因 3′UTR 双荧光素酶报告质粒的构建及其与 miR-20a 靶向关系的验证

摘要： 目的 构建核因子 C（nuclear factor I-C, Nfic）基因 3′非编码区（3′UTR）荧光素酶报告质粒, 利用双荧光素酶报告基因验证 microRNA-20a（miR-20a）与其潜在靶基因 Nfic 的靶向关系。 方法 通过 microRNA 靶基因预测软件 Targetscan 获取 miR-20a 与 Nfic 基因 3′UTR 潜在的互补结合位点; PCR 扩增出 Nfic 基因 3′UTR 序列, 将此序列克隆至荧光素酶报告载体 pMIR-Report Luciferase; 将重组荧光素酶报告质粒与 miR-20a mimics（ 实验组） 或 NC mimics（对照组）共同转染 293-AD 细胞, 收集细胞后通过双荧光素酶报告系统检测 2 组细胞的荧光素酶活性, 从而对 Nfic 与 miR-20a 的靶向调节关系进行鉴定。 将 miR-20a mimics 和 NC mimics 分别转染骨髓基质细胞系 ST2, 裂解细胞提取蛋白后采用 Western blotting 检测 NFIC 蛋白的表达水平。 结果 构建的重组荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确。 双荧光素酶报告基因检测显示, 与对照组相比, miR-20a 可以抑制 Nfic 3′UTR 报告基因载体的荧光素酶活性（P < 0.05）;Western blotting 结果显示, 与对照组相比, ST2 细胞转染 miR-20a mimics 后 NFIC 蛋白表达水平明显下调。 结论 成功构建了 Nfic 基因 3′UTR 荧光素酶报告质粒,而 miR-20a 可以直接作用于 Nfic 基因 3′UTR,抑制其荧光素酶活性。     

HCV Core基因真核表达载体构建及其对HeLa细胞自噬的影响

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白（Core）真核表达载体,并研究其对人宫颈癌 HeLa细胞自噬功能的影响。方法 以 HCV复制子质粒 pJFH1为模板,PCR法扩增 HCV Core 基因片段,经纯化回收后与 PLVX-IRESZsGreen1载体用同源重组法相连,构建 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,并经测序验证其序列的正确性。转染宫颈癌 HeLa细胞,并设 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组、PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组以及未转染质粒空白对照组,通过免疫印迹法验证 HCV Core蛋白在 HeLa细胞中的表达,并用免疫荧光（IF）和免疫印迹检测自噬生物标记物微管相关蛋白 1轻链 3（LC3）的表达水平。结果 获得 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,测序结果表明构建的重组质粒序列完全正确,HCV Core重组蛋白可在 HeLa细胞中有效表达;免疫荧光和免疫印迹结果表明,HCV Core过表达细胞 LC3焦点和 LC3 Ⅱ蛋白表达水平明显增多,PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组的细胞 LC3 Ⅱ水平（1.069±0.049）高于 PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组（0.776±0.047）,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 成功构建了 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core 重组质粒,HCV Core 蛋白过表达可诱导 HeLa 细胞自噬。     

miR-143对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响以及对Bcl-2表达的调节

目的研究miR-143对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响,探讨miR-143对宫颈癌HeLa细胞系Bcl-2蛋白及mRNA表达的调节作用。方法将miR-143,anti-miR-143以及microRNA空对照高表达质粒用脂质体转染进宫颈癌He-La细胞中,MTT法检测宫颈癌HeLa细胞增殖的变化,His-tone/DNA ELISA检测细胞凋亡;Western blot和RT-PCR检测Bcl-2蛋白和mRNA的表达情况;双荧光素酶报告基因法检测miR-143的靶位点。结果 MiR-143抑制HeLa细胞的增殖,促进细胞凋亡,而anti-miR-143促进HeLa细胞增殖,抑制细胞凋亡;高表达的miR-143抑制Bcl-2蛋白的表达,anti-miR-143增加Bcl-2蛋白的表达量,而Bcl-2 mRNA的变化很小;miR-143抑制Bcl-2 3'端的荧光素酶的活性,突变miR-143与Bcl-2的预测结合位点后,荧光素酶的活性恢复。结论 MiR-143至少部分通过打靶Bcl-2抑制宫颈癌HeLa细胞增殖,并且促进HeLa细胞凋亡。     

以人载脂蛋白B为靶点的基因表达下调剂筛选模型的建立与应用

摘要：目的 构建以人ApoB为靶点的基因表达调节剂的高通量筛选模型,筛选apoB基因表达下调剂。方法 以人基因组 DNA为模板,通过PCR扩增apoB基因上游的启动子序列,将扩增的DNA片段克隆至荧光素酶报告基因质粒pGL4.17,采用脂质 体介导的方法将重组质粒转染人肝癌细胞HepG2,经G418抗性筛选,获得稳定转染细胞株。应用槲皮素对筛选模型进行评价, 进而基于检测荧光素酶的表达活性变化筛选人apoB基因表达下调剂。结果 PCR扩增得到人apoB基因上游的启动子序列,构建 完成相应的重组荧光素酶报告基因质粒pGL4-apoB-P,建立了稳定转染细胞株ApoB-Luc HepG2。以槲皮素为阳性化合物进行模 型评价,Z'因子为0.77,符合高通量筛选的要求。应用该模型对5688个微生物发酵液粗提物进行筛选,获得了2株阳性菌株。 结 论 建立了人apoB基因表达下调剂筛选模型,并应用于微生物来源样品的筛选。     

三联组氨酸核苷酸结合蛋白2启动子报告基因质粒的构建和活性鉴定

目的 三联组氨酸核苷酸结合蛋白2(Hint2,histidine triad nucleotide binding protein 2)在肝癌组织中低表达并与临床病理分期和病人预后密切相关,为研究Hint2的基因表达调控,构建人Hint2启动子荧光素酶报告基因质粒并鉴定活性.方法 提取人基因组DNA,以其为模板,将含有Hint2启动子的不同长度的片段插入荧光素酶质粒pGL3-basic,后与β-半乳糖苷酶共转染HeLa细胞,转染后24h通过β-半乳糖苷酶实验检测转染效率,通过荧光素酶实验检测转录活性.结果 质粒pGL3-h1(-6--463,457bp),pGL3-h2(-6--1255,1249bp)构建成功后,与 β-半乳糖苷酶共转染人子宫颈癌HeLa细胞.转录活性=荧光素酶值/β-半乳糖苷酶值,结果 显示pGL3-basic荧光素酶值/β-半乳糖苷酶值为147.3272,而pGL3-h1为67936,pGL3-h2为64234.19.空质粒与pGL3-h1,pGL3-h2之间差异具有统计学意义,而pGL3-h1,pGL3-h2之间差异不具有统计学意义.结论 Hint2位于转录起始位点上游-6至--463之间的启动子区域具有强转录活性.     

毒蕈胆碱M_1受体激动剂的高通量筛选模型

目的　建立毒蕈碱样胆碱M1 受体激动剂的高通量筛选模型 ,以此模型进行M1 受体激动剂筛选。方法　将M1 受体基因质粒 (M1 /pCDNA3 1 )与报告基因质粒 (3×CRE/ 3×MRE/SRE LUC)按 1∶5的比例共转染HEK2 93 ,建立了一个稳定的M1 受体激动剂报告基因筛选细胞株。配体与细胞表面M1 受体结合后 ,激活相应的信号通路 ,调节报告基因的表达 ,通过测定荧光酶素报告基因表达水平的变化 ,评估配体激活M1 受体的生物活性。结果　通过对筛选条件 ,如细胞数目、荧光素酶表达时间、底物浓度的优化 ,建立了可靠的筛选方法 ,并对多种抗衰老中药水提物进行了筛选 ,找到 3种对M1 受体有活性的中药。结论　该系统能准确、稳定、有效地应用于M1 受体激动剂的高通量筛选     

SARI基因真核表达载体的构建及稳定转染HeLa细胞系的建立

目的构建人SARI基因真核表达载体,并建立稳定转染的HeLa细胞系。方法采用RT-PCR技术从正常人外周血单个核细胞cDNA文库中扩增SARI基因序列,连接插入至pCMV-N-Flag真核表达载体,并对重组质粒进行酶切及测序鉴定;阳离子聚合物介导重组质粒转染HeLa细胞后,用G418抗生素筛选稳定转染的细胞系。间接免疫荧光检测Flag-SARI融合蛋白在HeLa细胞系中的表达定位。RT-PCR及Western blot检测SARI mRNA及蛋白的表达变化。结果双酶切和DNA测序表明pCMV-Flag-SARI真核表达质粒构建成功。经G418筛选后,RT-PCR和Western blot表明,转染重组质粒的HeLa细胞系中SARI mRNA及蛋白的表达明显升高。间接免疫荧光结果显示,Flag-SARI融合蛋白在HeLa细胞系的胞质和胞核中均有表达,且胞质荧光信号强于胞核。结论成功构建pCMV-Flag-SARI真核表达载体,表达的FlagSARI蛋白主要定位于HeLa细胞系的胞质中。     

MiR-106b对子宫肌瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及与SULT2A1的靶向关系

摘要：目的:探讨微小RNA（miR）-106b在子宫肌瘤细胞增殖、侵袭和凋亡中的作用与潜在机制。方法:将体外培养的人子宫肌瘤细胞分为阴性对照（NC）组（转染miR-106b模拟物阴性对照）、miR-106b组（转染miR-106b模拟物）、反义（anti）-NC组（转染miR-106b抑制剂阴性对照）和anti-miR-106b组（转染miR-106b抑制剂）,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测各组细胞中miR-106b的表达,噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率,平板克隆实验检测细胞的克隆形成能力,Transwell小室检测细胞侵袭,流式细胞仪检测细胞凋亡;生物信息学软件预测、双荧光素酶报告基因实验检测miR-106b和磺基转移酶2A1（SULT2A1）的靶向关系,免疫印迹（Western blotting）法检测miR-106b对SULT2A1蛋白的调控作用。结果:与NC组比较,miR-106b组细胞中miR-106b的表达水平、细胞存活率、克隆形成率、侵袭细胞数均明显升高,细胞凋亡率和SULT2A1蛋白的表达水平均明显降低（P<0.05）;与anti-NC组比较,anti-miR-106b组细胞中miR-106b的表达水平、细胞存活率、克隆形成率、侵袭细胞数均明显降低,细胞凋亡率和SULT2A1蛋白的表达水平均明显升高（P<0.05）。生物信息学软件Target Scan预测到miR-106b与SULT2A1 3’UTR存在互补的结合位点;双荧光素酶报告基因实验证实SULT2A1是miR-106b的靶基因。结论:miR-106b可促进子宫肌瘤细胞增殖、侵袭并抑制其凋亡,其作用机制可能与靶向调控SULT2A1表达有关。     

由一株真菌产生的抑制血管细胞粘附分子-1基因表达的活性物质的研究

以血管细胞粘附分子－1（VCAM－1）基因为靶位点，使用含有荧光素酶报告基因的转染细胞株筛选模型M－4细胞从微生物的代谢产物中高通量筛选能够抑制VCAM－1基因表达的生物活性物质，以期找到能够治疗诸如类风湿为等免疫性疾病的新型药物。在筛选过程中使用有机溶媒萃取、ODS反相柱层析、HPLC制备等方法，从真菌FO－5897的发酵液中分离到 了一个对侧活用细胞株的荧光素酶报告基因的表达有中等强度抑制 作用的化合物，其IC50为13．8μmol/L，经各种理化性质及^1H-NMR分析确定该化合物与文献报道的是具有降血脂和抗癌作用的化合物Ascofuranone的结构相同。     

人寡肽转运体1转染MDCK细胞与转染HeLa细胞的比较研究

目的筛选出更适宜的转染受体细胞,提高构建人寡肽转运体1(human peptide transporter 1,hPepT1)高表达细胞系的效率。方法利用Lipofectamine~(TM) 2000转染试剂将pcDNA3.1(+)-hPepT1质粒分别转染进MDCK细胞与HeLa细胞,并进行单克隆细胞的挑选和扩大培养。通过qRT-PCR与Western blot技术来检测两种受体细胞中hPepT1 mRNA与蛋白的表达水平,并利用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)对两种单克隆转染细胞的hPepT1典型底物甘氨酰肌氨酸(Glysar)摄取能力进行考察。结果 MDCK细胞与HeLa细胞转染后,hPepT1 mRNA与蛋白表达水平以及Glysar的摄取能力均明显高于其野生型细胞(P<0.05);虽然Glysar在HeLa细胞中的摄取量高于MDCK细胞,但MDCK-hPepT1细胞中hPepT1 mRNA与蛋白表达水平以及Glysar的摄取能力却高于HeLa-hPepT1细胞。结论在hPepT1稳定高表达转染细胞模型的构建中,为提高hPepT1的转染效率,从而获得更高效的转染细胞模型,以MDCK细胞作为转染的受体细胞可能是更为适宜的选择。     

P53 对蛋白激酶 R 和宫颈癌 HeLa 细胞生物学行为的影响

【摘要】 目的 探讨 P53 蛋白对蛋白激酶 R（PKR）表达和活性以及对宫颈癌 HeLa 细胞生物学行为的影响。方法 构建过表达 p53 基因的重组质粒 pEGFP-C1/p53, 转染 HeLa 细胞, 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测 pEGFP-C1/p53 转染组、空质粒 pEGFP-C1 转染组及空白对照组（仅加入转染试剂）p53 及 PKR mRNA 的表达; 采用 Western Blot 法检测上述 3 组中 P53、 PKR、 磷酸化型 PKR(p-PKR), PKR 下游底物真核细胞翻译启始因子 2α （eIF2α）的磷酸化型 p-eIF2α的表达; 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测 HeLa 细胞增殖活性变化, Transwell 侵袭实验检测 HeLa 细胞侵袭能力变化。 结果 pEGFP-C1/p53 转染组 p53 及 PKR mRNA 的相对表达量高于 pEGFP-C1 转染组和空白对照组（均 P＜ 0.05）, pEGFP-C1 转染组和空白对照组比较, 差异无统计学意义; pEGFP-C1/p53 转染组 P53、PKR、p-PKR 及 p-eIF2α蛋白的相对表达量高于 pEGFP-C1 转染组和空白对照组（均 P＜ 0.05）, pEGFP-C1 转染组和空白对照组比较, 差异无统计学意义; pEGFP-C1/p53 转染组 HeLa 细胞增殖活性及侵袭能力均显著低于 pEGFP-C1 转染组和空白对照组（ 均 P＜ 0.05）, pEGFP-C1 转染组和空白对照组比较, 差异无统计学意义。 结论 P53 能上调 PKR 的表达及活性, 激活 PKR/eIF2α信号通路, 抑制宫颈癌 HeLa 细胞增殖及侵袭。     

IL-37 对宫颈癌HeLa 细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨炎症抑制因子IL-37 对宫颈癌HeLa 细胞株增殖和凋亡的影响。方法　将携带有目的基因IL-37 的过表达载体转染入体外培养的HeLa 细胞，用MTT 法检测细胞的增殖情况，流式细胞仪测定细胞周期及凋亡率，以野生型HeLa 细胞以及转染空载体的HeLa 细胞作为阴性对照和空载体对照。结果　荧光显微镜观察结果显示IL-37 质粒成功转染HeLa 细胞。MTT 检测结果显示，转染后12 h 至96 h，转染组OD 值明显低于空载体对照组（P<0.01），而空载体对照组和阴性对照组的OD 值无明显差异；流式细胞仪检测测结果显示，转染组细胞早期凋亡率较空载体对照组显著升高（P<0.05），而空载体对照组和阴性对照组的早期凋亡率无显著性差异。结论　过表达IL-37 的HeLa 细胞株构建成功。IL-37 可抑制宫颈癌HeLa 的增殖并诱导其凋亡。     

应用假病毒技术研究HIV-1复制抑制剂

建立以HIV-1复制为靶点的细胞水平假病毒药理筛选模型，并运用该模型筛选化合物库中随机选取的化合物。细胞水平的HIV-1假病毒药理筛选模型是应用水泡性口膜炎病毒的外壳糖蛋白(vesicular stomatitis virus glycoprotein，VSV-G)包装HIV-1核心建立的，简称VSVG/HIV模型。细胞被VSVG/HIV感染后，病毒携带的报告基因的表达水平(荧光素酶活性或GFP阳性细胞比例)反映了HIV-1的复制水平。对HIV-1复制有抑制作用的化合物应用VSVG/MLV模型对其特异性地进一步检测。被感染细胞中报告基因的表达水平与病毒稀释度呈显著的剂量依赖效应。阳性药物齐多夫定(zidovudine，AZT)、拉米夫定(lamivudine，3TC)、去羟基苷(didanosine，DDI)可剂量依赖性地抑制HIV-1的复制，其IC₅₀分别为48.5 nmol·L^-1、 0.13 μmol·L^-1和1.73 μmol·L^-1，与文献报道一致。在随机筛选的500个化合物中有3个化合物可以抑制HIV-1的复制，IC₅₀分别为1.92、 5.38和3.39 μmol·L^-1，而对MLV的复制无影响。VSVG/HIV假病毒系统是一种安全、有效的针对HIV-1复制的药理筛选模型。当将此模型与VSVG/MLV模型联合使用时，可判断化合物作用的特异性。实验表明：3个化合物，2-甲硫基-5-(4-甲基苯并)酰胺基-1,3,4-噻二唑(化合物A)、N-(3-羟基苯基)-2-(4-异丁基苯基)丙酰胺(化合物B)和N-(4-甲基吡啶基)-4-甲基苯磺酰胺(化合物C)可以特异性抑制HIV-1的复制。     

基于双荧光素酶报告基因系统的人源SREBP1基因启动子的活性研究

目的 构建固醇调节元件结合蛋白 1（SREBP1）启动子双荧光素酶报告基因表达载体,为研究针对 SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定基础。方法 利用生物信息学软件,对SREBP1基因5′端上游5 000 bp序 列进行启动子预测与分析。应用 Gibson Assembly 方法构建启动子双荧光素酶载体,并将构建成功的 pGL3- SREBP1-pro重组质粒和内参质粒pRL-SV40共转染肝癌HepG2细胞并给予天然抑制剂大黄素,检测SREBP1转录活 性的抑制效果。结果 SREBP1基因5′端上游2 000 bp区域内有启动子特征序列,存在转录因子结合位点;重组质粒 经酶切及测序鉴定证实为阳性克隆,瞬时转染肝癌HepG2细胞后经双荧光素酶报告基因系统检测,所克隆的片段序 列具有启动子活性,该活性可被大黄素所抑制。结论 成功构建了pGL3-SREBP1-pro双荧光素酶报告基因表达载 体,并证实其活性,可为进一步用于针对SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定     

mGM-CSF-mMIP-3α重组质粒的构建、表达及鉴定

目的:构建pCDNA3.1mGM-CSF-mMIP-3α重组质粒,为mGM-CSF-mMIP-3α基因治疗肿瘤的研究奠定基础.方法:利用本实验室保存的pCDNA3.1mGM-CSF和pCDNA3.1mMIP-3α质粒,采用分子生物学技术构建了pCDNA3.1mGM-CSF-mMIP-3α重组质粒.用PCR、酶切进行鉴定,然后用脂质体转染B16细胞,用G418筛选后通过ELISA和Western blot检测该融合蛋白.结果:重组质粒中含有mGM-CSF-mMIP-3α基因,转染B16细胞后,其表达产物能分泌到肿瘤细胞外,分泌到细胞外的产物用ELISA和Westernblot检测证明能与特异性mGM-CSF和mMIP-3α抗体结合.结论:成功构建含mGM-CSF-mMIP-3α真核表达重组质粒,有助于进一步研究其抗肿瘤作用.     

VSVG/HIV-1_(NL4-3)Luc假病毒筛选抗HIV-1药物的条件优化及应用

目的建立并优化VSVG/HIV-1_(NL4-3)Luc假病毒筛选抗HIV药物药效模型。方法参照Promega公司的荧光素酶活性分析系统,比较VSVG/HIV-1_(NL4-3)Luc对4种不同细胞的感染力。通过采用3种不同实验条件对不同类型HIV-1上市药物进行活性评价,进一步验证了该模型的可行性与有效性。最后,应用该系统对特定靶点化合物进行筛选,并与HIV-1_(ⅢB)病毒筛选体系所得结果进行比较。结果 VSVG/HIV-1_(NL4-3)Luc对CRFK细胞的感染力最强,报告基因的表达水平与加入的病毒量呈剂量依赖关系。比较3种实验条件下不同阳性药物抑制VSVG/HIV-1_(NL4-3)Luc的半数有效剂量浓度EC50,发现第3种条件最优。而用该假病毒对合成化合物进行筛选,发现其EC50与病毒HIV-1_(ⅢB)所得EC_(50)基本一致。结论成功建立并优化了基于VSVG/HIV-1_(NL4-3)Luc假病毒的抗HIV药物筛选系统。     

以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立

目的通过双荧光素酶报告基因检测系统建立以胰岛素诱导基因2(insulin-induced gene 2,Insig-2)启动子为靶点的药物筛选模型。方法将人Insig-2基因启动子序列克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,构建重组质粒pGL3-Insig-2并与内参质粒pRL-TK瞬时共转染工具细胞,通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化反映Insig-2基因启动子启动转录的活性,并对共转染质粒比例、工具细胞选择等条件进行探索和优化,相关药物处理进行验证。结果成功构建了重组质粒pGL3-Insig-2;确认pGL3-Insig-2:pRL-TK共转染比例为4∶1,确定3T3-L1细胞为工具细胞;1,25-(OH)2D3、小檗碱和姜黄素均能明显增强Insig-2基因启动子活性。结论成功建立了以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型,为筛选新型调脂药奠定基础。