绿脓杆菌制剂对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响

Objective To investigate the effects of Pseudomonas aeruginosa vaccine (PA) on proliferation and invasiveness of the hepatocellular carcinoma cell line MHCC97L with metastatic potential. Methods Proliferation, growth curve, plate efficiency, flow cytometry, transwell invasion assay, cell motility assay, scarification test, vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metalloproteinase-2 (MMP2) protein activity were evaluated after cells were treated with PA at various concentrations. Results PA can inhibit the proliferation and plate efficiency of MHCC97L cell markedly in a dose-dependent manner. The IC50 of cells treated with PA for 48 h and 72 h was 3.1 ×108/ml and 1.9 × 108/ml, respectively. The doubling time increased and plate efficiency decreased gradually when cells treated with 0.5 × 108/ml, 1 × 108/ml and 2 × 108/ml PA (P＜0.01). PA could induce cell cycle arrest at the G1 phase in a dose-dependent manner by flow cytometric analysis. The average amount of invading cell per field in cell invasion assay and motility assay were 4. 8 ± 1.3 and 8. 8±2.2 when cells treated with 1× 108/ml PA, which was significantly lower than that of control group (8. 6±2. 1 and 15. 6±1.2 ) (P＜0.01) Scarification test showed that the metastatic ability of cells treated with 1 × 108/ml PA significantly lower than that in the control group. Comparison between cells treated with 1 × 108/ml PA and control group, no remarkable difference was found regarding expression of VEGF and MMP2 in supernatant of cell culture. Conclusion PA can inhibit proliferation and plate efficiency of HCC cell line MHCC97L, which is in part mediated by the cell cycle arrest at the G1 phase. PA could inhibit invasiveness of HCC cell line MHCC97L, which is unrelated to the VEGF and MMP2 protein activity.     

绿脓杆菌制剂对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响

Objective To investigate the effects of Pseudomonas aeruginosa vaccine (PA) on proliferation and invasiveness of the hepatocellular carcinoma cell line MHCC97L with metastatic potential. Methods Proliferation, growth curve, plate efficiency, flow cytometry, transwell invasion assay, cell motility assay, scarification test, vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metalloproteinase-2 (MMP2) protein activity were evaluated after cells were treated with PA at various concentrations. Results PA can inhibit the proliferation and plate efficiency of MHCC97L cell markedly in a dose-dependent manner. The IC50 of cells treated with PA for 48 h and 72 h was 3.1 ×108/ml and 1.9 × 108/ml, respectively. The doubling time increased and plate efficiency decreased gradually when cells treated with 0.5 × 108/ml, 1 × 108/ml and 2 × 108/ml PA (P＜0.01). PA could induce cell cycle arrest at the G1 phase in a dose-dependent manner by flow cytometric analysis. The average amount of invading cell per field in cell invasion assay and motility assay were 4. 8 ± 1.3 and 8. 8±2.2 when cells treated with 1× 108/ml PA, which was significantly lower than that of control group (8. 6±2. 1 and 15. 6±1.2 ) (P＜0.01) Scarification test showed that the metastatic ability of cells treated with 1 × 108/ml PA significantly lower than that in the control group. Comparison between cells treated with 1 × 108/ml PA and control group, no remarkable difference was found regarding expression of VEGF and MMP2 in supernatant of cell culture. Conclusion PA can inhibit proliferation and plate efficiency of HCC cell line MHCC97L, which is in part mediated by the cell cycle arrest at the G1 phase. PA could inhibit invasiveness of HCC cell line MHCC97L, which is unrelated to the VEGF and MMP2 protein activity.     

消炎痛对人肝癌MHCC97L细胞增殖和细胞周期的影响

目的 观察消炎痛(Indomethacin)对有转移潜能的人肝癌MHCC97L细胞增殖和细胞周期的影响.方法 采用0.1、0.2、0.5 mmol/L消炎痛分别作用于MHCC97L细胞,观察细胞增殖、克隆形成率、形态学、生长曲线、流式细胞术分析(FCM).结果 消炎痛明显抑制MHCC97L细胞增殖和克隆形成,呈良好的剂量.效应关系.0.1、0.2、0.5 mmol/L消炎痛处理组细胞增殖抑制率依次升高,克隆形成率依次降低(P均<0.01),镜下可见明显的形态学改变.其中,0.5 mmol/L消炎痛组24、48、72 h细胞增殖抑制率分别为50.6%、47.1%、43.4%;集落形成率为(0.00±0.00)%.0.1、0.2、0.5 mmol/L消炎痛处理组细胞倍增时间分别为110.1、199.3、-614.2 h,与对照组(58.6 h)比较,0.1、0.2 mmol/L消炎痛处理组细胞倍增时间分别延长了2.17倍和3.40倍,而0.5mmol/L消炎痛处理组第6天的细胞均数[(3.4±0.4)×104个]少于初始细胞数(4×104个)结果细胞倍增时间为负值而无法计算.FCM显示,G1期细胞比例随消炎痛浓度增加而增加,S+G2期细胞比例随消炎痛浓度增加而降低(P均<0.01).结论 在一定条件下,消炎痛可抑制人肝癌MHCC97L细胞增殖和克隆形成,其作用部分是通过使细胞周期阻滞在G1期实现.     

加热联合吲哚美辛对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 观察水浴加热联合吲哚美辛对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响.方法 42℃水浴加热前2h加入0.2 mmol/L吲哚美辛,加热组不加药,对照组不加热、不加药,其他处理相同并在同一时间点观察.在不同的时间观察细胞增殖、生长曲线、克隆形成率、流式细胞术(FCM)分析细胞周期、侵袭、运动、血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶(MMP)-2蛋白表达[酶联免疫吸附试验(ELISA)法].结果 与对照组比较,加热+吲哚美辛明显抑制MHCC97L细胞增殖(P＜0.01),其最大抑制效应为加热后48 h(53.6％),细胞倍增时间延长了2.07倍;加热+吲哚美辛组48、96 h的细胞集落形成率均明显降低(P ＜0.01);FCM显示,吲哚美辛能逆转加热对细胞周期的影响,加热+吲哚美辛组48 h和96 h的G1期细胞比例均明显升高,S+G2期细胞比例均明显降低(P＜0.05).加热+吲哚美辛组48 h和96 h相同数量的细胞穿过人工基底膜到达Transwell小室膜背面的细胞平均数(侵袭实验)和穿过Transwell小室膜到达背面的MHCC97L细胞平均数(运动实验)均明显低于加热组(P＜0.01);ELISA法检测发现,加热+吲哚美辛组48、96 h的分泌量均明显低于加热组(P＜0.05).结论 吲哚美辛抑制体外加热后肝癌细胞的增殖,其作用和抑制细胞进入DNA合成期和分裂期有关;进一步抑制其侵袭运动能力,其作用和MMP-2、VEGF表达降低有关.     

人肝癌细胞器官特异性转移与基质金属蛋白酶分泌的关系

目的　探讨不同转移潜能的人原发性肝癌细胞系基质金属蛋白酶 (MMPs)分泌与器官特异性转移的关系。方法　将C5 7BL/6小鼠的肺、脾组织粗提物与高低转移潜能的人肝癌细胞系MHCC97 H和MHCC97 L共培养 ,明胶酶谱法检测其分泌上清MMPs表达水平 ,并用荧光免疫染色法比较MMP 9的表达。结果　在无血清培养液培养条件下 ,MHCC97 H和MHCC97 L细胞均分泌较少MMP 9(2 .1± 0 .2 ,1.4± 0 .1) ,不分泌MMP 2 ;但MHCC97 H细胞分泌活性型MMP 9(17.4± 2 .2 )显著高于MHCC97 L细胞 (6.7± 0 .2 ,P <0 .0 0 1)。与肺组织粗提物孵育后 ,MHCC97 H和MHCC97 L细胞分泌MMP 9、活性型MMP 9和MMP 2均显著高于无血清培养液条件下MMPs分泌 (P <0 .0 0 1) ;MHCC97 H细胞分泌MMP 9(18.8± 1.2 )、活性型MMP 9(10 0 .1± 1.1)、MMP 2 (2 2 .4± 1.3 )均显著高于MHCC97 L细胞 (7.8± 0 .3 ,40 .8± 2 .2 ,8.2± 0 .4,P <0 .0 0 1)。脾组织粗提物孵育后的MHCC97 H和MHCC97 L细胞不分泌MMPs。荧光免疫细胞化学法检测MMP 9表达位于MHCC97 H细胞核周和细胞浆 ,而在MHCC97 L细胞未见明显的MMP 9表达。结论　不同转移潜能的人肝癌细胞分泌MMPs差异与其侵袭转移能力相关。肺组织粗提物促进不同转移潜能的人肝癌细胞分泌MMPs可能与其器官特异性     

二氢杨梅素对肝癌细胞黏附、侵袭及迁移的抑制作用及机制

目的：研究二氢杨梅素（DHM）对肝癌细胞黏附、侵袭和迁移能力的影响及其可能机制。 方法：用不同浓度DHM处理肝癌MHCC97L细胞后,分别检测细胞的黏附能力、迁移与侵袭能力,以及E-cadherin、MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表达。 结果：与空白对照细胞比较,DHM处理后的MHCC97L细胞黏附力明显降低、侵袭与迁移力明显减弱（均P<0.05）;E-cadherin表达明显上调,而MMP-9、VEGF蛋白表达明显下调的水平（均P<0.05）,但MMP-2蛋白的表达无明显改变（均P>0.05）。 结论：DHM可能通过调控E-cadherin、MMP-9和VEGF蛋白的表达抑制肝癌细胞的黏附、迁移和侵袭。     

TNF-α对肝癌细胞VEGF和MMP-9表达的影响

目的研究肿瘤坏死因子α(TNFα)对肝癌HepG2细胞血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶9(MMP9)表达的影响。方法不同浓度(10、102、103、104及105U/L)TNFα作用于HepG2细胞不同时间(24、48及72h)后在相差显微镜下观察细胞形态变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖活性;双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)测定细胞培养上清液中的VEGF和MMP9蛋白含量;免疫细胞化学方法观察细胞浆中的VEGF和MMP9蛋白表达;逆转录酶聚合酶链反应(RT PCR)半定量法测定HepG2细胞VEGF和MMP9mRNA含量。结果①不同浓度的TNFα作用后,HepG2细胞形态无明显变化,细胞增殖活性比较,差异无显著性意义(P>0.05);随各浓度TNFα作用时间延长,HepG2细胞形态无明显变化,但细胞增殖活性逐渐增高(P<0.05)。②不同浓度的TNFα作用不同时间后,细胞培养上清液中的VEGF和MMP9蛋白含量明显增加(P<0.05),且存在时间依赖性,并在TNFα浓度小于或等于104U/L时存在浓度依赖性;HepG2细胞VEGF和MMP9mRNA表达亦明显升高(P<0.05),其促进作用的变化趋势同VEGF和MMP9蛋白含量结果一致,但不存在时间依赖性。③104U/L的TNFα作用48h后,HepG2细胞浆中的棕色颗粒明显增加。结论TNFα能够在核酸和蛋白水平上促进肝癌细胞合成并分泌VEGF和MMP9,从而间接促进肿瘤血管生成。     

消炎痛抑制肝细胞肝癌生长转移的研究

目的 观察消炎痛(Indomethacin)对有转移潜能的人肝癌MHCC97L细胞增殖侵袭的影响和对裸鼠肝癌生长和转移的抑制作用.方法 (1)体外实验:采用0.2 mmol/L的消炎痛分别作用于MHCC97L细胞,观察细胞增殖、侵袭实验、运动实验和血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白表达[酶联免疫吸附试验(ELISA)].(2)体内实验:建立转移性人肝癌裸鼠原位模型后,将裸鼠随机分为对照组和消炎痛组.6周后处死动物,测量肿瘤体积,计算抑瘤率、肺转移灶数目及肺转移率.免疫组织化学方法检测VEGF、MMP-2、环氧合酶-2(COX-2)蛋白的表达.结果 (1)体外实验:0.2mmol/L消炎痛明显抑制MHCC97L细胞增殖(P值均＜0.01),消炎痛组穿过人工基底膜(侵袭实验)和上室底膜(运动实验)的细胞数分别为2.2±1.3和4.4±1.1,明显低于对照组(11.4±1.9和12.8±1.8,P值均＜0.01);ELISA法检测发现,消炎痛组VEGF蛋白和MMP-2蛋白含量和对照组比较明显降低(P值均＜0.01).(2)体内实验:对照组、消炎痛组肿瘤体积分别为(1700 ±422)mm3 和(1170±585)mm3(P＜0.05),肺转移率分别为75%和50%(P＞0.05),平均肺转移灶数目分别为2.92±2.07和1.33±1.56(P＜0.05);与对照组比较,消炎痛组的抑瘤率为31.2%.免疫组织化学染色显示,消炎痛组VEGF、MMP-2、COX-2蛋白的表达和对照组比较均有降低(P值均＜0.01).结论 在一定条件下,消炎痛可抑制肝细胞肝癌的生长转移,其作用和抑制VEGF蛋白和MMP-2蛋白的表达有关.

Abstract：

Objective To study the effects of indomethacin on proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma (HCC) cell line MHCC97L with metastatic potential and the effect of indomethacin on the growth and metastasis of HCC. Methods (1) In vitro; Proliferation, Transwell invasion assay, cell motility assay, vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) protein activity were evaluated after cells were treated with 0. 2 mmol/L indomethacin. (2)In vivo: Mice bearing xenografts in the liver were randomly divided into control and indomethacin groups. At the end of sixth week, the mice were killed and tumor volume, inhibitory rate, immunohistochemistry assay (IHA) and metastasis were evaluated. Results (1)In vitro; 0. 2 mmol/L indomethacin could inhibit the proliferation of MHCC97L cells markedly (P ＜0. 01). The average amount of invading cells per field in cell invasion assay and motility assay was 2. 2 ± 1. 3 and 4.4 ± 1. 1 respectively in indomethacin group, significantly less than in control group ( 11. 4 ± 1. 9 and 12. 8 ± 1. 8 respectively, P ＜0. 01). The expression of VEGF and MMP-2 in cells treated with indomethacin was significantly lower than in control group (P ＜0. 01). (2)In vivo; Tumor volume, incidence and number of lung metastases in control and indomethacin groups were (1700 ±422) mm3 and (1170 ± 585) mm3 (P ＜ 0. 05), 75% and 50% ( P ＞ 0.05), 2. 92 ± 2. 07 and 1.33 ±1.56 (P＜0. 05) , respectively. Inhibition rate in indomethacin group was 31.2%. IHA showed that the expression of VEGF, MMP-2, and cyclooxygenase-2 ( COX-2) was down-regulated in indomethacin group (P ＜0.01). Conclusion Indomethacin could inhibit the growth and metastasis of HCC, which was in part mediated by down-regulation of VEGF and MMP-2.     

抗肝肠钙粘连蛋白单克隆抗体对肝癌细胞生物学行为的影响

目的 观察抗肝肠钙粘连蛋白(CDH17)单克隆抗体Lic5对肝癌细胞生物学行为的影响.方法 Western blot和实时定量聚合酶链反应(PCR)检测细胞株MHCC97H、MHCC97L、PLC/PRF/5及MIHA中CDH17的表达.噻唑蓝(MTT)比色法、细胞划痕法、Transwell法及平板克隆法检测Lic5对肝癌细胞生物学行为的影响.结果 CDH17仅在细胞株MHCC97H、MHCC97L中表达,Lic5可结合肝癌细胞表面的CDH17,并抑制CDH17表达.Lic5 50mg/L组、100mg/L组、小鼠IgG组4 d细胞增殖抑制率在MHCC97H为26.1%、43.6%、6.4%,MHCC97L为26.0%、40.7%、7.7%;Lic5100mg/L组、小鼠IgG组、磷酸盐缓冲液(PBS)组48h细胞迁移抑制率在MHCC97H为36.7%、8.4%、5.6%,MHCC97L为42.3%、10.2%、7.4%(P＜0.05);穿膜细胞数在MHCC97H为(39.20±9.56)、(106.50±7.56)、(96.60±13.02)个,MHCC97L为(26.00±8.61)、(86.00±10.26)、(90.40±12.04)(P＜0.05);克隆形成数在MHCC97H为(59.30±11.68)、(141.70±19.40)、(150.30±14.64),MHCC97L为(57.20±10.21)、(132.50±9.07)、(121.70±11.93)(P＜0.01).Lic5对PLC/PRF/5及MIHA细胞的生物学行为无明显影响.结论 单克隆抗体Lic5能够下调肝癌细胞CDH17表达,抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力.

Abstract：

Objective To investigate the effect of monoclonal antibody against liver-intestine cadherin (CDH17) on the cell proliferation, migration, invasion and colony formation of hepatocellular carcinoma cell lines. Methods Hepatocellular carcinoma cell lines MHCC97H, MHCC97L, PLC/PRF/5 and MIHA were examined for CDH17 expression by Western blotting and quantitative real-time polymerase chain reaction (PGR). The combination capacity between bepatocellular carcinoma cell lines and monoclonal antibody Lic5 was detected by the way of immunofluorescence staining. The cell lines were treated with Lic5, PBS and mouse IgG respectively. Methyl thiazol tetrazolium (MTT) assay, wound healing assay, Transwell invasion assay and colony formation assay were used to study the changes in cell proliferation, migration, invasion and colony formation of hepatocellular carcinoma cell lines. Results High expression level of CDH17 was detected in MHCC97H and MHCC97L cell lines. CDH17 protein level was down-regulated but there was no significant effect on CDH17 mRNA after treatment with Lie5 in MHCC97H and MHCC97L. Cellular growth rate of MHCC97H in Lic5 (50 mg/L), Lic5 ( 100 mg/L) and mouse IgG groups was decreased by 26. 1%, 43.6% and 6. 4%, and by 26. 0%, 40. 7% and 7. 7% in MHCC97L on the 4th day respectively (P ＜0. 05 ). The inhibition rate of cell migration at 48 h was 36. 7%, 8. 4% and 5.6% in Lic5 ( 100 mg/L), mouse IgG and PBS groups in MHCC97H, and 42. 3%, 10. 2% and 7. 4% in MHCC97L respectively ( P ＜ 0. 05 ). The number of invasion cells was ( 39. 20 t 9. 56),(106.50±7.56) and (96.60±13.02) in MHCC97H, and (26.00±8.61), (86.00±10.26) and (90.40±12.04) in MHCC97L in Lic5 (50 mg/L), Lic5 (100 mg/L) and mouse IgG groups, respectively (P ＜ 0. 05 ). The number of colony formation was ( 59. 30 ± 11.68 ), ( 141.70 ± 19. 40 ) and (150.30 ±14.64) in MHCC97H, and (57.20 ± 10.21), (132.50 ±9.07) and (121.70 ±11.93) in MHCC97L in Lie5 (50 mg/L), Lic5 (100 mg/L) and mouse IgG groups, respectively (P＜ 0. 01 ).There was no significant difference between Lic5 treatment groups and controls in PLC/PRF/5 and MIHA cell lines. Conclusion The anti-CDH17 monoclonal antibody Lic5 can down-regulate CDH17 expression and inhibit the cell proliferation, migration, invasion and colony formation in hepatocellular carcinoma cell lines.     

野菊花提取物对人肝癌MHCC97H细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察中药野菊花提取物(chrysanthemum indicum extact,CIE)对人肝癌MHCC97H 细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制.方法 体外培养人肝癌MHCC97H细胞,以0.4、0.8、1.2 mg/ml的CIE(实验1、2、3组)作用于MHCC97H细胞,并设立空白对照组.分别于药物作用24、48、72 h时,应用MTT法检测细胞增殖情况.于药物作用24 h时,用AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡、Rhol23检测细胞线粒体膜电位(△Ψm)变化;Western blot检测细胞色素C、Caspase-9、-3的蛋白表达.结果 三种浓度的CIE对MHCC97H细胞的增殖均有明显的抑制作用,且呈明显的时间和浓度依赖性.与对照组相比,各实验组MHCC97H细胞的凋亡率明显增高(P＜0.05),线粒体膜电位水平明显降低(P＜0.05),细胞色素C、Caspase-9和-3的蛋白表达显著增强(P＜0.05),以上各项均呈明显的量效关系.结论 野菊花提取物对肝癌MHCC97H的增殖具有抑制作用,这可能与药物诱导肝癌细胞凋亡有关.线粒体途径可能是CIE诱导MHCC97H细胞凋亡的主要机制之一.     

活化血管内皮生长因子受体1诱导肝癌细胞株MHCC97-H细胞上皮-间叶表型转化的分子机制

目的 探讨活化血管内皮生长因子受体1(VEGFR-1)诱导肝癌细胞株MHCC97-H细胞上皮-间叶表型转化(EMT)的分子机制.方法 将MHCC97-H细胞分为对照组(1％胎牛血清的DMEM培养)、PP2组(10 μmol/L PP2培养)、PBS组(10 μmol/L PBS培养)、VEGF-B组(50 μg/L的VEGF-B培养)、PP2+ VEGF-B组(10 μmol/L PP2和50 μg/L的VEGF-B培养)、PBS+ VEGF-B组(10 μmol/L PBS和50 μg/L VEGF-B培养).Westem blot法检测各组上皮标志物E-钙黏蛋白、α-连环蛋白和间叶标志物波形蛋白、N-钙黏蛋白的表达水平;细胞免疫荧光检测上述蛋白的表达部位;细胞侵袭和迁移试验检测各组MHCC 97-H细胞的侵袭和运动能力.组间比较采用t检验.结果 对照组、PP2组、PBS组、VEGF-B组、PP2+ VEGF-B组、PBS+ VEGF-B组的MHCC97-H细胞上皮标志物E-钙黏蛋白的表达分别为3.23±0.76、4.18±0.32、2.83 +0.65、2.06±0.15、6.12±0.08、1.36±0.54;α-连环蛋白的表达分别为3.01 +0.25、3.29+0.11、3.03±0.27、2.84+0.76、5.45±0.37、1.26±0.45;波形蛋白的表达分别为3.01±0.22、4.85±0.36、1.37±0.24、5.79±0.38、3.36±0.42、4.05±0.17;N-钙黏蛋白的表达分别为2.63±0.40、3.02±0.52、2.98±0.36、5.54±0.28、3.26±0.13、1.05±0.33.PP2组、PP2+ VEGF-B组的MHCC97-H细胞E-钙黏蛋白和α-连环蛋白表达明显上调,PP2+ VEGF-B组与VEGF-B组比较,差异有统计学意义(t=7.625,9.931,P＜0.05).PP2+ VEGF-B组的波形蛋白和N-钙黏蛋白的表达显著低于VEGF-B组(t=12.001,11.910,P＜0.05).VEGF-B处理6h后,VEGF-B组、PP2+ VEGF-B组、PBS+ VEGF-B组的MHCC97-H细胞迁移数量分别为19±l、5±2和16±1,VEGF-B组MHCC97-H细胞迁移数量显著多于PP2+ VEGF-B组(t=13.566,P＜0.05),PP2+ VEGF-B组中MHCC97-H细胞穿过Matrigel包被的改良侵袭小室的数量为4±2,显著少于VEGF-B组的16±l(t=12.350,P＜0.05).结论 VEGFR-1活化诱导MHCC97-H细胞发生EMT是由c-Src激酶信号转导通路介导的,c-Src作为该信号通路的关键因子之一可能是干预肝细胞癌侵袭和转移的有效靶点.     

小剂量阿司匹林协同干扰素-α抑制肝细胞肝癌生长转移的实验研究

目的 探讨小剂量阿司匹林协同干扰素-α(IFN-α)抑制肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)生长转移的作用及机制.方法 培养具有肺转移潜能的人MHCC97L肝癌细胞.将MHCC97L肝癌组织块种植于BALB/c nu/nu雄性裸鼠肝脏,建立人肝癌裸鼠原位模型.以不同剂量组合的阿司匹林和IFN-α作用于荷瘤裸鼠,测量肿瘤体积,计算肺转移灶数目及肺转移率.用MTT及明胶酶谱实验检测阿司匹林对MHCC97L细胞增殖及金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP-2)活性的影响.用Western Blot及ELISA检测细胞及血清MMP-2及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白水平.结果 对照组肿瘤体积为(3.12±0.85)cm3,肺转移率为66.7％.大剂量阿司匹林[45 mg/(kg· d)]治疗组肿瘤体积为(1.89±0.88)cm3 (P＞0.05),肺转移率为58.3％ (P＞0.05).而大剂量IFN-α[1.5×107/(kg·d)]治疗组、大剂量IFN-α+大剂量阿司匹林治疗组、小剂量IFN-α [7.5×106/(kg·d)]+小剂量阿司匹林15 mg/(kg· d)]治疗组肿瘤体积分别为(0.69±0.40)cm3、(0.55±0.31)cm3、(0.40±0.43)cm3,均显著低于对照组(P＜0.05),肺转移率均为0(P＜0.05).2 mmol/L阿司匹林对MHCC97L细胞增殖无显著影响(P＞0.05),但可抑制其MMP-2的活性及VEGF的水平.小剂量IFN-α+小剂量阿司匹林治疗组裸鼠血清MMP-2及VEGF显著降低(P＜0.05).结论 小剂量阿司匹林可协同IFN-α抑制HCC生长转移,抑制MMP-2和VEGF的活性和表达是其重要作用机制之一.     

EphA3通过调控VEGF参与肝癌细胞侵袭的机制

目的探讨促红细胞生成素肝细胞受体A3（EphA3）参与肝癌细胞侵袭的作用机制。方法培养人肝细胞HL-7702和肝癌细胞株HepG2和NHCC97H。采用siRNA干扰的方法抑制肝癌细胞中EphA3的表达。设立未处理组（未处理肝癌细胞）,对照组（加入对照siRNA）和siRNA干扰组（加入siRNA干扰EphA3）。用RT-PCR和Westernblot法检测EphA3的表达;用Transwell小室检测不同处理后的HepG2和MHCC97H细胞的侵袭能力;采用Westernblot和ELISA法检测VEGF蛋白表达和活力的变化情况。多组比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD—f检验。结果HL-7702、HepG2和MHCC97H中EphA3mRNA的相对表达量分别为0．94±0．13、1．76±0．16和3．62±0．14;EphA3蛋白的相对表达量分别为0．96±0．12、1．59±0．11和3．82±0．11,非肿瘤细胞与肝癌细胞中EphA3表达比较,差异有统计学意义（t=2．511,6．437;2．321,6．895,P〈0．05）。RT—PCR法检测HepG2细胞系中未处理组、对照组、siRNA干扰组EphA3mRNA的相对表达量分别为0．95±0．11、0．96±0．12和0．31±0．15,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=4．051,P〈0．05）;MHCC97H细胞中EphA3mRNA的相对表达量分别为0．97±0．16、0．95±0．14和0．40±0．11,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=5．237,P〈0．05）;Westernblot法检测3组HepG2细胞中EphA3蛋白的相对表达量分别为0．97±0．16、0．95±0．15和0．32±0．17,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=4．145,P〈0．05）;MHCC97I-I细胞中EphA3蛋白的相对表达量分别为0．95±0．11、0．96±0．12和0．38±0．17,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=4．327,P〈0．05）。采用体外侵袭实验,检测3组穿透的细胞数量,HepG2细胞系细胞数量分别为（111±4）个／10HPF、（109±5）个／10HPF和（51±3）个／IOHPF,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=7．582,P〈0．05）;MHCC97H细胞系细胞数量分别为（402±6）个／10HPF、（397±7）个／10HPF和（152±7）个／10HPF,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=9．479,P〈0．05）。Westernblot法检测HepG2细胞系中3组VEGF蛋白的相对表达量分别为0．98±0．11、0．96±0．13和0．57±0．11,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=3．167,P〈0．05）;Westernblot法检测MHCC97H细胞系中3组VEGF蛋白的相对表达量分别为0．97±0．14、0．98±0．12和0．34±0．15,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=4．278,P〈0．05）。ELISA法检测HepG2细胞系中3组VEGF蛋白的相对活力OD值分别为0．96±0．15、0．94±0．11和0．47±0．13,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=3．981,P〈0．05）;NHCC97H细胞中VEGF蛋白的相对活力OD值分别为n98±0．12、0．97±0．12和0．38±0．14,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=4．059,P〈0．05）。结论EphA3可能是通过调控VEGF蛋白表达和活性来实现肝癌细胞的侵袭,提示EphA3可作为肝癌治疗的新靶点。     

HGF／Met通路对肝癌细胞株MHCC97-H干细胞样表型的影响

目的观察HGF／Met通路对肝癌细胞株MHCC97-H干细胞样表型的影响,探讨其可能的作用机制。方法体外培养肝癌细胞株Huh7和MHCC97-H,采用细胞免疫荧光染色技术筛选高表达Met的肝癌细胞株MHCC97-H,将其分为4组：空白组（不做处理）、HGF刺激组（50μg/L HGF）、抑制组（50μg／LHGF＋1mol／LHGF抑制剂PHA665752）和表皮生长因子（EGF）／成纤维细胞生长因子（FGF）刺激组（50μg/LHGF＋20μg/LEGF＋20μg/LFGF）。Westernblot检测前3组MHCC97-H细胞中Met和磷酸化Met（p-Met）蛋白的表达。培养24h后光镜下观察前3组细胞形态学变化。克隆球形成实验检测4组细胞克隆球形成能力。荧光实时定量PCR检测空白组和HGF刺激组不同时间点（2、4、8、16、24h）MHCC97-H细胞中多能干细胞相关基因表达变化。计量资料采用x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析和重复测量的方差分析,两两比较采用LSD—t检验。结果细胞免疫荧光染色检测结果显示：肝癌细胞株MHCC97-H与Huh7细胞比较．前者高表达Met,将其作为后续研究对象。Westernblot检测结果显示：空白组、HGF刺激组和抑制组细胞中Met蛋白的相对表达量分别为0．44±0．04、0．37±0．03和0．41±0．04,3组比较,差异无统计学意义（F=2．31,P〉0．05）。而3组细胞中p-Met蛋白的相对表达量分别为0．020±0．010、0．070±0．020和0．010±0．000,3组比较,差异有统计学意义（F=34．11,P〈0．05）,其中HGF刺激组p-Met蛋白的表达水平高于空白组和抑制组（t=3．87,5．20,P〈0．05）。HGF刺激组MHCC97-H细胞形态呈现长梭状问质样改变,而抑制组和空白组细胞形态相似,呈上皮样。克隆球形成实验结果表明：空白组、HGF刺激组、抑制组和EGF／FGF刺激组克隆球数目分别为0、（35．0±6．3）个、（4．3±1．5）个和（54．3±2．5）个,4组比较,差异有统计学意义（F：511．28,P〈0．05）,其中HGF刺激组克隆球数目多于空白组和抑制组（t=9．62,8．21,P〈0．05）,而少于EGF／FGF刺激组（t=4．93,P〈0．05）。实时定量PCR检测结果显示：空白组和HGF刺激组不同时间点（2、4、8、16、24h）C—myemRNA相对表达量分别为1．00±0．11、1．68±0．09、1．08±0．24、1．18±0．13、0．78±0．14、1．06±0．04;Klf4mRNA分另1为1．00±0．20、1．43±0．16、0．87±0．28、1．19±0．29、2．17±0．43、1．41±0．06;Oct4mRNA分别为1．00±0．12、0．54±0．12、0．69±0．19、1．08±0．12、1．62±0．30、0．97±0．11,空白组和HGF刺激组不同时间点上述各指标比较,差异均有统计学意义（F=13．64,8．52,13．56,P〈0．05）;HGF刺激组2hc—myemRNA相对表达量达到峰值,与空白组比较,约升高了1．68倍（t=8．29,P〈0．05）,HGF刺激组16hK]f4mttNA相对表达量达到峰值,与空白组比较,约升高了2．17倍（t=4．27,P〈0．05）,HGF刺激组16hOct4mRNA相对表达量达到峰值,与空白组比较,约升高了1．62倍（t=3．32,P〈0．05）。结论HGF／Met通路的活化能够诱导肝癌细胞MHCC97-H的干细胞样表型转化,其可能作用机制是通过增加多能干细胞相关基因的表达而实现的。     

骨髓间充质干细胞对人肝癌细胞系MHCC97-H增殖能力的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSC)对肝癌细胞增殖能力的影响.方法 人肝癌细胞系MHCC97-H培养液中分别加入0、25%和50%MSC的条件培养基(MSC-CM),采用CyQUANT细胞增殖实验检测吸光度A值变化.在MHCC97-H细胞培养液中添加50%MSC-CM,荧光实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki-67抗原的变化.16只裸鼠皮下接种MHCC97-H细胞后,实验组经静脉注射MSC,1×106个/次,每周3次,对照组静脉注射PBS;比较肿瘤体积.结果 培养液中加入MSC-CM后A值依次为211.65±54.72、236.24±57.15和283.59±62.16(P<0.05).PCNA和Ki-67的表达水平分别升高1.8和7.0倍.实验组肿瘤体积(1745±455)mm3m大于对照组(972±568)mm3(P<0.05),肿瘤体积平均增加速度(56.0±26.1)mm3/d高于对照组(32.4±14.5)mm3/d(P<0.05).结论 骨髓间充质干细胞可促进肝癌细胞系MHCC97-H的增殖.