两株犬源狂犬病病毒街毒株全基因组序列测定与分析

目的对2株犬源狂犬病病毒街毒株全基因组测序,了解国内狂犬病病毒的流行和变异情况。方法采用乳鼠脑内接种方法分离2株天津地区狂犬病病毒街毒株,RT-PCR扩增病毒DNA覆盖全基因组12个相互重叠的基因片段,PCR产物平端克隆后进行全基因组核苷酸序列测定,然后对其分子变异和进化特点进行分析。进行两分离株的序列相似性、氨基酸同源性、主要功能位点的变异比较和种系发生分析。结果 TJD04和TJD05两株狂犬病病毒全基因组长均为11 924 nts,全基因组序列的组成和结构均符合弹状病毒科狂犬病病毒属的特征。病毒基因组由5个编码区组成,基因起始位点和终止位点高度保守,氨基酸编码长度未发生变异,5个编码蛋白序列较少发生变化,仅有个别主要功能位点发生变异,且大部分变异均属于无意义沉默突变。多序列相似性比较和种系发生分析显示,两株病毒均属于基因1型,N基因与全基因进化树保持一致,与中国犬源狂犬病病毒BD06同源性最高(99.6%),进化关系近,并具有较为独特的中国地域特点。结论两天津株狂犬病毒可能是自然界中固有的狂犬病病毒街毒株。     

福建省首例狂犬病街毒分离株基因组序列测定及分析

目的 对福建省首次分离的狂犬病毒街毒株进行全基因组序列测定分析,了解病毒序列及进化特征,为进一步研究街毒的遗传变异规律积累理论资料。方法 从病毒细胞培养液中直接提取病毒RNA,采取分段RT-PCR的方法进行序列扩增,将获得的各基因片段进行分子克隆后测序,运用生物学软件进行拼接得到全基因组序列,并进行分析。结果 应用自行设计的引物,获得了狂犬病毒街毒株的全基因组核苷酸序列,编码区没有插入和缺失的发生,对毒株在N蛋白主要抗原位点发生的突变为在B细胞表位发生了379位V→L的突变;糖蛋白抗原位点I(231位)的氨基酸为L;在抗原位点II 199位点发生了R→G的突变,抗原位点III 333位为精氨酸(R)。与国内河北一街毒株BD06无论在G基因的进化上还是N基因的分型上都有着很近的亲缘关系。结论 获得狂犬病毒株全基因组序列,了解病毒重要的氨基酸位点特征,为进一步探讨福建省狂犬病毒变异、传播机制等奠定基础。     

2017年南京市2株肠道病毒71型分离株全基因组序列测定分析

目的 对2017年南京市2株肠道病毒71型分离株进行全基因组序列测定,分析其进化及遗传变异特征,为手足口病疫情的监控与防治提供依据。方法 通过对临床检测EV71阳性的标本进行病毒分离,设计8对特异性引物对病毒全基因组进行PCR分段扩增,经序列测定及拼接获得EV71基因组序列,将其与其他代表毒株序列分别进行核苷酸和氨基酸同源性比对,并进行遗传进化分析。结果 基因组核苷酸同源性分析显示,2株分离株的同源性为94.0%。以EV71 NJ2017iso2作为参照,与2008年安徽流行株Fuyang 17.08-02的同源性最高(96.9%),而与原型株BrCr的同源性较低(79.8%)。同时基于VP1基因和全基因组序列构建的进化树均可以看出,2株分离株与C4亚型代表株聚为一簇,与国内各地既往的C4流行毒株相比,未发生大的变异。结论 2株EV71分离株均属于C4a型,虽病毒核苷酸序列之间差异显著,但大多为无明显的突变,其相应的氨基酸序列的遗传变化相对稳定。     

2013-2022年江苏省柯萨奇病毒A6型全基因组序列特征分析

目的 研究江苏省2013-2022年分离到的柯萨奇病毒A6型(CV-A6)全基因组序列特征及对全基因组各编码区进行遗传进化分析,以期从分子流行病学特征的角度解释CV-A6取代肠道病毒A71和柯萨奇病毒A16成为江苏省引起手足口病(HFMD)主要病原的原因。方法 选取2013-2022年间江苏省地区流行的35株CV-A6毒株进行全基因组测序,采用DNASTAR、MEGA7.0和Similarity plots3.5.1等软件对获取的全基因组序列进行比对、相似性分析、系统进化分析和基因重组分析,对P1编码区和3D区主要氨基酸变异位点进行分析。结果 35株CV-A6江苏毒株的全基因组核苷酸和氨基酸序列相似性分别为87.5%～99.6%和97.0%～99.8%,与CV-A6原型株Gdula/USA/1949的全基因组核苷酸序列相似性仅为80.3%～81.0%,氨基酸序列相似性为94.7%～95.3%。基于VP1序列的系统进化树结果显示,2013-2022年江苏省有34株CV-A6分离毒株分属于D3a基因亚型,1株分属于D2基因亚型;基于3D区进化树划分不同重组模式,2013-2022年江苏省流...     

我国分离的10株狂犬病病毒P和M蛋白基因序列分析

摘 要：目的 探讨我国狂犬病病毒P、M蛋白基因序列、结构特点及变异情况等遗传学特征。 方法 用RT-PCR方法从分离的10株狂犬病病毒中获得目的基因片段,测定核苷酸序列后,利用生物信息学软件分析核苷酸、氨基酸序列及其相关的功能位点并构建P、M蛋白基因的系统发育树。结果 10株病毒P和M基因核苷酸序列同源性分别为85.9％～99.4％和89.5％～99.5％,推导出的氨基酸同源性分别为92.3％～100％和96.0％～99.5％。在核苷酸及氨基酸水平上,10株病毒与我国分离的街毒株HN10及CTN疫苗株的P、M基因同源性均明显高于国外其它疫苗株、标准攻击毒CVS株相应的同源性。系统发育分析表明,10株病毒与我国湖南街毒株、CTN疫苗株进化关系最近,而与研究中选取的其他毒株进化关系较远。氨基酸对位分析表明,与其它基因1型毒株相比,本研究中10株狂犬病病毒的P、M基因出现多处变异,但很少在功能区发生变异。结论 分离的10株病毒属基因l型狂犬病病毒,与我国分离的街毒株及CTN疫苗株关系较近。     

经福州海关关区输入的境外新型冠状病毒基因组特征分析

目的 对经福州海关关区输入的境外新型冠状病毒感染者标本进行全基因组测序,了解关区范围内输入性新型冠状病毒全基因组特征及变异情况,为新冠疫情防控中的新冠病毒溯源提供参考。方法 采用靶向扩增方法结合二代测序技术获得新型冠状病毒全基因组,应用在线分析平台及序列分析软件,判断病毒型别,分析病毒突变位点;构建系统发育树,并结合病例流行病学资料进一步证实病毒的来源。结果 获得30株2021年5月至2022年4月期间输入性新型冠状病毒感染者的SARS-CoV-2全基因组序列。Pangolin分型显示30株病毒分别属于R.1进化分支、Alpha变异株(B.1.1.7)、Beta变异株(B.1.351)、Delta变异株(B.1.617.2)和Omicron变异株(B.1.1.529),2022年1月之后的毒株均为Omicron变异株,分别属于BA.1和BA.2两种进化分支。全基因组核苷酸突变位点分析显示,与武汉参考株(NC＿045512.2)相比30个SARS-CoV-2基因组序列核苷酸突变为24～71个,核苷酸突变位点在全基因组中分布不一致,突变位点数较多的分别是S基因、ORF1a基因、ORF1b基...     

4株狂犬病街毒的分离及其核蛋白和糖蛋白序列分析

目的以4株狂犬病街毒分离株及我国南北方不同地区狂犬病病毒街毒为研究对象,通过其核蛋白及糖蛋白基因的同源性及进化分析,比较我国狂犬病流行毒株与人用及兽用狂犬病疫苗株间的基因及抗原性差异,为相关疫苗的研究奠定理论基础。方法以直接免疫荧光法(DFA)检测疑似狂犬病的犬脑标本,以乳鼠颅内接种法(MIT)和细胞培养分离技术(CIT)分离狂犬病病毒,并进行TCID50和LD50测定;以RT-PCR法扩增其核蛋白(N)和糖蛋白(G)基因,克隆入T载体并测序后,下载GenBank内已有的狂犬病病毒数据资源,以(Clustal和MEGA3软件)进行基因同源性比对及系统发生分析。结果从广东、河北两省分离到狂犬病病毒街毒4株,分别命名为GN07、WJ07-1、WJ07-2、GC07;序列分析表明4株狂犬病病毒均为基因1型,其N基因与G基因核苷酸的同源性分别为89.5%~99.9%和87.9%~99.9%,其中GN07与WJ07-1、WJ07-2、GC07的同源性较低。与己知的基因1型狂犬病毒相比,WJ07-1、WJ07-2、GC07与湖南、湖北、云南、浙江等地分离株及印度尼西亚分离株核苷酸同源性最高,分别为97.8%~99.4%和92.2%;GN07与CTN疫苗株核苷酸同源性最高,为94.5%。系统发育分析表明,4株病毒与CTN疫苗株同源性较高,与人用狂犬病疫苗3aG、PV株及兽用狂犬病疫苗ERA株和Flury疫苗株的同源性相对较远。适应细胞培养后,四株街毒的LD50和TCID50最高者为GN07,而WJ07-1较低,差别较大。结论4株狂犬病分离株与我国南北方不同地区狂犬病流行毒株的基因和氨基酸序列存在一定差异,在进化关系上分属于不同的分支。     

云南省2006-2010年狂犬病病毒N和G基因分子结构特征分析

目的了解云南省狂犬病毒的流行情况以及街毒株N、G基因结构特征,为有效控制狂犬病疫情提供初步科学依据。方法对云南省2006-2010年10株狂犬病街毒株N、G基因进行全基因克隆、测序,并与已知国内外代表毒株核苷酸及推导氨基酸进行序列比对及系统发育分析。结果序列分析表明所研究的10个云南毒株与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ型代表毒株N、G基因核苷酸序列同源性分别为72.1%～78.5%、58.4%～71.0%,与基因Ⅰ型毒株序列同源性为85.2%～90.1%、82.7～99.6%,云南毒株之间核苷酸序列同源性为89.3%～99.2%、86.0～99.6%。云南10个毒株均为基因Ⅰ型和血清1型毒株,分为2个进化分支,除YNTC06与GXN119和HM88单独属于分支Ⅲ外,其余云南毒株均分布在分支Ⅰ上,且进一步分为3个小亚分支。遗传进化分析表明,各毒株氨基酸位点均存在不同程度的变异,其中YNTC06在360、369、375等多个NP抗原位点存在变异;云南毒株在GP330、333位毒力决定位点未发生变异,均为强毒株。结论云南狂犬病毒属于基因Ⅰ型,存在2个分支;云南狂犬病毒NP和GP存在特异性氨基酸变异位点,其基因结构及变异、亚组群划分与地理位置无相关性。     

2019年云南省埃可病毒18型分离株的全基因组分析

目的对2019年云南省埃可病毒18型(E-18)的分离株K88R3-19进行全基因组序列测定及分析,了解其进化和变异特性。方法利用RD、Vero和KMB17细胞分离病毒,提取病毒RNA,RT-PCR扩增全基因,并测序拼接获得全基因组序列。利用Mega 5.05、Geneious Basic 5.4.1和SimPlot 3.5.1等软件分析全基因组序列。结果 K88R3-19株全基因组序列长度为7 422 bp,编码含2 190个氨基酸的多聚蛋白。K88R3-19与E18/LJ/0601/2019全基因组核苷酸一致性和氨基酸同源性分别为97.6%和99.2%;与其他E-18毒株的核苷酸一致性和氨基酸同源性分别为79.7%～86.1%和95.8%～97.7%;与其他E18毒株的各区段核苷酸一致性和氨基酸同源性分别为72.7%～98.5%和91.9%～100%,其中与中国株VP1-VP4区段核苷酸的一致性为89.8%～98.7%。基于E18全长VP1序列的种系进化分析可将E18分为1-6个基因型,其中5基因型可再分为5-1～5-3 3个基因亚型。中国E-18流行株主要聚集在5-3基因亚型。K88R3-19株较其他E-18株在VP1氨基酸序列上有2个独特突变:第2和28位点分别由D→V和V→A。结论 K88R3-19分离株为5-3基因亚型,为2019年中国大陆流行株。     

柯萨奇病毒A组4型分离株全基因序列分析

目的分析1株柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4,CV-A4)毒株的全基因组序列和系统进化特征。方法使用细胞培养法对肠道病毒阳性标本中的病毒进行分离。提取病毒RNA,通过RT-PCR法分段扩增全基因组,经测序、比对和组装后获得CV-A4分离株的全基因组序列。利用MEGA7.0软件分别基于全长VP1序列和全基因组序列构建系统发育树;使用Geneious Prime 2020.1.2软件对全基因组及编码区各区段的核苷酸和氨基酸序列同源性进行分析,并对编码区氨基酸变异情况进行比较分析。结果从人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma, RD)细胞上分离到1株CV-A4分离株,命名为R09220/YN/CHN/2009。基于全长VP1序列的系统进化分析显示,该分离株属于C2基因亚型。在全基因组核苷酸序列上与其同源性最高的是CV-A4毒株CVA4/SZ/CHN/09(核苷酸为95.4%,氨基酸为98.7%)。与C2基因亚型内16株CV-A4代表株的全序列核苷酸相似性为88.4%～95.4%,氨基酸序列相似性为97.5%～98.7%。通过比较C2基因亚型内的23株CV-A4分离株的全基因组氨基酸序列,R09220/YN/CHN/2009共存在23个氨基酸变异位点,其中10个为其独有的变异位点。结论 R09220/YN/CHN/2009为肠道病毒CV-A4,属于C2基因亚型,该亚型在中国大陆流行的CV-A4病毒中占据优势地位。     

河南省8株狂犬病毒磷蛋白基质蛋白基因分析

目的分析河南省8株狂犬病毒磷蛋白P及基质蛋白M的基因序列,探讨狂犬病毒流行株毒力与致病性变异的可能原因。方法以免疫荧光法检测2006年采自河南省的121份犬脑,取阳性犬脑组织悬液接种鼠脑分离病毒,以RT-nest-edPCR法扩增病毒P与M基因,克隆测序后进行生物信息学分析。结果分离到8株狂犬病毒,序列分析表明8株病毒均为基因1型狂犬病毒,8株病毒彼此之间P基因与M基因核苷酸序列同源性均为98.9%～99.8%,推导的氨基酸序列同源性分别为98.0%～99.3%和97.0%～99.5%。8株病毒与我国宁夏分离株CNX8511、CNX8601的同源性最高,P基因与M基因核苷酸同源性分别为89.1%～89.7%和91.1%～92.0%,氨基酸同源性分别为93.3%～94.3%和96.6%～98.0%。在核苷酸及氨基酸水平上,8株病毒与CTN疫苗株的P与M同源性均明显高于与其它疫苗株的相应同源性。系统发育分析表明,8株病毒与我国宁夏街毒株、CTN疫苗株、泰国及菲律宾等东南亚株进化关系最近,而与CTN以外的其它疫苗株、标准攻击毒CVS株,以及我国80年代初分离的DRV、MRV株进化关系较远。氨基酸对位分析表明,较之参比的其它基因1型毒株,河南省8株狂犬病毒的P与M出现多处变异。结论8株狂犬病毒仍属基因1型狂犬病毒,但其P基因及M基因在核苷酸及推导的氨基酸水平上均出现了明显变异。     

我国各地区动物狂犬病街毒的检测及分析

目的 检测我国不同地区动物中狂犬病毒带毒率并分析糖蛋白编码基因序列.方法 El.ISA、免疫荧光法分别检测586份采集自中国不同地区的犬、猫,蝙蝠和野鼠脑标本和16份犬唾液中狂犬病街毒,阳性标本乳鼠颅内接种.并测序.结果 ELISA、免疫荧光法均在犬脑中分离到10株狂犬病街毒,其中贵州省113份犬脑中分离到2株病毒,湖南省62份犬脑中分离到2株病毒,武汉市70份犬脑中分离到2株病毒,江苏省85份犬脑中分离到4株病毒,沈阳市69份犬脑中未分离到狂犬病毒;79份猫脑、100份蝙蝠脑及8份鼠脑中未检出狂犬病街毒,16份犬唾液标本未检出狂犬病毒.在贵州省和武汉市,冬季采集的112份犬脑末检出狂犬病毒.春夏季采集的40份犬脑中,4份阳性.分离的10株狂犬病毒阳性株颅内接种乳鼠后.均发病死亡.所有分离株均属狂犬病毒基因1型,可分为4个亚组.结论 同一地区的狂犬病毒分离株以及相邻省份的狂犬病毒分离株的同源性十分接近,动物样本采集时间与狂犬病毒阳检率有关.     

河南省九株狂犬病毒的糖蛋白基因序列分析

目的 了解河南省狂犬病毒与人用、兽用狂犬病疫苗株在糖蛋白基因核苷酸和氨基酸序列水平上的差异,为有效控制狂犬病疫情提供初步的科学依据.方法 以反转录-半套式聚合酶链反应(RT-heminested-PCR)扩增2006年12月分离自河南省信阳市的9株狂犬病毒街毒株,经纯化、克隆、测序后获得9条糖蛋白基因全长序列,采用生物信息学软件构建基因系统发育树,对糖蛋白基因序列和氨基酸序列进行分析.结果 9株狂犬病毒糖蛋白在核苷酸及氨基酸序列水平上彼此的同源性分别为97.6%～98.9%和99.2%～99.8%;9株病毒与CTN疫苗的同源性最高,其核苷酸及氨基酸同源性分别为85.6%～93.0%和91.9%～92.9%;9株病毒与其他疫苗株相比,其核苷酸及氨基酸同源性分别为80.4%～83.3%和87.7%～92.5%;与已知的基因1型狂犬病毒比较,9株病毒糖蛋白氨基酸序列发生了若干位点的氨基酸取代.结论 9株河南省狂犬病毒街毒株均属基因1型,CTN疫苗株可能为目前我国河南省所流行的狂犬病提供较好的保护效果.     

中国12株狂犬病街毒株G基因序列测定与分析

目的了解中国狂犬病毒的流行情况以及街毒株与中国人用、兽用狂犬病疫苗株在G基因核苷酸和氨基酸水平的差异,为有效控制狂犬病疫情提供初步科学依据。方法对12株街毒株G基因进行了全基因测序,与其它36株中国狂犬病街毒株,以及中国的疫苗株和其它国家毒株的G基因序列进行了综合分析。结果序列分析表明来源于中国的50株狂犬病毒均为基因Ⅰ型狂犬病毒;其中具有代表性的6株病毒与我国现在使用的各种疫苗株在G基因的核苷酸和氨基酸水平上均存在不同程度的差异,与我国人用疫苗株CTN同源性较高;进化分析表明,我国主要流行狂犬病毒与泰国、印度尼西亚、马来西亚等东南亚狂犬病毒株处于同一分支。中国毒株之间G基因核苷酸同源性分别≥82.3%;氨基酸同源性分别≥92.1%;中国街毒株与疫苗株相比较核苷酸的同源性为79.3%～94.2%,氨基酸的同源性为87.8%～97.9%。结论我国的狂犬病毒为基因Ⅰ型狂犬病毒,可以明确分为6个进化群。无论在核苷酸还是氨基酸水平上,中国多数街毒株与疫苗株CTN之间的同源性要高于与其它疫苗株。     

狂犬病毒疫苗株CTN-1八代次N和G基因序列测定及分析

目的测定八个代次CTN-1疫苗株核蛋白（N）和糖蛋白（G）基因序列，并与代表性疫苗株和街毒株进行比较。方法用RT-PCR反应扩增八代次CTN-1的N和G基因，获得cDNA，进行序列测定。结果八个代次CTN-1的N和G基因序列与其它疫苗株比较，核苷酸的同源性分别为82．7％～84．5％和86．6％～88．5％，氨基酸同源性分别为88．9％～92．5％和95．3％～98．2％；与在我国分离的街毒株相比，核苷酸的同源性分别为84．2％～95．0％和80．4％～94．3％，氨基酸同源性分别为92．1％～99．6％和88．7％～98．5％。CTN-1株八个代次之间的核苷酸序列几乎完全相同。结论CTN-1株在传代过程中N和G基因变异小，与中国流行的代表性街毒株的同源性高于其它疫苗株。     

云南省狂犬病病人和犬类感染狂犬病病毒及M基因序列分析

目的 调查云南省部分地区狂犬病病人和疫点犬群携带狂犬病病毒(rabies virus, RABV)状况及RABV膜基质蛋白(matrixprotein, M)基因序列分析,为狂犬病防控提供科学依据。方法 2008-2009年在云南省采集犬脑组织标本606份,狂犬病病人唾液8份,脑脊液1份,用直接免疫荧光试验检测RABV抗原,用RT-PCR检测RABV核酸,对阳性标本进行M基因序列测定和分析。结果 所有标本经检测,RABV抗原和/或核酸阳性16份,其中疫点扑杀的貌似健康犬脑组织3.10%(10/323),狂犬病病人唾液5份、脑脊液1份。狗肉餐馆屠宰犬的脑组织283份均为阴性。云南16株RABV的M基因核苷酸和氨基酸同源性分别为88.5%~100%和85.2%~99.5%。它们与中国人用疫苗株aG核苷酸和氨基酸同源性分别为83.9%~85.7%和82.3%~93.6%;与人用疫苗株CTN181核苷酸和氨基酸同源性分别为99%~99.7%和98.5%~99%。系统进化分析表明,云南16株RABV均属基因Ⅰ型并可分为进化Ⅰ和Ⅱ群并分别与泰国等东南亚国家和相邻省份流行株具有较近的亲缘关系。结论 云南省狂犬病流行与周边省份和东南亚地区的狂犬病传播扩散有一定关系;狂犬病疫点部分貌似健康犬携带RABV并具有传染源意义;云南狂犬病病毒株M基因与我国人用狂犬病疫苗CTN株的同源性和亲缘关系较近,但与aG株同源性存在。     

猪源性乙型脑炎病毒分离株全基因序列测定和分析

[摘要] 目的 了解猪源性乙型脑炎病毒（乙脑病毒）的基因特征。方法 对猪源性乙脑病毒株（JX61）进行全基因组序列测定和基因进化特性的分析。结果 猪源性乙脑病毒JX61株全基因组全长均为10964个核苷酸,含有一个开放阅读框架,编码3432个氨基酸。与GenBank中选择的41株乙脑病毒全基因序列比较发现,其核苷酸同源为83.6-99.3%,氨基酸总体同源性为94.9%-99.6%。通过全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因I型乙脑病毒。结论 猪源性乙脑病毒JX61株属于基因I型,与国内分离株XJP613关系最为接近。提示猪体内的乙脑病毒基因型别有了新的变化,这也是浙江省在猪机体第一次分离基因I型乙脑病毒。