釉质基质蛋白对乳牙牙髓干细胞体外增殖、分化能力的影响

目的：研究釉质基质蛋白（enamel matrix proteins,EMPs）对人脱落乳牙牙髓干细胞（stem cells from hu—man exfoliated dediduous teeth,SHED）体外增殖分化能力的影响。方法：利用酶消化法联合组织块法获得脱落乳牙牙髓干细胞,并进行形态学观察。三氯乙酸法制备EMPs,用不同浓度的EMPs对SHED进行诱导,利用四唑盐比色法（MTT）检测并分析诱导后的SHED增殖活性的变化,检测经诱导后的培养液中碱性磷酸酶（ALP）。RT—PCR检测牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP）及牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein1,DMP-1）的mRNA表达。结果：人脱落乳牙牙髓干细胞呈集落生长,并且在体外具有一定的自我增殖能力。EMPs对乳牙牙髓干细胞的增殖无明显影响,而能够显著提高ALP的活性,并呈现一定的剂量依赖性。经EMPs诱导后,细胞相对高表达DSPP、DMP-1mRNA。结论：EMPs对于SHED向成牙本质样分化具有积极作用。     

猪牙本质基质蛋白提取物的分离纯化及其活性检测

目的:从猪牙胚中获得牙本质基质蛋白提取物(Dentin Matrix Protein Components,DMPCs)并检测其生物活性.方法:用4 mol/L盐酸胍和0.5 mol/L EDTA提取6月龄猪第二磨牙牙胚,获得DMPCs,用蛋白质液相色谱法分离纯化目的蛋白,SDS-PAGE检测分子量,MTT法测定DMPCs对人牙髓干细胞(human Dental Pulp Stem Cells,hDPSCs)生长的影响,同时测定DMPCs对hDPSCs碱性磷酸酶(ALP)活性的影响.结果:牙本质基质蛋白分子量为94×103、38×103、20×103以及一些小分子.体外实验证实,细胞培养1 d,100 μg/mL上调hDPSCs ALP活性(P<0.05);培养3 d,100、150μg/mL组均可促进细胞增殖以及上调ALP活性(P<0.05).结论:牙本质基质蛋白提取物可以促进hDPSCs的增殖,提示混合蛋白组分相互作用可以促进细胞增殖分化.     

大鼠牙本质基质蛋白1对人牙髓细胞增殖和ALP活性的影响

目的 :探讨大鼠牙本质基质蛋白 1(DMP1)对体外培养的人牙髓细胞增殖和ALP活性的影响。方法 :利用MTT法研究牙髓细胞的细胞增殖情况 ,碱性磷酸酶检测试剂盒检测牙髓细胞内ALP活性。结果 :DMP1在细胞培养 3d和 5d时 ,5 μg/mL组可促进人牙髓细胞增殖 (P <0 .0 5 )。细胞培养 3d时 ,仅5 μg/mL组可促进人牙髓细胞ALP活性 (P <0 .0 5 ) ;培养 5d时 1μg/mL和 5 μg/mL均可促进人牙髓细胞ALP活性 (P <0 .0 5 ) ;培养 7d时促进作用进一步加强 (P <0 .0 5 )。结论 :DMP1在一定浓度下可促进牙髓细胞的增殖 ;DMP1对牙髓细胞ALP活性的促进作用呈浓度依赖性 ,高浓度DMP1可以促进人牙髓细胞ALP活性 ,随着时间的延长 ,促进ALP活性的作用也增强。     

人牙髓干细胞诱导后人牙本质基质蛋白1基因转录活性的变化和意义

目的:观察人牙髓干细胞(human dental pulp stem cell,HDPSC)经矿化液诱导后牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein1,DMP1)的表达、细胞生物学变化以及对人DMP1基因启动子转录活性的影响。方法:通过建立体外培养的HDPSC体外矿化诱导模型,运用RT-PCR、组织染色等方法检测矿化诱导后细胞DMP1 mRNA表达、细胞形态和矿化能力的变化以及对两个DMP1基因启动子重组报告基因载体pGL3-P-193~ 86和pGL3-P-505~ 86活性的影响。结果:HDPSC经矿化液诱导后,能够向成牙本质细胞方向分化,出现成牙本质细胞样细胞表型。与对照组相比较,随着诱导时间的延长,细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性增强,较早的出现了矿化结节,说明在诱导液作用后细胞矿化能力升高。诱导后的细胞出现了DMP1 mRNA表达水平增高,pGL3-P-193~ 86和pGL3-P-505~ 86活性均出现增强的趋势,尤其以pGL3-P-505~ 86活性增强更明显。结论:矿化液可诱导HDPSC向成牙本质细胞方向分化,诱导后的细胞矿化能力增强,DMP1表达和转录活性也随之增强,提示DMP1可能参与成牙本质细胞的分化过程。     

永生化成牙本质细胞表达牙本质基质蛋白的实验研究

目的　探讨永生化人成牙本质细胞样细胞系hTERT-hOd-l表达牙本质基质蛋白的情况。方法　矿化液培养hTERT-hOd-l细胞5周,检测骨钙素(OC)分泌量和碱性磷酸酶(ALP)活性。采用免疫组织化学、RT-PCR和原位杂交方法检测Ⅰ型胶原、骨涎蛋白(BSP)、牙本质基质蛋白1 (DMP1)以及成牙本质细胞标志物牙本质涎磷蛋白(DSPP) 和牙本质涎蛋白(DSP)在细胞中的表达。结果　在矿化液诱导下,hTERT-hOd-l细胞ALP活性和OC分泌量升高。 hTERT-hOd-l细胞在mRNA水平上表达BSP、DMP1和DSPP,在蛋白质水平上表达DSP和Ⅰ型胶原。结论　hTERT- hOd-l细胞在体外表达牙本质基质蛋白,具有矿化的潜能。     

三氧化矿物凝聚体对成人牙髓干细胞增殖和分化的影响

目的:研究不同浓度的三氧化矿物凝聚体(mineral trioxide aggregate,MTA)对成人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)增殖和分化的影响。方法:体外培养hDPSCs,分别以不同浓度MTA浸提液作用于hDPSCs。采用四甲基偶氮噻唑蓝(methyl thiazoly tetrazolium,MTT)法测定MTA对hDPSCs增殖的影响;Von Kossa染色法检测hDPSCs钙化结节的形成;通过酶标仪法检测hDPSCs碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)的活性;运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphopro-tein,DSPP)基因的表达。采用单因素方差分析对数据进行统计学分析。结果:2 mg/mL MTA能促进hDPSCs增殖,其ALP活性也明显高于其他各组,并可见Von Kossa染色呈阳性,有钙化结节形成,且能明显促进牙髓干细胞表达DSPP;而20 mg/mL MTA则抑制hDPSCs的增殖,ALP活性明显低于其他各组,Von Kossa染色阴性;而0.2 mg/mL MTA组及氢氧化钙组未能表现出明显的增殖分化活性。结论:2 mg/mL MTA能促进hDPSCs的增殖,并能诱导hDPSCs向成牙本质细胞方向分化。20 mg/mL MTA抑制hDPSCs的增殖,并且抑制hDPSCs向成牙本质细胞方向分化。     

DLK1对人牙髓干细胞增殖和成牙本质分化的影响

目的研究DLK1在人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖分化中的作用。方法用免疫组织化学分析法来检测小鼠上颌第一磨牙中DLK1的表达。构建重组慢病毒使DLK1在hDPSCs中稳定过表达,用CCK8法和Ed U核素渗入法分别检测hDPSCs的细胞活力和增殖;hDPSCs进行成牙本质细胞向分化诱导后,通过ALP活性分析、ALP和茜素红染色,以及ALP、DSPP、DMP1等矿化相关基因的表达,研究hDPSCs的成牙本质细胞向的分化。结果 DLK1在小鼠上颌第一磨牙的成牙本质细胞和牙髓细胞中高表达,而且正常hDPSCs在成牙本质细胞向分化诱导14 d后,ALP蛋白水平增长1.6倍,DSPP增长1.16倍,DMP1增长1.42倍,DLK1增长1.54倍。hDPSCs中过表达DLK1后,相比于对照组增加了1.7倍,显著促进了细胞增殖,却抑制了其成牙本质细胞向分化。结论 DLK1在牙齿发育中发挥重要作用,DLK1过表达促进hDPSCs的增殖,但抑制其成牙本质细胞向分化。     

釉质基质蛋白通过miR-32对乳牙牙髓干细胞成骨与成脂分化的影响

目的: 探讨釉质基质蛋白（EMPs）对乳牙牙髓干细胞（SHED）成骨和成脂作用的影响,并探讨其分子机制。方法: 采用流式细胞术检测SHED表面抗原CD73、CD146、CD34和CD45的表达。通过OB成骨诱导液诱导SHED,采用茜素红染色检测其成骨分化能力。将SHED分为4组,NC组为无效序列shRNA干扰SHED,EMPs组为无效序列shRNA干扰SHED后,再用100 μg/L EMPs干预SHED,miR-32 inhibitor组为miR-32 shRNA质粒干扰SHED,EMPs+miR-32 inhibitor组为沉默miR-32后,再用100 μg/L的EMPs组干预SHED。qPCR检测miR-32、牙本质涎磷蛋白 (DSPP)、牙本质基质蛋白1 (DMP-1)、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ（PPARγ）和CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）的基因表达。采用Western免疫印迹法检测DSPP、DMP-1、PPARγ和C/EBPα蛋白表达量,茜素红染色检测SHED成骨能力,油红O染色检测SHED成脂能力。采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。结果: 流式细胞术结果显示,SHED的CD146和CD73阳性表达,CD34和CD45阴性表达,与干细胞表面标志物特征一致。茜素红染色和油红O染色显示,矿化结节和油滴明显增多,与干细胞多向分化特征一致。与NC组相比,EMPs组中miR-32基因表达量显著增加（P<0.05）,miR-32 inhibitor组和EMPs+miR-32 inhibitor组中miR-32表达量显著减低（P<0.05）。与NC组相比,EMPs组DSPP和DMP-1表达量,矿化结节数量显著增加（P<0.05）,PPARγ和C/EBPα表达量和油脂滴数量显著降低（P<0.05）,而miR-32 inhibitor组结果与之相反（P<0.05）。与miR-32 inhibitor组相比,EMPs+miR-32 inhibitor组DSPP、DMP-1、PPARγ和C/EBPα表达量,矿化结节数量和油脂滴数量无显著差异（P>0.05）。与EMPs组相比,EMPs+miR-32 inhibitor组DSPP和DMP-1表达量,矿化结节数量显著降低（P<0.05）,而PPARγ和C/EBPα表达量及油脂滴数量显著增加（P<0.05）。结论: EMPs通过促进miR-32的表达,从而调控SHED的成骨和成脂分化。     

Synergistic effects of chitosan scaffold and TGFβ1 on the proliferation and osteogenic differentiation of dental pulp stem cells derived from human exfoliated deciduous teeth

ObjectiveMultipotent stem cells derived from human exfoliated deciduous teeth (SHED) represent a promising cell source for tissue regeneration. In the present study we decided to test the inductive effect of chitosan and transforming growth factor-β₁ (TGFβ₁) as a scaffold/factor combination on SHED proliferation and osteogenic differentiation.DesignCell proliferation was quantitatively assessed by PrestoBlue, live/dead assay was performed and cell attachment to chitosan scaffold was examined by scanning electron microscopy (SEM). For osteogenic differentiation analysis, alkaline phosphatase activity was quantified, cells were stained with Alizarin Red, and the lineage specific genes/proteins ALP, COL I, BSP, and OCN were analysed by real-time PCR and Western blot.ResultsSHED remained viable and attached well to the chitosan structure. Moreover, TGFβ₁ significantly enhanced the proliferative activity of SHED on the chitosan scaffold. Our data further revealed that chitosan and TGFβ₁ enhanced the osteogenic differentiation of SHED, as evidenced by high ALP activity, strong mineral deposition, and the up-regulation of ALP, COL I, BSP, and OCN gene/protein expression.ConclusionTogether, data from our study indicate that the combination of chitosan scaffolds and TGFβ₁ enhanced proliferation and osteogenic differentiation of SHED. These findings suggest that the combined application of chitosan scaffold and TGFβ₁ in conjunction with SHED might be beneficial for in vivo bone regeneration.     

淫羊藿素对 SD 大鼠骨髓基质细胞增殖与成骨分化的影响

目的：研究淫羊藿素（ICT）对体外培养 SD 大鼠骨髓基质细胞（rBMSCs）增殖与成骨分化的影响。方法：体外分离培养 rBMSCs,传代至第4代作多向分化鉴定。分别以10－9、10－8、10－7、10－6、10－5 mol／L ICT 刺激 rBMSCs 后3、6、9 d,分别用 cck-8及碱性磷酸酶 ALP 试剂盒检测 rBMSCs 的增殖及 ALP 活性;10－9 mol／L ICT 处理 rBMSCs 后21 d 作茜素红（AR）染色以判断钙结节的形成。结果：原代培养的 rBMSCs 贴壁生长、呈梭形,能多向分化;ICT 明显抑制了 rBMSCs 的增殖;但增高其 ALP 活性、钙结节形成。结论：ICT 以剂量依赖方式抑制 rBMSCs 的增殖但促进其分化和矿化。     

丹参注射液促进人脱落乳牙牙髓干细胞成骨/成牙分化的实验研究

目的 探讨中药丹参对人脱落乳牙牙髓干细胞(SHEDs)成骨/成牙分化功能的影响.方法 利用50mg/ml的丹参注射液作用于SHEDs细胞,利用成骨/成牙分化诱导培养基诱导SHEDs定向分化.通过检测ALP活性、茜素红染色、钙离子定量分析、成骨/成牙分化相关基因的表达研究 SHEDs 体外成骨/成牙分化能力.Western Blot检测AKT信号分子的表达.结果 50mg/ml的丹参注射液促进SHEDs细胞ALP活性,体外矿化能力及成骨/成牙分化相关基因骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、牙本质涎磷蛋白(Dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达.50mg/ml的丹参注射液促进磷酸化AKT的表达.结论 50mg/ml的丹参注射液具有促进SHEDs细胞体外成骨/成牙分化的潜能,其作用可能与激活AKT信号通路相关.     

釉基质蛋白（EMPs）对大鼠牙髓干细胞体外增殖、分化能力的影响

目的：研究釉基质蛋白（Enamel Matrix Proteins,EMPs）对大鼠牙髓干细胞（rat Dental Pulp Stem Cells,rDPSCs）体外增殖分化能力的影响。方法：酶消化培养法获得大鼠牙髓干细胞,有限稀释法分离纯化大鼠牙髓干细胞,形态学观察,计算细胞克隆形成率。乙酸法制备EMPs,用不同浓度的EMPs进行诱导,利用四唑盐比色法（MTD检测和分析诱导后细胞增殖活性的变化。检测诱导后培养液中的碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）。免疫组化染色和RT-PCR方法检测牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein,DSP）、牙本质基质蛋白1（dentin matrixprotein 1,DMP—1）和牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphopmtein,DSPP）的mRNA表达。结果：大鼠牙髓干细胞呈集落状生长,在体外具有一定的克隆形成能力。EMPs对大鼠牙髓干细胞的增殖有促进作用,并呈现剂量和时间依赖性。200gg／ml EMPs组可显著促进大鼠牙髓干细胞的增殖。EMPs作用组能显著提高大鼠牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性。经细胞因子刺激后细胞表达DSP、DMP-1蛋白和DSPP mRNA。结论：EMPs在大鼠牙髓干细胞增殖和向成牙本质细胞分化方面具有积极的作用。     

Effects of calcium silicate-based cements on odonto/osteogenic differentiation potential in mesenchymal stem cells

The objective of this study was to evaluate the biological effects and odonto/osteogenic differentiation potential of Biodentine, NeoMTA Plus and TheraCal LC in tooth germ-derived stem cells (TGSCs). TGSCs were exposed to the material extracts. Biocompatibility was tested with MTS cell proliferation assay. Odonto/osteogenic differentiation was assessed with alkaline phosphatase (ALP) activity and mRNA gene expressions (RUNX2, DSPP and DMP-1). Scanning electronic microscopy/energy-dispersive X-ray (SEM/EDX) analysis and pH analysis were also performed for the materials. Data were evaluated using the one-way ANOVA and Tukey's tests. TGSCs remained viable after 7 days of incubation with all tested materials. Biodentine and NeoMTA Plus showed high ALP activity and increased expression of RUNX2, DSPP and DMP-1 compared to that of TheraCal LC. All materials can induce odonto/osteogenic differentiation of MSCs in various levels. Biocompatibility and odonto/osteogenic differentiation potential of Biodentine and NeoMTA Plus are similar and superior to that of TheraCal LC.     

不同浓度黄芩苷对人根尖乳头干细胞成骨分化的影响

目的 探讨不同浓度黄芩苷对人根尖乳头干细胞（stem cells from apical papilla,SCAPs）成骨分化的影响。方法 选取具备稳定传代能力的第3代SCAPs,采用Live/Dead细胞荧光染色,检测细胞在0、10、20、50、100 μmol/L不同黄芩苷浓度干预培养24 h后的存活情况及细胞活力;然后将SCAPs分为普通培养基组（DMEM）和成骨诱导培养基组（ODM）,根据黄芩苷的不同浓度,将实验组分为5个实验亚组,依次为0、10、20、50、100 μmol/L,利用碱性磷酸酶（ALP）染色法和ALP定量检测法,研究不同浓度黄芩苷对SCAPs培养7、14 d早期成骨分化的影响。应用茜素红染色法,定量检测不同浓度黄芩苷对SCAPs培养21 d后成骨矿化的影响。利用MTT法,检测不同浓度黄芩苷对SCAPs生长的影响。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析。结果 活/死细胞荧光染色结果表明,经不同浓度药物干预处理后,细胞活力旺盛,无明显异常;但黄芩苷药物浓度高于50 μmol/L时,细胞死亡数目有上升趋势。ALP定量检测结果显示,ODM组诱导分化第14天时,20 μmol/L浓度组的ALP活性显著高于对照组（P<0.05）,100 μmol/L浓度组的ALP活性显著低于对照组（P<0.05）。DMEM组培养14 d后,20 μmol/L浓度组的ALP活性显著高于对照组（P<0.05）。茜素红定量显示,ODM组中100 μmol/L实验组的A值显著低于对照组（P<0.05）;20 μmol/L的黄芩苷浓度组是促进SCAP生长的最适浓度。结论 高于50 μmol/L浓度的黄芩苷对SCAPs的成骨分化表现出明显抑制作用,而低浓度黄芩苷,尤其是20 μmol/L的黄芩苷对SCAPs成骨分化及细胞生长有促进作用。     

小檗碱通过JNK信号通路调控大鼠脂肪干细胞成骨向分化

目的: 探讨小檗碱(C₂₀H₁₈NO₄)对大鼠脂肪干细胞(ADSCs)的成骨分化作用及其相关机制。方法: 以5、10、20 μmol/L浓度小檗碱培养液处理ADSCs,未处理组为对照组,通过MTT法检测细胞增殖活性,应用碱性磷酸酶（ALP）染色及半定量、钙结节染色分析小檗碱对ADSCs成骨分化的影响,采用Western 印迹法检测c-Jun 氨基末端激酶(JNK)的蛋白磷酸化水平及应用JNK通路抑制剂SP600125前、后成骨相关蛋白Runx2和OCN的表达水平。采用SPSS 22.0 软件包对数据进行统计学分析。结果: 5、10、20 μmol/L小檗碱处理大鼠ADSCs 1、3、7天后,细胞增殖活性无显著改变（P>0.05）;实验组ALP染色及茜素红染色均较对照组明显深染,实验组ALP蛋白分泌显著上调（P<0.05）。在10 μmol/L小檗碱培养液作用下,JNK蛋白磷酸化水平升高,实验组成骨相关蛋白Runx2和OCN表达升高;抑制JNK信号通路后,Runx2和OCN表达下调。结论: 小檗碱对ADSCs的增殖无影响,可通过激活JNK信号通路,上调脂肪干细胞的成骨分化效应。