兔骨髓间充质干细胞体外向心肌样细胞诱导分化：缝隙连接蛋白43的

背景：骨髓间充质干细胞经过诱导因素刺激后,能够分化为心肌细胞,同时表达缝隙连接蛋白43,移植后可改善心功能或修复受损的心脏起搏传导系统。而缝隙连接蛋白43在维持心脏正常功能中发挥着重要作用。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞过程中缝隙连接蛋白43的表达变化,及诱导后骨髓间充质干细胞间隙连接通讯功能的改变。 方法：采用Percoll非密度梯度离心法与贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞,正常组不进行任何干预,诱导组加入5-氮胞苷向心肌样细胞诱导,免疫荧光及流式细胞仪检验细胞诱导前后缝隙连接蛋白43的表达。将原代培养1 d的乳鼠心肌细胞分别接种于上述两组细胞爬片上,免疫荧光观察兔骨髓间充质干细胞与心肌细胞形成间隙连接的情况。划痕试验设立正常组、诱导组以及添加甘草次酸的阻滞剂组,观察兔骨髓间充质干细胞诱导前后细胞间隙连接的功能变化。 结果与结论：正常组骨髓间充质干细胞缝隙连接蛋白43呈弱表达,5-氮胞苷诱导2,4周后缝隙连接蛋白43的表达均显著增加(P < 0.01),细胞间隙连接通讯功能明显增强(P < 0.001),且随诱导时间的延长呈依赖性增强(P < 0.05)。骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养后,诱导组缝隙连接蛋白43明显呈线状表达在两个相邻细胞的接触面。与诱导4周时比较,阻滞剂组细胞间隙连接通讯功能明显受到抑制(P < 0.001)。提示骨髓间充质干细胞能够自发表达缝隙连接蛋白43,在移植后早期能与心肌细胞形成间隙连接,从而有利于移植后心肌电传导,并发挥骨髓间充质干细胞的旁分泌效应。 关键词：缝隙连接蛋白43;间隙连接;5-氮胞苷;诱导;心肌细胞;骨髓间充质干细胞     

5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化：超顺磁性氧化铁颗粒的标记

背景：骨髓间充质干细胞体外经多种诱导剂均可成功转化为心肌样细胞,目前国内外报道中普遍采用的诱导剂为5-氮胞苷。超顺磁性氧化铁颗粒直径小,可被干细胞吞噬,加上其顺磁性可被MRI探测到信号,因而成为目前广泛应用于活体检测干细胞移植的理想示踪剂。 目的：与未经标记的干细胞相比,观察超顺磁性氧化铁颗粒标记方式对干细胞体外经5-氮胞苷诱导向心肌样细胞分化效应的影响。 方法：分离培养猪骨髓间充质干细胞,实验组采用P3代细胞经超顺磁性氧化铁颗粒标记,标记后细胞经5-氮胞苷体外诱导24 h后继续培养,对照组直接经5-氮胞苷诱导。2周后用抗结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I、连接蛋白43进行免疫细胞化学染色鉴定,经普鲁士蓝染色观察细胞内铁颗粒。 结果与结论：5-氮胞苷诱导分化后细胞表达抗结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I和连接蛋白43,且超顺磁性氧化铁颗粒标记诱导细胞内普鲁士蓝染色呈阳性。提示超顺磁性氧化铁颗粒标记骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷体外诱导后可以分化为心肌样细胞。     

心肌梗死大鼠血清对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

背景：骨髓间充质干细胞的分化与微环境密切相关,心肌梗死后,心肌细胞发生坏死,补体活化,自由基产生,分泌各种细胞因子,患者的血清成分也发生改变,这些改变究竟对骨髓间质干细胞向心肌细胞分化存在怎样的影响？ 目的：观察急性心肌梗死大鼠血清在体外对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的作用。 设计、时间及地点：对比观察体外细胞学实验,于2005-09/2006-06在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成。 材料：体质量50~80 g 三四周龄SD大鼠用于骨髓间质干细胞分离培养;体质量200~300 g 6~8周龄SD大鼠用于制作急性心肌梗死大鼠模型。 方法: 采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。结扎左冠状动脉前降支制作急性心肌梗死大鼠模型,并抽取正常大鼠与模型大鼠血清备用。取第3代骨髓间充质干细胞分6组培养:未诱导组、5-氮胞苷诱导组、5-氮胞苷+心肌梗死模型大鼠血清诱导组、5-氮胞苷+正常大鼠血清诱导组、心肌梗死模型大鼠血清诱导组、正常大鼠血清诱导组。 主要观察指标：大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后的形态学变化。大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后心肌肌钙蛋白的表达情况。大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后GATA-4和结蛋白mRNA表达水平。 结果：大鼠骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷联合血清诱导后,部分细胞渐伸长、变细,胞体中央形成球形,二三周后可见细胞呈球形、棒状,邻近细胞之间形成连接,镜下可见部分分化的细胞呈节律性跳动,呈心肌样细胞改变,其心肌肌钙蛋白、GATA-4、结蛋白表达阳性。对照组和单纯血清诱导组骨髓间充质干细胞未见形态改变,其心肌肌钙蛋白为阴性, GATA-4、结蛋白呈弱阳性。 结论：单纯使用心肌梗死大鼠血清不能诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,但心肌梗死血清能促进5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并促进分化的心肌细胞成熟。     

同种异体骨髓间充质干细胞移植对大鼠急性心肌梗死后Cx43、Cx45mRNA表达的影响

背景：细胞移植可以修复受损的心肌组织,但移植细胞是否和宿主细胞形成有效的电-机械偶联,并引起移植后细胞缝隙连接蛋白重构及心律失常等尚缺乏系统观察。目前只有少数研究发现心肌梗死后缝隙连接蛋白45表达上调,而对于骨髓间充质干细胞移植后缺血区缝隙连接蛋白45的表达尚无报道。 目的：课题组假设通过改变缝隙连接蛋白水平、干预异常的GJ通道,来尝试治疗心肌梗死后心律失常,为此探讨同种异体骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死大鼠缝隙连接蛋白43及缝隙连接蛋白45 mRNA表达的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-01/2009-05在广西医科大学实验中心完成。 材料：健康Wistar大鼠180只,随机分为正常对照组、假手术组、心肌梗死组、细胞移植组,45只/组。各组按干预后4,8,12周又分为3个亚组,15只/亚组。另取1月龄健康雄性Wistar大鼠20只,用于分离培养骨髓间充质干细胞。 方法：取传至第3代的大鼠骨髓间充质干细胞,加入10 μmol/L 5-氮胞苷进行诱导,4周后用于移植,在移植前2 h行DAPI标记。心肌梗死组、细胞移植组大鼠建立急性心肌梗死模型,假手术组只穿线不结扎冠状动脉。造模后7 d,细胞移植组将2×1010 L-1骨髓间充质干细胞悬液分多点注射到心肌梗死的边缘区和中心区,心肌梗死组、正常对照组、假手术组均注射等量生理盐水。 主要观察指标：荧光定量PCR法检测缝隙连接蛋白43及缝隙连接蛋白45 mRNA的表达。 结果：①干预后4,8,12周,各组正常区缝隙连接蛋白43、缝隙连接蛋白45 mRNA表达基本相似。②与正常区比较,心肌梗死组、细胞移植组缺血区的缝隙连接蛋白43 mRNA表达均显著减少(P < 0.01),缝隙连接蛋白45 mRNA表达均显著增加(P < 0.01)。③同一时间点与心肌梗死组比较,细胞移植组缺血区缝隙连接蛋白43 mRNA表达显著增高(P < 0.01),缝隙连接蛋白45 mRNA表达显著减少(P < 0.01)。 结论：课题创新性证实急性心肌梗死导致心肌缝隙连接蛋白43 mRNA水平下降,缝隙连接蛋白45 mRNA水平升高。5-氮胞苷诱导的同种异体骨髓间充质干细胞移植后,能上调梗死边缘区缝隙连接蛋白43 mRNA的表达,并下调边缘区缝隙连接蛋白45 mRNA的表达。     

体外模拟心肌环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化★

目的：以往研究将长有一层心肌细胞的半透膜放于骨髓间充质干细胞培养皿中，或用培养过心肌细胞的培养基来培养骨髓间充质干细胞，均未发现心肌细胞特异蛋白表达。为此体外模拟心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化，并与常规诱导剂5-氮杂胞苷的诱导效果进行比较。 方法：实验于2007-03/09在山西医科大学中心实验室完成。①动物：Wistar大鼠20只，新生1 d龄Wistar乳鼠10只，均由山西医科大学动物房提供，清洁级，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。诱导剂5-氮杂胞苷为美国Sigma公司产品。②实验方法：自新生Wistar乳鼠心脏分离培养心肌细胞，取第1、2代制成1×109 L-1细胞悬液，-70 ℃放置4~5 h后融化，吸管吹打，反复3次，离心取上清，过滤后即为心肌细胞冻融液，以此作为培养基体外模拟心肌微环境。自成年Wistar大鼠骨髓分离骨髓间充质干细胞，取生长良好的第2代制成1×108 L-1细胞悬液，分为4组：血清对照组加入含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基；5-氮杂胞苷组加入10μmol/L 5-氮杂胞苷37 ℃避光孵育24 h后，换DMEM/F12培养基继续培养；5-氮杂胞苷+心肌细胞冻融液组加入10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导24 h后，在培养体系中加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液；心肌细胞冻融液组加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液。③实验评估：诱导1周后观察骨髓间充质干细胞的形态变化，利用免疫细胞化学技术鉴定心肌特异性肌钙蛋白T、连接蛋白43、α-横纹肌肌动蛋白、CD31的表达情况。 结果：①体外模拟心肌微环境情况：培养7 d时心肌细胞形成细胞簇或细胞单层，呈放射状排列的同心圆状或峰谷样生长，细胞簇搏动呈明显同步性。传代后的心肌细胞仍具有自主收缩的特性。②骨髓间充质干细胞的体外诱导结果：诱导处理1周后，5-氮杂胞苷组多数细胞呈杆状，紧密平行排列生长，细胞体积变大，可见肌丝样结构形成；心肌细胞冻融液组细胞有聚集生长趋势，形成大量的子细胞，可见大量的肌丝样的结构；5-氮杂胞苷+心肌细胞冻融液组脱落或降解的细胞数明显少于5-氮杂胞苷组，也形成肌丝样结构，但部分细胞内有脂肪空泡形成。③免疫细胞化学鉴定结果：诱导培养1周后，血清对照组仅表达α-横纹肌肌动蛋白；5-氮杂胞苷组表达心肌特异性蛋白T、α-横纹肌肌动蛋白、连接蛋白43，其阳性率分别为20%，28%，25%，抗CD31染色呈阴性；心肌细胞冻融液组上述蛋白阳性表达率分别为23%，32%，28%，明显高于5-氮杂胞苷组（P < 0.05），同时抗CD31染色呈阳性；5-氮杂胞苷+心肌细胞冻融液组上述蛋白阳性表达率略低于心肌细胞冻融液组，抗CD31染色呈阳性。 结论：①以心肌细胞冻融液体外模拟心肌微环境，可高效诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞。②部分骨髓间充质干细胞表达CD31，即可向血管内皮细胞分化，提示与5-氮杂胞苷单一的肌细胞诱导作用相比，心肌细胞冻融液更能提供一个心肌再生所需的自然条件。     

5-氮胞苷诱导和未诱导骨髓间充质干细胞移植入梗死心肌后心功能变化的比较*☆

背景：已证实在体外经5-氮胞苷诱导后,骨髓间充质干细胞可向类心肌细胞转化,但移植这种经诱导的髓间充质干细胞是否更有利于急性心肌梗死后心功能改善,尚有争议。 目的：对比观察经5-氮胞苷诱导和未经诱导的骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后心功能的变化。 方法：开胸结扎左冠状动脉前降支建立新西兰兔急性心肌梗死模型,分别在心肌梗死组织周边区注射PBS,经5-氮胞苷诱导或未诱导的兔骨髓间充质干细胞。移植后3 d、4周超声心动图测定左室舒张末期容积,左室收缩末期容积及射血分数以评价心功能变化。 结果与结论：兔前降支结扎后,心功能明显下降;移植3 d后,各组动物左室舒张末期容积、左室收缩末期容积及射血分数均无显著差异,说明无论是否在体外经5-氮胞苷诱导过,骨髓间充质干细胞移植短期对兔心功能无明显改善;移植4周后,与注射PBS的动物比较,移植骨髓间充质干细胞可降低心肌梗死兔的左室舒张末期容积、左室收缩末期容积,提高射血分数,但骨髓间充质干细胞在体外是否经5-氮胞苷诱导对心功能改善程度无影响。     

低压脉动电刺激大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化：希望验证电学因素在心肌发育过程中作用

背景：电学微环境是心肌细胞所处微环境的要素之一。在体外干细胞向心肌细胞诱导分化的过程中,模拟心肌微电学环境的脉动性电流刺激是否有助于心肌分化呢？ 目的：大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞诱导分化过程中,验证课题提出的低压脉动电刺激对心肌分化过程影响的假设,并分析其分子生物学机制。 设计、时间及地点：细胞-基因学实验,于2005-09/2007-03在四川大学老年病研究室完成。 材料：4周龄SD大鼠5只,购自四川大学华西医学中心动物实验室中心。 方法：密度梯度离心+贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代细胞,设立2组,5-氮胞苷诱导组单纯给予10 μmol/L 5-氮胞苷诱导;5-氮胞苷诱导+电刺激组在5-氮胞苷诱导基础上,对骨髓间充质干细胞施加电场刺激,刺激参数选择1.5 V/cm电压,2 ms方波,频率1 Hz,刺激时间为2 h/d。 主要观察指标：分别于诱导第1,2,3,4周收集细胞,western blot技术检测Troponin Ⅰ,Desmin,Connexin-43蛋白的表达,RT-PCR法分析GATA-4,NKx2.5,MEF2C基因的表达。 结果：诱导后细胞停止生长,并倾向集落化。两组均在诱导第2周开始表达Troponin Ⅰ,Desmin,Connexin-43蛋白,第3,4周表达明显增强。两组均在诱导第1周开始表达GATA-4,NKx2.5,MEF2C基因,并逐渐增强,至第3周达高峰,持续到第4周。在同一时间点,5-氮胞苷诱导+电刺激组蛋白、基因的表达量均显著高于5-氮胞苷诱导组(P < 0.01)。 结论：GATA-4,NKx2.5和MEF2C基因调控心肌细胞的形成,而低压脉动电场刺激通过上调其表达进而促进大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化过程。课题结果验证了电学因素在心肌发育过程中具有重要意义的理论假设。     

5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞的分化☆

背景：5-氮杂胞苷能诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。 目的：以5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。 方法：采用贴壁培养法分离、纯化人脐带间充质干细胞,以5-氮杂胞苷诱导第3代人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞。 结果与结论：诱导前人脐带间充质干细胞呈典型的梭形;诱导后一二周细胞体积变大,三四周后相邻细胞间胞膜有接触,逐渐相连呈肌管状,细胞胞质内可见细丝样结构。诱导4周后免疫组织化学鉴定人脐带间充质干细胞cTnI表达阳性,未诱导细胞cTnI表达阴性;诱导组Nkx2.5、GATA 4 mRNA表达水平较未诱导组显著增加(P < 0.05)。提示5-氮杂胞苷可能通过调控GATA4、Nkx2.5基因的表达促进人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞,并促进其成熟。     

5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：骨髓基质干细胞具有扩增迅速、分化潜能广泛等特点,因此建立骨髓基质干细胞的体外定向诱导模型有利于组织工程学研究。 目的：探讨应用5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的可能性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2005-06/2008-06在辽宁医学院附属第一医院中心实验室完成。 材料：SD大鼠20只,由辽宁医学院实验动物中心提供。5-氮胞苷为Sigma公司产品。 方法：大鼠麻醉后,分离股骨和胫骨,全骨髓法+贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,待细胞生长融合至90%后传代扩增。取P3代骨髓基质干细胞,以2×104/孔密度接种于24孔培养板,分别加入5,10,15,20 μmol/L 5-氮胞苷诱导培养,同时设立不加诱导剂的空白对照,诱导24 h后更换为正常培养液继续培养至3周。 主要观察指标：细胞形态及生长曲线,诱导后细胞形态变化,诱导后细胞连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达。 结果：①培养的骨髓基质干细胞大多呈梭形,有时可见细胞融合,P3代细胞接种后第1,2天为静止生长期,从第3天开始进入对数生长期,第9天达高峰,以后进入平台期,第12天细胞数量开始减少。②5 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,骨髓基质干细胞形态无明显变化;10 μmol/L 5-氮胞苷诱导后骨髓基质干细胞变长,宽大,并朝一个方向延伸,具有肌管形成细胞的形态特点;15 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,24孔板周边区有少量细胞存活;20 μmol/L 5-氮胞苷诱导后细胞死亡。③经10 μmol/L 5-氮胞苷诱导3周后,骨髓基质干细胞胞浆内可见连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达;空白对照组均呈阴性表达。 结论：骨髓基质干细胞自身无法向心肌细胞方向转化,体外经5-氮胞苷诱导后具有向心肌细胞分化的潜能。5-氮胞苷浓度过低不能起到诱导分化作用,浓度过高则会造成细胞大量死亡,10 μmol/L为较适宜的诱导浓度。     

成肌分化因子和5-氮杂胞苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向骨骼肌细胞的分化

转位替代疗法，这样就造成了另一块肌组织的损伤。在这种背景下，作者设计了该课题，寻找肌肉原位修复的方法。 目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为骨骼肌细胞的条件。 方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，取第3代骨髓间充质干细胞，应用5-氮杂胞苷、成肌分化因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1联合进行诱导，使之分化。在诱导后的第9天，收集细胞，免疫组织化学法对细胞进行鉴定。 结果与结论：原代培养的骨髓间充质干细胞呈贴壁、集落样生长，5~7 d后有多突成纤维细胞、扁平多角形细胞、多角形细胞和三角形细胞。12 d后，见细胞融合，铺满瓶底，骨髓间充质干细胞的形态变化不明显。经5-氮杂胞苷诱导后细胞，起初部分细胞死亡，生长缓慢。7 d后见细胞明显生长，体积逐渐增大，呈椭圆形、梭形或不规则形状。14 d后，大量增殖的长梭形细胞开始增多。18~22 d后，肌管数量增多，体积增大，核数亦明显增多，初生肌管与长梭形成肌细胞呈平行排列，间隔分布。骨髓间充质/干细胞免疫组化法测定见CD44反应阳性，胞质呈棕褐颗粒，核周明显，CD34呈阴性反应。诱导后骨髓间充质干细胞免疫组化法测定见结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白均为阳性表达。结果提示在体外，成肌分化因子和5-氮杂胞苷可以诱导骨髓间充质干细胞向骨骼肌细胞定向分化，并伴有结蛋白和骨骼肌肌球蛋白阳性表达。