siRNA 干扰的 DKK1低表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞侵袭、迁移的影响及机制研究

目的：探讨DKK1 siRNA干扰的DKK1低表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞侵袭、迁移能力的影响及作用机制。方法瞬时转染DKK1 siRNA至培养的子宫内膜癌Ishikawa细胞;应用实时定量PCR和蛋白免疫印迹方法分别检测转染前后细胞中DKK1的mRNA和蛋白表达;应用Transwell实验检测癌细胞侵袭、迁移能力。应用荧光显微镜观察转染前后Wnt/β-catenin信号通路中活性β-catenin、MMP14表达情况。结果转染DKK1 siRNA至Ishikawa细胞使细胞中DKK1基因表达水平降低21.00%（t＝3.05,P＜0.05）, DKK1蛋白表达降低39.35%（t＝40.97,P＜0.01）。侵袭实验中DKK1 RNAi组的细胞均数140.8±4.733,高于空白对照组的细胞均数123.7±6.700,癌细胞的侵袭能力增强13.82%。迁移实验中DKK1 RNAi组细胞均数（152.0±3.528）高于空白对照组（130.6±4.061）,癌细胞的迁移能力增强16.39%。DKK1 siRNA处理后,细胞中活性β-catenin、MMP14荧光增强,提示表达水平上升。结论 DKK1具有抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞侵袭、迁移的作用。Wnt/β-catenin信号通路参与了DKK1这一作用过程。DKK1不失为抑制子宫内膜癌转移的有效治疗靶点。     

siRNA靶向抑制CXCR4基因表达对鼻咽癌细胞增殖及侵袭的影响及机制研究

目的探讨抑制鼻咽癌细胞趋化因子受体-4(CXCR4)基因表达对癌细胞增殖、侵袭的影响及机制。方法回顾性收集鼻咽癌42例临床资料及相应的癌旁组织。RT-PCR和Western bloting分别检测鼻咽癌及相应的癌旁组织中CXCR4基因的mRNA及蛋白表达;人鼻咽癌细胞系CNE-2Z分为空白组(细胞未做任何处理)、NC-siRNA组(细胞转染无义siRNA序列)和CXCR4-siRNA组(细胞中转染CXCR4的靶向siRNA序列)。转染48 h后Western bloting检测各组细胞中CXCR4、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期素D1(Cyclin D1)蛋白表达;CCK8实验和Transwell小室分别检测细胞的增殖及侵袭能力。结果鼻咽癌中CXCR4基因的mRNA及蛋白表达均显著高于癌旁组织(P0.01);转染CXCR4-siRNA组后CXCR4的蛋白表达显著降低;NC-siRNA组细胞存活率、细胞侵袭数及MMP-2、MMP-9、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达与空白组差异无统计学意义(P0.05);CXCR4-siRNA组细胞存活率、细胞侵袭数及MMP-2、MMP-9、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达均显著低于空白组(P0.01)。结论抑制鼻咽癌细胞CXCR4基因表达可显著降低癌细胞的增殖与侵袭能力,其机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。     

早发型子痫前期胎盘滋养细胞侵袭相关信号通路表达

目的 探讨早发型子痫前期胎盘滋养细胞侵袭相关信号通路表达机制。方法 回顾性分析徐州市中心医院2018年2月至2019年1月收治的152例早发型子痫前期患者(74例轻度组子痫前期和78例重度组子痫前期)的临床资料,另外选取同期正常孕妇80例为对照组。免疫组化方法检测子痫前期患者胎盘组织的基质细胞衍生因子(SDF-1)、Wnt1及β-连环蛋白(β-catenin)蛋白进行定位; Western-blot方法检测SDF-1、基质金属蛋白酶(MMPs)、Wnt1及β-catenin蛋白表达情况;侵袭实验检测滋养细胞的侵袭能力。结果 SDF-1主要定位在滋养细胞的细胞浆或细胞膜、胎盘绒毛及蜕膜组织中,Wnt1和β-catenin蛋白主要定位在胎盘滋养层细胞;与对照组相比,早发型子痫患者的SDF-1和MMPs蛋白表达水平明显上升,且重度组患者表达量最大,差异具有显著性(P 0. 05);与对照组相比,早发型子痫患者的Wnt1和β-catenin表达量明显降低,其次为轻度子痫组,重度子痫组最低,差异具有显著性(P 0. 05)。侵袭实验表明,子痫前期患者侵袭能力明显低于对照组,其中重度组患者的侵袭能力小于轻度组患者(P 0. 05)。结论 随着子痫前期患者病情越重,SDF-1和MMPs蛋白表达越高,Wnt1和β-catenin表达量越低,侵袭能力越低。SDF-1高表达可调控Wnt/β-catenin信号通路,减少Wnt1/β及catenin表达量,降低滋养层细胞的侵袭能力。     

沉默SETD8基因表达对骨肉瘤MG-63细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用

目的探究siRNA下调含SET结构域(赖氨酸甲基转移酶) 8(SETD8)基因表达对骨肉瘤MG-63细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其可能的机制。方法采用脂质体法将特异性针对SETD8基因的siRNA转入骨肉瘤MG-63细胞中,得到关于SETD8基因沉默表达的MG-63稳定的细胞系即实验组,将杂序siRNA用脂质体法同时转染骨肉瘤MG-63细胞,得到关于Control siRNA的MG-63细胞系即对照组,未经转染的骨肉瘤MG-63的稳定的细胞系即空白组。以上三组细胞系通过应用细胞毒性活性检测法(CCK-8法)、平板克隆法同时检测被SETD8基因沉默后骨肉瘤MG-63细胞的增殖能力,侵袭迁移小室即(Transwell小室)法检测骨肉瘤MG-63细胞的侵袭和迁移能力,实时荧光定量法即(PCR法)以及蛋白质印迹法即(Western Blot法)检测SETD8基因沉默表达效果及细胞内SETD8,β-catenin,cyclin D1,vimentin、MMP3的mRNA和相应蛋白的表达水平。结果 SETD8 siRNA转染后,骨肉瘤MG-63细胞的增殖能力显著低于对照组(control siRNA转染MG-63细胞)和空白组(未经转染的MG-63细胞)(P 0. 05); Transwell小室结果显示,沉默SETD8基因组的侵袭和迁移能力明显下降;实验组(SETD8 siRNA转染MG-63细胞)中SETD8、β-catenin、cyclin D1、vimentin、MMP3的mRNA及蛋白表达水平显著低于阴性对照组和空白对照组(P 0. 05)。结论 siRNA下调SETD8基因表达可以抑制骨肉瘤MG-63细胞的增殖、侵袭和迁移能力,Wnt/β-catenin信号通路可能参与并调控这一过程。     

槲皮素与FSCN1基因siRNA联合对卵巢癌生长抑制及免疫功能的影响研究

目的探讨槲皮素与FSCN1基因siRNA对卵巢癌细胞活力、凋亡及免疫功能的影响及机制。方法人卵巢癌SKOV3细胞分为空白对照组、NC组(转染阴性对照siRNA)、槲皮素组(50μmol/L的槲皮素处理细胞后瞬时转染阴性对照siRNA)、si-FSCN1组(细胞转染靶向抑制FSCN1的siRNA)和槲皮素+si-FSCN1组(50μmol/L的槲皮素处理细胞后瞬时转染靶向抑制FSCN1的siRNA),siRNA转染参照Lipofectamine TM 2000说明。各组细胞处理48 h,Western blotting检测FSCN1、β-catenin、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、Bax和血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表达;MTT检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 SKOV3细胞转染si-FSCN1后FSCN1蛋白表达明显降低,与空白对照组比较差异显著(P0.05)。槲皮素组和si-FSCN1组细胞活力及β-catenin、cyclin D1和VEGF的蛋白表达均显著低于NC组,高于槲皮素+si-FSCN1组,细胞凋亡率及Bax蛋白表达显著高于NC组,低于槲皮素+si-FSCN1组(P0.05)。结论槲皮素或FSCN1基因siRNA均能抑制卵巢癌细胞活力,诱导细胞凋亡,抑制免疫抑制因子VEGF表达,联合使用效果更强,机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。     

miR-21在前列腺癌中的表达及抑制其表达对前列腺癌细胞增殖凋亡的影响

目的探讨抑制前列腺癌细胞中miR-21基因表达对癌细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法 RTPCR检测前列腺癌及癌旁组织中miR-21基因的mRNA表达;空白对照组(Control)、阴性对照组(NC)和miR-21 inhibitor组转染人前列腺癌PC-3细胞,48 h后RT-PCR检测各组细胞中miR-21基因的mRNA表达;CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测ki67、Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达。结果前列腺癌组织中miR-21的mRNA表达显著高于癌旁组织(P0.01);转染miR-21 inhibitor后miR-21的表达显著降低;NC组细胞存活率、细胞凋亡率及ki67、Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达与对照组,差异无统计学意义(P0.05),miR-21 inhibitor组细胞存活率及ki67、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著低于对照组,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著高于对照组(P0.01)。结论抑制前列腺癌细胞中miR-21基因的表达可降低癌细胞的增殖及诱导细胞凋亡,其机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

LGR5对宫颈癌细胞上皮间质转化的影响及潜在机制研究

目的探讨富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)对宫颈癌细胞上皮间质转化的影响及潜在机制。方法采用前瞻性研究,以宫颈癌细胞Hela为研究对象,构建过表达和敲低LGR5的细胞株,RT-PCR和Western blot检测LGR5表达。将转染pc DNA3.1-LGR5的Hela细胞作为LGR5组,以转染pc DNA3.1空载体的细胞记为pc DNA3.1组;将转染LGR5 siRNA细胞作为si LGR5组,以转染阴性对照siRNA细胞记为NC组。Western blot分别检测各组细胞中上皮间质标记物钙黏附蛋白E(E-cadherin)、钙黏附蛋白N(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)及Wnt/β-cadherin通路蛋白β链蛋白(β-catenin)和下游蛋白c-Myc、细胞周期蛋白(Cyclin D1)表达变化。Transwell实验检测各组细胞迁移侵袭能力变化。结果 Hela细胞中成功过表达和敲低了LGR5;与pc DNA3.1组相比,Hela细胞转染pc DNA3.1-LGR5后细胞中上皮标志物E-cadherin表达显著降低(P0.05),间质标记物vimentin、N-cadherin表达显著增加(P0.05)。与NC组相比,Hela细胞转染si LGR5后细胞中E-cadherin表达明显增加(P0.05),vimentin、Ncadherin表达明显下降(P0.05)。与pc DNA3.1组相比,Hela细胞过表达LGR5后细胞迁移侵袭能力、Wnt/β-catenin通路蛋白β-catenin及其下游基因c-Myc、Cyclin D1表达均显著增加(P0.05);而Hela细胞沉默LGR5后较NC组细胞迁移侵袭能力、Hela细胞中β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表达均明显降低(P0.05)。结论过表达LGR5能够促进宫颈癌细胞Hela上皮间质转化和侵袭迁移,而干扰LGR5则抑制了细胞上皮间质转化和迁移侵袭,其中机制可能与LGR5调控Wnt/β-catenin信号转导有关。     

Wnt3a转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞及对β-连环素蛋白亚细胞分布的影响

背景:Wnt信号通路是动物胚胎发育过程中重要的调控通路,建立Wnt信号通路细胞模型对于研究该通路有重要意义.目的:以Wnt3a真核表达质粒转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞,构建能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型,观察经典Wnt信号通路对β-1连环素蛋白亚细胞分布的影响.方法:将扩增真核表达质粒pgk-Wnt3a-pcDNA3.0进行酶切鉴定.应用脂质体转染技术将真核表达质粒pgk-Wnt3a-pcDNA3.0和对照质粒pgk-neo-pcDNA3.0转染入胸腺激酶缺陷细胞,经过G418筛选后挑出细胞克隆,扩大培养.应用RT-PCR技术检测表达产物,应用间接免疫荧光技术检测Wnt3a对鼠胸腺激酶缺陷细胞β-catenin亚细胞分布的影响.结果与结论:Wnt3a质粒经过酶切鉴定证明所扩增的质粒为目的质粒.经过G418筛选3周后,挑选10个稳定转染的细胞克隆,进行RT-PCR检测,可见在L-Wnt3a细胞的cDNA产生1条长度为320 bp亮带,表明扩增产物为所需要的目的片段,Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞后有Wnt3a在mRNA转录水平表达.转染对照质粒的胸腺激酶缺陷细胞cDNA未扩增出目的条带.免疫荧光检测可见Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞后细胞浆中有Wnt3a蛋白表达,转染对照质粒组无表达.Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞核中可见明亮的红色荧光,提示β-连环素蛋白在胸腺激酶缺陷细胞-Wnt3a细胞聚集并进入细胞核中.转染对照质粒的胸腺激酶缺陷细胞浆未见有明显β-连环素蛋白着色,细胞核中无β-连环素蛋白的聚集.构建了能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型,真核表达Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞能够获得稳定表达,促进胸腺激酶缺陷细胞浆中β-连环素蛋白向细胞核转移.     

RNAi沉默ROCK-1基因抑制人视网膜母细胞瘤细胞株Y79的增殖、侵袭和转移

目的探讨利用RNA干扰技术(RNAi)沉默人视网膜母细胞瘤Y79细胞株ROCK-1基因对细胞增殖、侵袭和转移的影响。方法实验设空白对照组、阴性脂质体组、实验组。转染后48 h,采用半定量RT-PCR检测ROCK-1、MMP9和CXCR4 mRNA的相对表达变化,采用Western blot检测ROCK-1、MMP9和CXCR4蛋白的表达变化。采用MTT法在转染后24 h、48 h、72 h分别检测细胞的生长情况。采用Transwell小室检测转染后细胞的侵袭和迁移能力。结果与空白对照组和阴性对照组相比,转染组细胞ROCK-1、MMP9和CXCR4 mRNA和蛋白表达水平明显下调;细胞生长活力显著下降、凋亡比率显著增加;基因沉默显著抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移能力,差异均具有统计学意义。结论应用ROCK-1-siRNA转染人视网膜母细胞瘤Y79细胞株,可有效抑制细胞的增殖、侵袭和迁移。小干扰RNA治疗有望成为人视网膜母细胞瘤靶向治疗的新手段。     

β3GnT8基因对HL60细胞体外侵袭能力的影响

目的：初步探讨β3GnT8/GalT7基因对HL60细胞体外侵袭的作用。方法通过脂质体介导将实验室构建好的β3GnT8真核正义表达载体pEGFP-C1-T8-Sense和反义表达载体pEGFP-C1-T8-AntiSense转染入HL60细胞;RT-PCR和Western blot检测浸润转移相关的功能基因TGFβ1、MMP2、MMP14在mRNA水平和蛋白质水平的表达变化;Transwell侵袭实验检测β3GnT8对HL60细胞侵袭转移能力的影响。结果随着β3GnT8表达上调,细胞侵袭能力高于对照组（P＜0.05）,MMP2、MMP14在mRNA和蛋白质水平的表达上调,而TGFβ1表达下调;随着β3GnT8表达下调,细胞侵袭能力下降,MMP2、MMP14在mRNA和蛋白质水平的表达下调,而TGFβ1表达上调。结论β3GnT8可在体外增强HL60细胞的侵袭能力,而该作用可能源于它能够诱导肿瘤侵袭相关蛋白的表达变化。     

沉默wee1基因对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制

目的探讨沉默wee1基因对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制。方法将卵巢癌细胞分为Blank组、小干扰RNA(siRNA)阴性对照(siRNA-NC)组和携带wee1基因片段(siRNA-wee1)组,利用siRNA技术在卵巢癌细胞中沉默wee1基因,采用实时荧光定量PCR、免疫印迹法(WB)检测3组卵巢癌细胞wee1 RNA及蛋白表达水平,采用细胞划痕试验、Transwell试验观察卵巢癌细胞平板集落形成数及卵巢癌细胞迁移、侵袭能力,采用WB观察卵巢癌细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt3a、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(Cyclin-D1)、基质金属蛋白酶7(MMP-7)的表达情况。结果siRNA-wee1组卵巢癌细胞wee1 RNA和蛋白表达水平均低于siRNA-NC组和Blank组(P<0.05),卵巢癌细胞集落形成数少于Blank组和siRNA-NC组(P<0.05),卵巢癌细胞迁移、侵袭能力低于Blank组和siRNA-NC组(P<0.05),Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt3a、β-catenin、Cyclin-D1和MMP-7表达水平均低于siRNA-NC组和Blank组(P<0.05)。结论沉默wee1基因可抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活,进而抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。     

黄连素促进肝癌细胞凋亡的氧化应激Wntβ-catenin信号通路机制研究

目的对黄连素促进肝癌细胞凋亡的的氧化应激Wntβ-链蛋白(β-catenin)信号通路机制进行分析,为临床治疗提供借鉴。方法将生长状态良好的肝癌细胞随机分为4组:对照组、黄连素低剂量(1 m M)、中剂量(10m M)和高剂量(100 m M)组(n=8)。除对照组外,其余各组细胞给予对应剂量的黄连素共培养,分析各组细胞凋亡蛋白及氧化应激-Wntβ-catenin信号通路蛋白的表达。结果黄连素能剂量依赖性地增强肝癌细胞中Bax、Caspase3、Caspase9、P22、P67和Gp91蛋白表达而抑制Bcl2、Wnt、β-catenin、MMP2、MMP3、MMP9、TIMP1、TIMP2和TIMP3蛋白表达,差异有显著的统计学意义(P0.05)。结论黄连素能有效促进肝癌细胞凋亡过程,且可能与其调控细胞内氧化应激及Wntβ-catenin信号通路机制有关。     

Six1基因对As_2O_3诱导的口腔鳞癌细胞凋亡和ROS水平的影响研究

目的探讨Six1 siRNA或三氧化二砷(As_2O_3)对口腔鳞癌细胞活力、凋亡及活性氧(ROS)水平的影响。方法实验分为空白对照组(无需处理)、Six1-siRNA组(细胞转染Six1的特异性siRNA)、As_2O_3组(终浓度为5μmol/L As_2O_3处理细胞)和Six1-siRNA+As_2O_3组(Six1-siRNA及As_2O_3共同处理细胞) 4个组,siRNA转染参照Lipofectamine TM 2000说明。人口腔鳞癌CAL-27细胞处理48 h,Western blotting检测Six1及Wnt/β-catenin信号相关的β-catenin、Cyclin Dl和Survivin的蛋白表达。CCK8及流式细胞术分别检测细胞活力、凋亡率及ROS含量。结果 Six1siRNA的转染可明显降低CAL-27细胞Six1的蛋白表达,与空白对照组比较差异具有统计学意义(P 0. 05)。与空白对照组比较,Six1-siRNA组和As_2O_3组细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,ROS含量明显升高,β-catenin、Cyclin Dl和Survivin的蛋白表达明显降低(P 0. 05),而联合使用的细胞活力及β-catenin、Cyclin Dl和Survivin的蛋白表达均显著低于Six1-siRNA组和As_2O_3组,凋亡率及ROS含量高于Six1-siRNA组和As_2O_3组(P 0. 05)。结论 Six1-siRNA可增加As_2O_3对口腔鳞癌细胞凋亡的诱导,机制与增加细胞ROS水平及下调Wnt/β-catenin信号有关。     

罗哌卡因通过Wnt信号通路抑制胃癌细胞NCI-N87增殖、迁移和侵袭的机制

目的 探讨罗哌卡因通过Wnt信号通路抑制胃癌细胞NCI-N87增殖、迁移和侵袭的机制.方法 采用罗哌卡因细胞培养液培养胃癌细胞NCI-N87,并分为对照组(0μg/mL罗哌卡因)、ROP-L组(160 μg/mL罗哌卡因)、ROP-M组(320μg/mL罗哌卡因)、ROP-H组(640 μg/mL罗哌卡因)、ROP-H+ Licl(640 μg/mL罗哌卡因、Wnt信号激活剂Licl)组.MTIT法检测细胞增殖活性;Transwell小室检测细胞迁移和侵袭的能力变化;Westem blot方法分析基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、β-连环蛋白(β-catenin)、钙黏蛋白(N-cadherin)、Wnt1的蛋白表达水平.结果 与对照组比较,ROP-L组、ROP-M组、ROP-H组胃癌细胞迁移和侵袭数目逐渐降低,增殖活性降低,细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平逐步减少,细胞中E-cadherin蛋白表达水平逐步增加,N-cadherin、Wnt1、β-catenin蛋白表达水平逐渐降低(P＜0.05).与ROP-H组比较,ROP-H+ Licl组胃癌细胞迁移数目和侵袭数目升高,MMP-9、MMP-2、N-cadherin、Wnt1、β-catenin蛋白水平升高,E-cadherin蛋白水平降低(P＜0.05).结论 罗哌卡因通过下调Wnt信号通路抑制胃癌细胞NCI-N87的增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化(EMT).     

和厚朴酚通过降低Wnt/β-catenin信号通路活性抑制前列腺癌细胞的上皮-间充质转化过程

目的:检测和厚朴酚对前列腺癌细胞PC3的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程的影响并探讨其作用机制。方法:将不同浓度的和厚朴酚(0,10,20,40μmol/L)作用于PC3细胞24 h后,通过细胞划痕试验和Transwell小室试验检测和厚朴酚对细胞的迁移和侵袭能力的影响;将不同浓度的和厚朴酚(0,10,20,40μmol/L)作用于PC3细胞48 h后,采用蛋白质印迹法检测和厚朴酚对PC3细胞内E-cadherin,N-cadherin,vimentin及β-catenin蛋白质表达的影响,RT-RCR检测和厚朴酚对细胞β-catenin和MMP-9 mRNA相对表达量的影响。结果:经和厚朴酚作用后的PC3细胞与对照组(和厚朴酚0μmol/L)相比迁移与侵袭能力显著降低,细胞内N-cadherin,vimentin及β-catenin蛋白表达显著下降,E-cadherin蛋白表达显著升高,β-catenin和MMP-9 mRNA相对表达量显著降低,且上述结果呈剂量依赖性。结论:和厚朴酚能抑制PC3细胞的迁移和侵袭,该作用可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性,从而降低EMT活性而产生的。     

RNA干扰技术抑制急性白血病细胞THP-1中SALL4基因表达的研究

目的 抑制SALL4基因在急性白血病细胞THP-1中的表达,探讨其在白血病发病机制中的作用.方法 将表达SALL4干扰序列的质粒载体转染至急性白血病细胞THP-1中,分为4组:(1)空白对照组:不加处理;(2)转染对照组:加入空pRS质粒载体;(3)转染一组:加入SALL4-shRNA-pRS-1干扰质粒的转染复合体;(4)转染二组:加入SALL4-shRNA-pRS-2干扰质粒的转染复合体.采用实时荧光定量PCR和WB技术观察THP-1细胞中SALL4基因mRNA及蛋白表达的变化,建立抑制SALL4表达的体系.实时荧光定量PCR检测SALL4受抑后Wnt/β-catenin信号通路中C-myc、Cyclin D1、β-catenin基因的表达改变,采用流式细胞术分析THP-1细胞凋亡情况.结果 实时荧光定量PCR结果 显示,转染一组、转染二组、转染对照组、空白对照组SALL4基因的表达水平分别为(36.0±4.3)%、(32.0±2.4)%、(102.0±6.5)%、(100.0±2.6)%,差异有统计学意义(F=226.3,P<0.05);转染一组、转染二组的SALL4基因表达水平显著低于空白对照组,差异有统计学意义(t值分别为19.7、19.1,P<0.05);转染对照组SALL4基因表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(t=1.1,P＞0.05).WB检测结果 显示,转染一组、转染二组SALL4蛋白表达与空白对照组和转染对照组相比明显下降.以上基因和蛋白表达水平均提示SALL4干扰效率良好.SALL4基因抑制表达后,转染一组C-myc基因、β-catenin基因、Cyclin D1基因的表达分别为(44.0±6.2)%、(44.0±5.1)%和(107.0±13.6)%,转染二组为(22.0±4.5)%、(25.0±3.5)%和(48.0±7.6)%,转染对照组为(42.0±3.5)%、(59.0±3.7)%及(79.0±5.6)%.转染一组、转染二组C-myc基因表达水平显著低于空白对照组的(103.0±7.5)%,差异有统计学意义(t值分别为10.1、9.5,P均<0.05);转染一组、转染二组β-catenin基因的表达显著低于空白对照组的(100.0±4.1)%,差异有统计学意义(t值分别为23.3、22.9,P均<0.05);转染一组、转染二组Cyclin D1基因的表达显著低于空白对照组的(102.0±6.0)%,差异有统计学意义(t值分别为17.4、12.4,P均<0.05).SALL4基因被抑制后,转染一组、转染二组、转染对照组及空白对照组的细胞凋亡率分别为(57.2±9.1)%、(34.4±8.6)%、(14.4±3.6)%及(14.8±4.8)%,差异有统计学意义(F=42.5,P<0.05).转染一组、转染二组细胞凋亡率显著高于空白对照组(t值分别为9.7、4.5,P均<0.05).结论 抑制急性白血病细胞THP-1中SALL4基因表达后,Wnt/β-catenin信号通路的C-myc、Cyclin D1及β-catenin基因的表达随之下调,并促进了细胞凋亡.     

lncRNA MEG3对肝癌细胞增殖凋亡的影响及机制研究

目的探讨lncRNA MEG3对肝癌细胞增殖凋亡的影响及机制。方法 RT-PCR检测人肝癌HepG2细胞转染48 h后MEG3的mRNA表达;CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测ki67、PCNA、Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达。结果与pc DNA3.1组比较,pc DNA3.1-MEG3组MEG3的mRNA表达显著上升,pcDNA3.1-MEG3组细胞存活率显著降低,细胞凋亡率显著升高,Cleaved caspase3蛋白表达显著上调,ki67、PCNA、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著下调(P0.01)。结论 lncRNA MEG3高表达可抑制肝癌细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制与Wnt/β-catenin信号通路的调控有关。     

人参二醇皂苷通过调节上皮间质转化抑制喉癌细胞的增殖和迁移

目的 探讨人参二醇皂苷(PDS)对喉癌Hep2细胞增殖、迁移和上皮间质转化(EMT)的影响，并阐明其作用机制。方法 人喉癌Hep2细胞分为对照组和不同浓度的PDS(0,19,38,75,150,300 mg·L^-1)及地塞米松(100 nmol·L^-1)处理组，MTT实验检测细胞生长活力，HE染色观察细胞形态学改变，细胞划痕实验检测细胞迁移能力，实时定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测β-catenin、E-cadherin、N-cadherin和vimentin的mRNA和蛋白表达水平。结果 与对照组相比，PDS以时间及剂量依赖性抑制Hep2细胞生长。与对照组相比，用150 mg·L^-1 PDS处理喉癌Hep2细胞48 h后，可与地塞米松类似的下调细胞划痕愈合率，细胞形态向上皮型转化，上皮细胞标志物E-cadherin上调(P<0.05),间充质细胞标志物N-cadherin和vimentin下调(P<0.05),Wnt/β-catenin信号通路重要蛋白β-catenin...     

siRNA干扰β-catenin基因表达情况与喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡和侵袭的关系

目的探讨小干扰RNA(siRNA)干扰β-链蛋白(β-catenin)基因表达对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法前瞻性选取喉癌Hep-2细胞,随机分为空白对照组、阴性对照组和干扰组,其中干扰组转染靶向β-catenin的siRNA,阴性对照组转染空白siRNA。采用荧光定量PCR和Western-blot检测β-catenin mRNA和蛋白表达,MTT检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transell法观察细胞侵袭能力。结果干扰组β-catenin mRNA和蛋白相对表达量分别为(0.304±0.015)和(0.234±0.065),明显低于空白对照组和阴性对照组(P0.05);干扰组培养48 h和72 h吸光值分别为(0.721±0.250)和(0.942±0.321),明显低于空白对照组和阴性对照组(P0.05);干扰组细胞凋亡率为(19.10±1.24)%,明显高于空白对照组和阴性对照组(P0.05);干扰组穿膜细胞数为(22.41±3.25)个,明显低于空白对照组和阴性对照组(P0.05)。结论干扰β-catenin基因,可抑制喉癌Hep-2细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡。     

MiR-543对人白血病细胞株K562增殖与凋亡的调控及其机制研究

目的:探讨miR-543对人白血病细胞株K562增殖与凋亡的调控作用及其机制。方法:选择2018年2月-2018年9月在本院接受治疗的CML患者46例(男性27例,女性19例)作为CML组,同时选择30例同期体检健康者作为对照组。利用Lipofectamine 2000脂质体将miR-543模拟物(mimic)及阴性对照mimic转染至K562细胞后,应用CCK8方法检测miR-543对K562细胞增殖的影响,荧光素酶报告法分析miR-543对Wnt基因的靶向关系,流式细胞术检测miR-543对白血病细胞凋亡影响,Western blot方法检测Wnt、β-catenin、BCL-2、C-Myc及BAX表达水平。结果:慢性髓系白血病患者的miR-543水平显著低于健康对照组(P 0.05);miR-543 mimic组的miR-543的表达水平显著高于空白对照组(P 0.05);miR-543 mimic组的Wnt基因mRNA水平显著低于空白对照组(P 0.05)。miR-543 mimic可降低Wnt野生质粒的荧光素酶表达水平(P 0.05);miR-543 mimic对Wnt突变质粒的荧光素酶表达水平无抑制作用(P 0. 05)。miR-543 mimic组K562细胞增殖水平显著低于空白对照组及阴性对照scramble mimic组(P 0. 05)。miR-543 mimic组K562细胞凋亡水平显著高于空白对照组及阴性对照scramble mimic组(P 0. 05)。miR-543 mimic组细胞的Wnt、β-catenin、BCL-2及C-Myc蛋白水平均显著低于空白对照组及阴性对照(scramble mimic)组(P 0.05);miR-543 mimic组的BAX蛋白水平高于空白对照组及阴性对照(scramble mimic)组(P 0.05)。结论:miR-543可靶向Wnt蛋白,抑制Wnt信号通路活性,从而抑制白血病细胞的增殖能力,提高细胞凋亡水平。