RNA干扰双位点抑制Survivin基因诱导雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞凋亡

目的研究采用RNA干扰技术抑制雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞中Survivin 基因的表达对PC-3细胞增殖及凋亡的影响。方法设计2条靶向Survivin mRNA的Survivin shRNA,克隆至同一质粒载体,并鉴定分析;质粒转染PC-3细胞,绘制细胞生长曲线;并于转染48 h 后进行Survivin基因蛋白表达及细胞凋亡检测。结果酶切鉴定、测序分析证实负载双片段Sur- vivin shRNA的质粒载体构建成功。转染PC-3细胞后,细胞生长曲线示实验组PC-3细胞增殖明显受抑制;转染后48 h．实验组、阴性对照组、空白对照组Survivin蛋白表达强度分别为(4．62± O．84)％、(38．83±7．96)％和(40．98±3．83)％,实验组与两对照组相比差异均有显著性意义(P< 0．05);转染48 h后PC-3细胞凋亡率开始增加。结论负载双片段Survivin shRNA的质粒载体转染PC-3细胞后能明显抑制PC-3细胞增殖,抑制PC-3细胞Survivin蛋白表达,并能诱导PC-3细胞凋亡。但诱导PC-3细胞凋亡最明显的时机需要进一步观察。     

胰腺癌细胞survivin表达RNAi抑制载体的构建及其抑制作用的研究

目的构建胰腺癌细胞生存蛋白（survivin）表达的RNA干扰（RNAi）抑制载体，并研究其对survivin表达的抑制作用。方法用免疫荧光技术和RT-PCR检测胰腺癌细胞PANC-1中survivin及其mRNA的表达，并把survivin基因克隆到T载体进行测序；构建针对survivin缺失碱基基因和survivin基因的RNAi载体si-svv-1和si—SVV-2，用脂质体转染胰腺癌细胞PANC-1后，用RT—PCR、DNA梯状电泳及流式细胞术分析比较2种干扰载体对survivin mRNA表达的抑制情况和检测细胞凋亡。结果survivin在胰腺癌细胞PANC-1中高表达；si—svv-2对survivin mRNA的表达抑制率达（72．43&#177;8．04）％，而si—svv-1为0；si—svv-2能诱导胰腺癌细胞PANC-1的凋亡，72h细胞凋亡率达（12．36&#177;1．44）％。结论本研究成功建立胰腺癌细胞survivin表达RNAi抑制载体，该载体可特异有效地抑制胰腺癌细胞PANC-1survivin的表达并诱导胰腺癌细胞PANC-1凋亡。     

基因干扰技术抑制PC-3细胞90K/Mac-2BP基因mRNA表达并诱导细胞凋亡

目的研究人前列腺癌PC-3细胞90K/Mac-2BP基因干扰后其mRNA表达水平及细胞凋亡的效果。方法设计、构建多个针对90K/Mac-2BP的干扰性小RNA(small interfering RNA,siRNA),转染前列腺癌PC-3细胞,筛选出对90K/Mac-2BP基因干扰效率最高的90K/Mac-2BP siRNA,采用RT-PCR、Western blot技术检测90K/Mac-2BP mRNA及蛋白表达,酶标仪测定PC-3细胞的增殖,流式细胞仪检测PC-3细胞凋亡率。结果实验组和对照组前列腺癌PC-3细胞90K/Mac-2BP mRNA的表达强度分别为(19.23±1.33)%、(46.34±1.26)%,细胞凋亡率分别为(16.64±1.18)%、(2.52±0.19)%,两组差异有统计学意义(P<0.05)。表明构建的表达载体有效抑制了90K/Mac-2BP mRNA表达并诱导细胞凋亡。结论 RNA干扰可有效抑制PC-3细胞90K/Mac-2BP mRNA和蛋白表达,并诱导细胞凋亡。     

RNAi载体抑制survivin基因在胰腺癌PANC-1细胞中的表达

目的:观察survivin特异性RNAi载体对胰腺癌PANC-1细胞中survivin mRNA和蛋白的表达的抑制作用。方法:将U6启动子驱动的survivin特异性RNAi质粒载体和阴性对照质粒分别转染PANC-1细胞,用RT-PCR和Western blot分别检测survivin mRNA和蛋白的表达。结果:转染survivin特异性RNAi载体24 h和48 h后,PANC-1细胞survivin mRNA表达抑制率分别为(52.67±3.51)%和(75.33±3.06)%,蛋白表达抑制率分别为(58.00±3.61)%和(76.67±4.73)%;与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:以U6为启动子的survivin的RNAi载体,能有效地抑制胰腺癌细胞株PANC-1中survivin的表达。     

靶向survivin的RNA干扰对裸鼠前列腺癌的影响

目的探讨利用RNA干扰技术在裸鼠体内抑制survivin基因表达并诱导前列腺癌细胞凋亡的作用。方法设计、构建靶向survivin的重组质粒载体并导入裸鼠皮下移植瘤,称量瘤重,计算抑瘤率,应用RT-PCR法检测survivin基因的干涉效率,TUNEL染色法技术检测细胞凋亡效果。结果PBSsi-survivin A和PBSsisurvivin B两种阳性表达载体转染组均具有显著低瘤重和高抑瘤率特点,两组均显著抑制了Survivin mRNA表达,并诱导前列腺癌细胞凋亡。结论RNAi可有效抑制前列腺癌PC-3细胞survivin基因mRNA表达,减缓肿瘤生长,并诱导细胞凋亡。     

RNA干扰对前列腺癌PC-3细胞血管内皮生长因子表达的研究

目的:构建前列腺癌血管内皮生长因子(VEGF)RNA干扰(RNAi)真核表达载体,并研究RNAi对前列腺癌VEGF表达的影响。方法:合成VEGFRNAi片段,将RNAi片段定向克隆于RNAi表达载体,测序鉴定;RNAi表达载体转染人前列腺癌PC-3细胞,Western印迹法检测VEGFRNAi表达载体对VEGF蛋白表达的影响,MTT法检测转染VEGFRNAi表达载体对细胞生长的抑制作用。结果:成功构建VEGFRNAi真核表达载体;VEGFRNAi组VEGF蛋白的表达明显降低,显著低于空载体组和未转染的对照组;前列腺癌PC-3细胞24、48、72h的生长抑制率分别为23.5%、33.5%、40.8%。结论:VEGFRNAi可以抑制前列腺癌PC-3细胞蛋白的表达和抑制细胞生长,为前列腺癌的生物治疗提供一定的实验基础。     

双氢青蒿素对前列腺癌细胞PC-3M生长的影响及其机制探讨

目的:观察双氢青蒿素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M细胞凋亡和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:不同浓度(0、25、50、100μmol/L)的双氢青蒿素分别作用于PC-3M细胞48 h,MTT法检测细胞生长活性;流式细胞仪测定细胞凋亡率;分光光度法检测细胞凋亡过程中caspase-3、caspase-8活性变化;半定量RT-PCR法检测PC-3M细胞内VEGF mRNA的表达;Western印迹法检测细胞VEGF蛋白表达。结果:双氢青蒿素能显著抑制PC-3M细胞的增殖,与对照组(0μmol/L)的细胞凋亡率(2.92±0.45)%相比,各剂量组(25、50、100μmol/L)的细胞凋亡率[(8.85±0.74)%,(12.83±0.84)%,(18.65±1.24)%]显著增加,caspase-8[(0.47±0.05)U/μg vs(1.22±0.15)U/μg,(1.76±0.07)U/μg,(2.91±0.24)U/μg]、caspase-3[(0.44±0.07)U/μg vs(0.95±0.08)U/μg,(1.48±0.14)U/μg,(2.92±0.45)U/μg]活性显著增加,呈剂量依赖性(P<0.01)。PC-3M细胞内VEGF mRNA的表达和蛋白表达呈剂量依赖性降低。结论:双氢青蒿素能显著抑制体外PC-3M细胞的生长,并促进其凋亡,机制可能与增加凋亡蛋白酶和抑制VEGF表达有关。     

冬凌草甲素和survivin反义核苷酸对前列腺癌细胞作用的研究

目的探讨冬凌草甲素联合survivin反义核苷酸(反义链)对前列腺癌PC-3细胞株增殖和凋亡以及survivin m RNA和蛋白的影响。方法常规培养PC-3细胞,用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测survivin反义链联合冬凌草甲素对PC-3细胞增殖的影响;流式细胞仪(FCM)检测PC-3细胞凋亡率;以Calcu Syn药效学软件计算联合指数(CI)评价survivin反义链联合凌草甲素对PC-3细胞的联合效应,并通过荧光定量PCR和Western blot方法检测PC-3细胞survivin基因和蛋白表达变化。结果 survivin反义链转染PC-3细胞后,可以显著抑制PC-3细胞增殖,且能诱导PC-3细胞凋亡;冬凌草甲素联合survivin反义链对PC-3细胞增殖抑制率较两者单用组明显增强,显示出协同效应(Fa0.8);冬凌草甲素和survivin反义链联用对PC-3细胞凋亡诱导作用更为显著(P0.01);荧光定量PCR及Western blot显示反义链和冬凌草甲素均使survivin m RNA和蛋白表达下降,两者联合使survivin m RNA和蛋白表达下降更明显(P0.01)。结论 survivin基因反义链和冬凌草甲素均能明显抑制PC-3增殖、诱导细胞凋亡和下调survivin基因和蛋白表达;两者联合作用有协同效应。     

基质交联分子1对前列腺癌PC-3细胞凋亡相关蛋白表达的影响

目的:观察抑制基质交联分子1(STIM1)对前列腺癌PC-3细胞凋亡相关蛋白表达的影响。方法:将携带STIM1基因的小干扰RNA(shRNA)慢病毒载体STIM1-pGCSIL-GFP转染人激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞,3d后荧光倒置显微镜观察转染效率;1周后RT-PCR及Western印迹验证STIM1抑制表达有效性,并采用Western印迹检测PC-3细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax,survivin、激活型Caspase-3的表达水平。结果:倒置显微镜观察发现PC-3细胞病毒转染效率80%。转染1周后,RT-PCR及Western印迹显示STIM1被有效抑制。抑制STIM1表达后,对照组Bcl-2/Bax比率为1.24,干扰组PC-3细胞Bcl-2/Bax比率为0.31,比率显著下降;干扰组PC-3细胞survivin表达明显降低,相对表达量为对照组的0.14倍;Caspase-3裂解激活相对表达量为对照组的1.52倍(P0.05)。结论:STIM1在前列腺癌PC-3细胞中可视为致癌基因,抑制其表达可通过下调Bcl-2/Bax比率,降低survivin表达,激活Caspase-3级联通路,诱导细胞凋亡。     

靶向survivin基因不同位点的siRNA对PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察靶向survivin基因不同位点的小干扰RNA(siRNA)对人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞survivin mRNA表达的抑制作用以及对细胞增殖和凋亡的影响. 方法 根据survivin mRNA的结构特点,选取2个不同的作用位点,设计和构建负载survivin shRNA片段的2种重组质粒载体.以脂质体法转染PC-3细胞株,荧光显微镜下观察转染效率.实验分为survivin 1组、survivin 2组、阴性对照组和空白对照组.转染后24、48和72 h,用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中survivin mRNA的表达,MTT法检测siRNA对PC-3细胞增殖的影响,流式细胞术检测凋亡率. 结果 与对照组相比,survivin 1组、survivin 2组对survivin mRNA的表达均能产生抑制效应,48 h抑制率最高,survivin 1抑制率高,达52%.实验组均能抑制PC-3细胞的增殖,survivin 1抑制细胞增殖的能力强.转染48 h后,细胞凋亡最明显,survivin 1组凋亡率高,达13.6%±1.8%. 结论 在RNAi研究中,根据特定靶基因mRNA的结构特点来进行siRNA的设计和筛选,在前列腺癌的基因治疗中具有一定的实际应用价值.     

生存素反义核酸增加人结肠癌对泰素帝的化疗敏感性

目的探讨生存素(survivin)反义RNA真核表达质粒pcDNA3.0/survivin对泰素帝诱导人结肠癌多药耐药细胞株LOVO/Adr凋亡的影响。方法将已构建成功的survivin反义RNA真核表达质粒pcDNA3.0/survivin用脂质体瞬时转染LOVO/Adr细胞,以RT-PCR法检测质粒转染前后细胞survivinmRNA的变化,用MTT法和流式细胞术分别观察泰素帝对转染细胞的毒性作用和细胞凋亡变化。结果pcDNA3.0/survivin明显下调LOVO/Adr细胞survivinmRNA表达,MTT检测发现,泰素帝对转染pcDNA3.0/survivin、pcDNA3.0及未转染细胞抑制率分别为(37.3±2.9)%,(21.9±2.3)%和(21.1±1.9)%,前者与后两者间差异具有统计学意义(P<0.01);流式仪分析显示,各组细胞凋亡率分别为(28.7±1.7)%、(13.4±1.6)%与(14.3±1.8)%,前者与后两者间差异有统计学意义(P<0.01)。结论Survivin反义RNA真核表达质粒pcDNA3.0/survivin能下调LOVO/Adr细胞survivin基因表达,增加其对泰素帝的敏感性,为临床提高结肠癌疗效提供了一种新思路。     

Combining siRNAs at two different sites in the EGFR to suppress its expression, induce apoptosis, and enhance 5-fluorouracil sensitivity of colon cancer cells

BACKGROUND: The epidermal growth factor receptor (EGFR) has played an important role in the growth and apoptosis of colon cancer. The RNA interference (RNAi) technique can suppress gene expression, but the effects of double combining sites RNAi targeting EGFR have not been well understood. METHODS: pU6-EGFR-shRNA-1 and pU6-EGFR-shRNA-2 expressive vectors were transfected to the LoVo cells. Five groups were selected for the study: Group 1, the control cells; group 2, the negative control plasmid vector HK; group 3, pU6-EGFR-shRNA-1; group 4, pU6-EGFR-shRNA-2; group 5, pU6-EGFR-shRNA-1 and pU6-EGFR-shRNA-2, half for each. The mRNA and protein expression were assessed by Real Time quantitative PCR and Western blot. Apoptosis was determined via flow cytometry. IC(50) and the inhibition ratio of 5-fluorouracil (5-FU) were carried out by CCK-8. RESULTS: In groups 3, 4, and 5, the mRNA expression was decreased by (80.22 +/- 3.42)%, (81.30 +/- 2.83)%, and (90.58 +/- 2.76)%, respectively, and the protein expression was decreased by (74.11 +/- 4.02)%, (73.39 +/- 2.30)%, and (90.39 +/- 3.34)%, respectively. Meanwhile, the cell apoptosis increased by (10.43 +/- 0.49)%, (10.13 +/- 0.39)%, and (14.17 +/- 0.53)%, respectively. The IC(50) of 5-FU and cell inhibition ratio analysis demonstrated that there were significant differences between the following three: group 5, groups 3 and 4, and groups 1 and 2. CONCLUSIONS: Both pU6-EGFR-shRNA-1 and pU6-EGFR-shRNA-2 are capable of suppressing EGFR expression of the LoVo cell and can promote apoptosis and increase the cell toxicity of 5-FU. The double combining sites RNAi technique is significantly better than a single site.     

双位点小干扰RNA靶向抑制表皮生长因子受体促大肠癌细胞凋亡和5-氟尿嘧啶化疗增效的实验研究

目的观察针对单位点与双位点的RNA干扰技术抑制大肠癌LoVo细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达,诱导细胞凋亡以及对5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的差异。方法构建质粒表达载体pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2,脂质体转染人大肠癌LoVo细胞,G418筛选4周,分5组:1组为LoVo细胞,2组为对照质粒载体HK,3组为pU6-EGFR-shRNA-1,4组为pU6-EGFR-shRNA-2,5组为pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2各半量。实时荧光定量PCR和Westernblot检测mRNA和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率,细胞増殖分析试剂CCK-8(CellCountingKit-8)测定5-FU不同浓度和时间对LoVo细胞的抑制率和半数抑制浓度(IC50)。结果正确构建了短发夹状RNA(shRNA)质粒表达载体,成功转染;3、4、5组mRNA表达分别下降了(80·2±3·4)%、(81·3±2·8)%和(90·6±2·8)%,蛋白表达分别下降了(74·1±4·0)%、(73·4±2·3)%和(90·4±3·3)%,凋亡率增加了(10·4±0·5)%、(10·1±0·4)%和(14·2±0·5)%,同时对5-FU的IC50和细胞抑制率作统计学分析,5组,3、4组和1、2组三者之间比较差异有统计学意义,而1组2组间、3组4组间各项比较差异无统计学意义。结论两条shRNA均可有效抑制LoVo细胞EGFR表达,促进细胞凋亡,提高5-FU对癌细胞的杀伤作用,靶向联合位点的RNA干扰技术较单一位点的干扰效果更显著,为大肠癌的基因治疗联合化疗提供了新的思路。     

RNAi对GBC-SD细胞survivin基因表达及阿霉素敏感性的影响

目的 利用RNA干扰(KNAi)技术沉默人胆囊癌GBC-SD细胞中抗凋亡基因survivin,观察survivin基因表达的变化以及其对阿霉素的敏感性.方法 将靶向survivin的基因片段插入到栽体后构建重组质粒,将其导入GBC-SD细胞,RT-PCR及Westem-blotting法检测转染前后GBC-SD细胞survivin mRNA及蛋白水平的表达情况,MTT法检测转染前后GBC-SD细胞对阿霉素的敏感性变化.结果 成功构建重组质粒.转染重组质粒后,GBC-SD细胞survivin mRNA和蛋白的表达明显降低;转染前后阿霉素对GBC-SD细胞生存率具显著影响.结论 靶向survivin的RNAi表达载体能下调survivin基因表达,进而增强阿霉素对GBC-SD细胞化疗敏感性.     

应用RNA干扰技术阻断PC-3细胞中survivin基因的表达

目的:用真核转录载体pS ilencerTM3.1-H1 neo构建针对survivin基因的重组真核转录载体,并转染前列腺癌细胞系PC-3,通过RNA干扰(RNA i)阻断PC-3细胞中survivin基因的表达,并研究survivin基因沉默后对PC-3细胞凋亡产生的影响。方法:将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pS ilencerTM3.1-H1 neo线性质粒用T4DNA连接酶连接,重组质粒经酶切及DNA测序鉴定后,用脂质体法转染PC-3细胞,通过RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验检测survivin的表达变化,并用流式细胞术检测转染后PC-3细胞的凋亡变化,MTT法检测细胞生长速度的变化。结果:酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体。RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验表明,pS ilencer3.1-SVV2和pS ilencer3.1-SVV3重组载体有效地阻断了PC-3细胞中survivin基因的表达,survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%~15%,细胞生长速度明显变慢。结论:成功构建了针对survivin基因的真核转录载体pS ilencer3.1-SVV1、pS ilencer3.1-SVV2和pS ilencer3.1-SVV3,后两者可有效地阻断前列腺癌细胞系PC-3细胞中survivin基因的表达,并使转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%~15%,细胞生长速度明显变慢。     

三氧化二砷对前列腺癌细胞株PC-3生长影响的研究

目的 :探讨三氧化二砷 (As2 O3 )对雄激素非依赖性人前列腺癌细胞株PC 3生长的影响及其机制。　方法 :通过光学显微镜观察As2 O3 处理前后培养的PC 3细胞生长和形态的变化 ,采用MTT法了解不同浓度As2 O3 作用后PC 3细胞的生长抑制曲线 ,应用流式细胞仪Annexin V FITC/PI双染法分析不同浓度As2 O3 处理的PC 3细胞的凋亡情况。　结果 :As2 O3 作用后 ,PC 3细胞形状变圆 ,体积变小 ,胞质透亮度下降 ,部分细胞脱落悬浮于培养基中。在7.81 2 5、1 5 .6 2 5、31 .2 5 0、6 2 .5 0 0、1 2 5、2 5 0、5 0 0 μmol/LAs2 O3 作用 4 8h和 72h后 ,MTT法检测细胞生长抑制率分别为(0 .0 6± 0 .99)、(1 5 .0 1± 1 .1 2 )、(2 9.2 1± 1 .31 )、(34.32± 1 .1 4 )、(4 0 .5 1± 1 .81 )、(6 9.39± 1 .74 )、(73.1 9± 2 .4 1 ) %和(0 .0 4± 1 .5 1 )、(1 6 .1 9± 1 .0 4 )、(4 3.6 1± 1 .1 2 )、(5 6 .6 6± 1 .2 3)、(73.1 3± 2 .6 1 )、(85 .2 2± 1 .74 )、(91 .4 1± 2 .81 ) %。用流式细胞仪检测经过 0 (对照组 )和 0 .1、1 .0、3.0、5 .0、2 0 .0、5 0 .0 μmol/LAs2 O3 作用 4 8、72h后的PC 3细胞 ,凋亡率分别为 0 .87%、5 .33%、8.94 %、9.6 6 %、1 2 .5 6 %、4 5 .5 9%、6 9.0 9%和 0 .1 3%、1 3.4 9%、     

转染抑癌基因KLF6对前列腺癌PC-3细胞的作用研究

目的:研究抑癌基因KLF6对人前列腺癌细胞系PC-3细胞的生长增殖、细胞周期和对Bc l-2和Cyc lin D1蛋白表达的影响及其可能的作用机制。方法:利用RT-PCR法克隆目的基因KLF6,采用阳离子脂质体介导将含或不含KLF6的pEGFP-C1质粒转染入PC-3细胞,分别作为转染组和对照组。分别进行噻唑蓝(MTT)法观察PC-3细胞的生长抑制率,流式细胞仪检测细胞周期比例变化和凋亡率,免疫组化法观察PC-3细胞Bc l-2和Cyc lin D1的表达水平变化。结果:转染了抑癌基因KLF6的前列腺癌PC-3细胞生长抑制率为(30.0±5.4)%(对照组为0%,P<0.01);细胞周期比例表现为G2/M期减少为(11.2±0.9)%[对照组为(25.2±2.8)%,P<0.05],G0/G1期比例增加为(80.0±9.8)%[对照组为(58.6±7.3)%,P<0.05];细胞凋亡峰为(24.3±2.3)%[对照组为(5.2±0.7)%,P<0.01];Bc l-2的表达率为(18.7±3.2)%[对照组为(41.8±5.9)%,P<0.01];Cyc lin D1的表达率为(25.3±3.7)%[对照组为(38.5±4.6)%,P<0.05]。结论:抑癌基因KLF6的转染可以明显抑制前列腺癌PC-3细胞的生长增殖,并诱导其凋亡,其作用机制可能与下调Bc l-2和Cyc lin D1的表达有关。