阿姆西汀抗抑郁作用的细胞调控机制

目的：在体外细胞水平探讨阿姆西汀的抗抑郁作用机制。方法分离培养新生大鼠海马神经前体细胞,采用ATP生物发光法检测阿姆西汀对神经前体细胞增殖的影响;以皮质酮损伤原代培养大鼠海马神经元为模型,检测阿姆西汀的细胞保护作用;并采用PKA特异性抑制剂H89探讨其可能的作用机制。结果0．5～2．5μmol／L阿姆西汀可浓度依赖性地促进神经前体细胞的增殖;100μmol／L 皮质酮对神经元具有明显的损伤作用,2．5,5μmol／L阿姆西汀可显著逆转皮质酮的损伤作用,度洛西汀具有同样的作用;并且10μmol／L H89可取消以上作用。结论阿姆西汀在体外具有促进神经元再生和对神经元损伤的保护作用,这可能是阿姆西汀抗抑郁效应的重要细胞机制,且这一作用可能与cAMP-PKA-CREB通路有关。     

李氏5号方水提液对神经元游离钙浓度的影响

目的观察李氏5号方水提液(LQET)对神经元游离钙浓度的影响。方法取出生1天内的SD大鼠,分离培养海马神经元,用阿糖胞苷抑制胶质细胞生长,细胞培养到第9~12天进行细胞内钙荧光测定。用荧光指示剂Fluo-3/AM负载细胞45min,借助共聚焦显微镜钙成像技术测定在30mmol/L的KCl作用下,不同干扰因素下培养的海马神经元胞浆游离钙荧光强度。结果正常条件下培养的神经元,细胞内游离钙浓度为75.67±8.65nmol/L,LQET使细胞内游离钙浓度提高到126.35±9.35nmol/L,但仍在正常上限范围内;L-型钙通道阻断剂硝苯地平预处理24h,30mmol/LKCl激活的细胞游离钙浓度降低到40.65±5.65nmol/L,与正常对照组比较差异显著。LQET与硝苯地平共同预处理后细胞游离钙浓度降低到90.75±10.15nmol/L,与单纯LQET预处理组和单纯硝苯地平组比较差异显著。10μmol/LNMDA能明显增加细胞内钙荧光强度,且能在某一强度稳定,NMDA受体阻断剂MK-801可显著阻断这一效应。LQET预处理后,NMDA导致的胞浆钙荧光强度的增强效应明显降低,MK-801预处理后,LQET降低NMDA增强细胞内荧光的效应显著降低。结论LQET能通过L-型钙通道和NMDA受体对神经元细胞内钙浓度进行双向调定。     

力竭游泳对大鼠海马突触体内游离钙浓度的影响

目的 :探讨力竭游泳对大鼠海马突触体内游离钙浓度的影响。方法 :Fura -2荧光法测游离钙浓度。结果 :力竭游泳大鼠海马突触体内游离钙浓度显著升高 (P <0 .0 5 )。结论 :力竭游泳可致海马内钙稳态失衡     

成年大鼠弥漫性脑损伤后海马齿状回神经前体细胞增殖的Glu - iGlURs通路机制研究

 目的观察选择性iGluRs拮抗剂MK-801对弥漫性脑损伤后齿状回神经发生的调控作用,探讨Glu-iGluRs通路在神经发生中的角色.方法选用成年弥漫性脑损伤大鼠模型,采用BrdU标记分裂细胞及免疫组织化学方法,比较弥漫性脑损伤后2、4、6、8、12 d时MK-801干预弥漫性脑损伤组大鼠与相应对照组大鼠之间海马齿状回神经前体细胞的增殖速度.结果MK-801 1 mg/kg腹腔注射后,明显抑制了成年大鼠弥漫性脑损伤后4、6、8、12 d时齿状回神经前体细胞增殖,BrdU免疫阳性细胞数目较相应对照组明显减少(P＜0.01).结论弥漫性脑损伤后脑组织Glu-iGluRs通路的激活促进了海马齿状回神经发生,在这一过程中,NMDA受体介导的级联生物学事件可能发挥了重要作用.     

体外诱导大鼠成肌细胞转化为成骨前体细胞的实验研究

目的:探讨大鼠成肌细胞体外能否转化为成骨前体细胞.方法:从新生大鼠骨骼肌分离单细胞,体外培养,运用差速贴壁法和(或)酶消化法纯化细胞,培养至第3代时,加入含重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)的培养液进行诱导,3周后对诱导细胞进行鉴定,其指标包括:细胞形态、碱性磷酸酶染色及其活性、Ⅰ型胶原免疫组化染色和钙结节染色,实验数据采用SAS 9.1.3软件包进行统计学分析.结果:成肌细胞诱导后,细胞增殖减缓,相邻细胞聚集呈层状排列,诱导7 d可见胞浆有少量不透光结节,诱导2周结节增多,3周时胞浆内可见大量不透光结节,对照组成肌细胞融合成有收缩性的肌管.诱导后的成肌细胞碱性磷酸酶活性随时间延长而增强,诱导3周时碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原和钙结节染色均呈阳性表达.结论:大鼠成肌细胞在体外一定条件下诱导后能够转化为成骨前体细胞.     

慢性压迫性脊髓损伤后神经前体细胞的增殖情况

目的　通过分析成年大鼠慢性压迫性脊髓损伤后及减压后巢蛋白表达的变化 ,探讨神经前体细胞的增殖。　方法　选用健康Wistar大鼠 5 0只 ,体重 2 80～ 32 0g。制备慢性压迫性脊髓中度、重度损伤及重度压迫损伤减压后 3,10d模型 ,自距压迫边缘至 5mm段脊髓组织切片。正常成年健康大鼠作为正常对照组。巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白采用免疫组织化学染色 ,计算机图像分析仪定量分析 ,观察神经前体细胞的增殖情况。　结果　成年大鼠慢性压迫性脊髓中、重度损伤及重度压迫损伤减压后 3d ,巢蛋白在白质、灰质及脊髓中央管的室管膜细胞和减压后 10d组白质中均有明显表达 (P <0 .0 5 ) ,以重度压迫组最为显著 (P <0 .0 1)。减压后 10d组灰质与正常对照组比较 ,差异无显著性意义 (P >0 .0 5 )。与正常对照组相比 ,各损伤组脊髓内胶质纤维酸性蛋白表达增强 ;胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数目增多 ,胞体肥大 ,突起增粗、增长。　结论　成年大鼠慢性压迫性脊髓损伤及减压后早期存在神经前体细胞增殖。星形胶质细胞参与神经前体细胞的增殖与迁移 ,对脊髓具有重要的营养修复作用。     

大鼠肝卵圆细胞体外分离培养和诱导分化为肝细胞的初步研究

目的 探索体外诱导成年Wistar大鼠肝卵圆细胞(HOCs)分化为肝细胞的可行性.方法 雄性Wistar大鼠36只,建立肝卵圆细胞增殖模型,采用两步法灌注和Percoll密度梯度离心法分离纯化HOCs,行体外培养并添加HGF、OSM和FGF4诱导其分化.结果 每只模型大鼠肝脏体外分离可获得约1.34×105/ml HOCs,细胞为圆形、椭圆形或多角形,大小为正常肝细胞1/6～1/3,核质比例大,2周后可呈克隆样增殖生长.所获HOCs胞浆和胞膜表达干细胞标志Thy-1及C-kit,其原始细胞标志AFP呈阳性表达;能稳定传代,在HGF、OSM和FGF4刺激下形态逐渐发生改变,细胞伸展且体积渐增大,贴壁能力减弱,诱导14天后分化细胞Alb表达明显阳性,且随着诱导时间延长阳性率逐渐升高;诱导分化的细胞胞浆G-6-P及PAS染色均呈阳性.结论 HOCs在体外一定条件刺激下可诱导分化为肝细胞.     

穴位电针刺激对大鼠骨骼肌胞浆钙离子浓度的影响

目的:通过在大鼠穴位上进行电针刺激,观察刺激组和对照组大鼠骨骼肌胞浆内Ca2 浓度的变化,以及两组Ca2 变化速度和幅度的差别,探讨穴位电针刺激对肌肉快速收缩和舒张的积极效果.方法:对大鼠活体"大椎"、"命门"、"足三里"、"承山"4个穴位施加频率小于1000Hz、持续15分钟的音频脉冲调制波电针刺激,效应20分钟后,实验组和对照组大鼠以同一程序处死,分离出单个骨骼肌活细胞,采用激光扫描共聚焦显微镜与新一代钙荧光指示剂Fluo-3/AM结合的方法对骨骼肌单个活细胞内游离钙的浓度进行对比.结果:通过观察比较刺激组和空白对照组胞浆内游离钙浓度的动态变化的差异,发现穴位电针刺激可以改变骨骼肌细胞胞浆内游离钙浓度,即胞浆内的Ca2 浓度在肌肉收缩时出现了较快、较大幅度的升高,肌肉舒张时出现了较快、较大幅度的下降.     

神经生长因子对小鼠脑突触体游离钙的调节作用

本文报导在离体情况下,NGF对青年(1月龄)和老年(18月龄)小鼠海马突触体内游离钙浓度的影响,以及在不同钙浓度条件下,NGF对Ca~(2 )的调节作用。结果表明:①不同浓度的NGF对青年小鼠海马突触体内的游离钙离子均无明显作用;②只有浓度为10μg/ml的NGF,可显著降低老年小鼠海马突触体内的游离钙离子浓度(P<0.05);③当胞内钙水平较低时,NGF具有升高钙离子浓度的作用,反之,则具有降低钙离子浓度的作用。提示NGF对Ca~(2 )的调节作用呈双向性。     

MK-801对成年大鼠弥漫性脑损伤后海马齿状回神经发生的影响

通过观察选择性N 甲基 D 天门冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂MK 80 1对弥漫性脑损伤后齿状回神经发生的调控作用 ,探讨谷氨酸在神经发生中的作用。将 45只成年雄性SD大鼠制成弥漫性脑损伤模型 ,并随机分为MK 80 1干预组、生理盐水干预组和对照组(n =15 ) ,采用BrdU标记分裂细胞及免疫组织化学方法比较弥漫性脑损伤后 2、4、6、8、12天时大鼠海马齿状回神经前体细胞的增殖速度。结果显示 ,腹腔注射MK 80 1(1mg/kg)后明显抑制了成年大鼠弥漫性脑损伤后 4、6、8、12天时齿状回神经前体细胞的增殖 ,BrdU免疫阳性细胞数目较相应对照组明显减少 (P <0 0 1)。表明弥漫性脑损伤后脑组织NMDA受体的激活促进了海马齿状回神经发生 ,在这一过程中谷氨酸介导的级联生物学事件可能发挥了重要作用。     

VEGF、bFGF联合应用对胎鼠大脑皮质神经干细胞分化的影响

目的观察血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合应用对胎鼠大脑皮质神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法取孕14dSD大鼠,收集胎鼠大脑皮质NSCs,采用无血清培养基传代培养,取P3代细胞,分别加入200μg/LVEGF和(或)20μg/LbFGF进行诱导分化,并设对照组(不加VEGF和bFGF),7d后采用免疫细胞化学方法检测巢蛋白(Nestin)、β微管蛋白-Ⅲ(β-tubulin-Ⅲ)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。结果从胎鼠大脑皮质中分离的细胞在体外悬浮生长,形成致密的球形细胞团,传代后能形成新的细胞球,免疫细胞化学染色显示细胞球nestin表达阳性。诱导分化后的细胞部分表达β-tubulin-Ⅲ,部分表达GFAP。与对照组比较,VEGF和(或)bFGF均可使NSCs向神经元方向分化的比例增加,其中VEGF+bFGF联合作用后NSCs的β-tubulin-Ⅲ阳性率(80.3%)最高,GFAP阳性率(18.6%)最低。bFGF作用后NSCs的β-tubulin-Ⅲ阳性率(60.4%)和GFAP阳性率(38.5%)与VEGF作用后(分别为60.3%、38.7%)比...     

新生鼠大脑皮层局灶性缺血区的神经前体细胞移植

目的 观察神经前体细胞植入新生鼠局灶性缺血区内的存活和融合情况。方法 应用含表皮生长因子 碱性成纤维生长因子诱导因子的无血清D／F12(1：1)培养获得新生鼠神经前体细胞球并在培养中掺入5-溴-2′-脱氧尿嘧啶标记，免疫酶技术检测nestin标志和分化诱导实验证明所获得的细胞球是神经前体细胞，去脑膜结扎小动脉手术制作新生鼠脑皮层局灶性缺血动物模型，将标记好的神经前体细胞直接注射到缺血损伤灶的边缘区，定期免疫组化染色观察植入细胞的分布、存活和与宿主脑组织的融合情况。结果 缺血损伤侧的脑皮层内带标记的细胞量明显要多于实验对照的对侧，植入的神经前体细胞主要向损伤灶的颗粒层聚集，未见远部位迁移，与宿主脑皮层组织有很好的融合。结论 大脑皮层缺血性损伤可刺激神经前体细胞发育，提示新生动物缺血性脑损伤疾病有希望通过神经前体细胞移植获得治疗。     

荧光显微数字成像系统对神经元内游离钙的动态测量

目的研究神经元内Ca2 浓度的动力学变化,建立动态检测细胞内Ca2 浓度的方法。方法原代培养大鼠大脑神经元,以N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)刺激神经元,用荧光显微数字成像系统测定Ca2 浓度的变化。结果荧光显微数字成像系统测量的细胞荧光图像分析显示,神经元Ca2 在NMDA的刺激下迅速发生改变,并被全程记录。结论以荧光显微数字成像系统实时监测细胞内Ca2 的动力学变化,不失为一种代替激光共聚焦显微镜测量细胞内游离钙的有效方法。     

食蟹猴骨髓基质干细胞体外诱导分化的实验研究

为观察食蟹猴骨髓基质干细胞（BMSC）体外培养及诱导分化情况，分离食蟹猴的BMSC，以神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化。结果发现，分离得到的食蟹猴BMSC能在体外培养中增殖，分化，这些具有克隆能力的BMSC能表达神经干细胞特异性抗原Nestin，并能进一步诱导分化出胶质细胞样细胞和神经元样细胞，免疫细胞化学检测可见有GFAP和NSE抗原表达。提示灵长类BMSC是多分化潜能细胞，具有较强的自我更新和多分化能力，在适当的诱导分化条件下可形成具有神经系细胞（神经元和神经胶质细胞）特征的细胞；BMSC可作为神经干细胞的种子细胞。     

siRNA对体外培养大鼠海马神经细胞NgR基因表达的抑制

目的 研究siRNA对体外培养的大鼠海马神经细胞NgR基因表达抑制作用,为进一步研究中枢神经损伤修复提供实验基础.方法 使用阳离子脂质体转染试剂将体外化学合成的针对NgR基因的siRNA转染体外培养的海马神经细胞,GAP43对培养细胞进行鉴定,分别于转染后48小时、1周收集转染细胞,提取总蛋白并定量.结果 海马神经细胞成功培养,转染48小时后NgR蛋白的含量为阴性对照组的45.11%,差异显著P＜0.05;转染1周后NgR蛋白的含量为阴性对照组的99.18%,差异不明显.结论 化学合成的针对NgR基因的siRNA在转染48小时后能显著下调NgR基因表达,但在转染1周后对NgR基因表达影响不明显.     

锶对人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

目的观察锶(Sr)对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)增殖及成骨分化的影响并探索其最佳作用浓度。方法抽取健康成年志愿者骨髓6ml,体外分离、培养原代hMSCs,流式细胞术鉴定细胞表型。取第4代细胞进行实验,共分为5组,A组为空白对照,培养液中仅加入骨诱导剂(地塞米松10-8mol/L、抗坏血酸50μg/ml、β-甘油磷酸钠10mmol/L,B、C、D、E组培养液在加入骨诱导剂后分别加入3.75×10-3、3.75×10-2、3.75×10-1、3.75mmol/L的SrCl2。定期测定各组hMSCs的增殖情况(MTT法)、碱性磷酸酶(ALP)活性(酶标法)和骨钙素(OCN)含量(放免法),并观察细胞茜素红钙结节染色情况,分析各组钙结节数量及面积。结果随培养时间延长,各组细胞增殖和成骨分化均明显提高(P<0.01)。组间比较显示,第7天时的细胞增殖水平,第7、14天的ALP活性,第14、21天的OCN含量以及第21天的茜素红钙结节数量和面积测定结果,B-E组均明显优于A组(P<0.05);D、E组第7天时的细胞增殖水平及第14天的ALP活性均明显高于A、B、C组(P<0.05),而D组与E组比较无显著差异(P>0...     

红细胞生成素(EPO)对脑源性神经干细胞增殖与分化的调控作用

目的探讨红细胞生成素(EPO)对大鼠海马神经干细胞(NSCs)体外增殖和分化的影响。方法利用无血清培养、单细胞克隆技术,体外培养SD大鼠海马组织源NSCs,在NSCs增殖和分化过程中添加不同剂量EPO,以免疫细胞化学方法对NSCs及其分化后的细胞进行鉴定。结果与对照组相比,不同接种密度条件下的NSCs加入EPO后,增殖期表达Nestin的细胞增加2～4倍,分化期表达Nestin的细胞数明显减少;表达Tuj1和GFAP的细胞出现早,且Tuj1阳性细胞较对照组明显增加(P<0.05),加入antiEPO后Tuj1阳性细胞较对照组明显减少(P<0.01);相同细胞接种密度下,添加不同剂量EPO后Tuj1阳性细胞数呈剂量依赖性增加。结论EPO可促进大鼠海马源NSCs的增殖,并使其呈剂量依赖性的向神经元分化。     

利拉鲁肽对缺氧和高糖所致心肌细胞钙超载和细胞凋亡的影响

 目的 研究利拉鲁肽对缺氧和高糖所致心肌细胞钙超载和细胞凋亡的影响。方法 采用原代培养的乳鼠心肌细胞,建立缺氧和高糖模型。实验分为:正常对照组、利拉鲁肽对照组、缺氧和高糖模型组、利拉鲁肽处理组、胰高血糖素样肽-1 (glucagon like peptide-1, GLP-1)受体抑制剂组、高渗对照组6组。采用荧光分光光度法检测心肌细胞内钙离子变化,化学荧光法检测活性氧族(reactive oxygen species, ROS)水平、利用生化方法检测Ca²⁺-ATP 和Na⁺-K⁺-ATP酶活性、RT-PCR技术检测钙敏感的钙蛋白酶(μ-calpain)基因表达、流式细胞仪测定细胞凋亡率、ELISA法检测细胞caspase-3活性。结果 与正常对照组相比,缺氧高糖模型组细胞内ROS水平、μ-calpain mRNA表达量、caspase-3活性均显著升高(P<0.01);Ca²⁺-ATP 和Na⁺-K⁺-ATP酶活性显著降低(P<0.01);游离钙离子浓度由(117.19±15.04)nmol/L增加至(508.53±26.11)nmol/L,细胞凋亡率由(3.95±0.12)%增加至(31.03±4.30)%(P<0.01)。利拉鲁肽处理组细胞较缺氧高糖模型组上述参数均明显改善,游离钙离子浓度和细胞凋亡率显著降低(P<0.01);GLP-1R抑制剂exendin(9-39)可拮抗利拉鲁肽的上述作用(P<0.05)。结论 利拉鲁肽可明显抑制缺氧和高糖所致心肌细胞钙超载及μ-calpain基因的上调,降低caspase-3水平,减少心肌细胞凋亡,对心肌细胞具有保护作用。