RYBP在急性白血病中的表达

目的:观察RYBP(Ring1 and YY1-binding protein)在急性白血病中的表达情况,初步探索其在急性白血病中的临床意义。方法:应用蛋白质免疫印迹(western blot)技术分别检测急性单核细胞白血病细胞株SHI-1、急性早幼粒白血病细胞株HL-60、慢性粒细胞白血病细胞株K562、51例初治急性白血病(AL)患者、23例急性白血病完全缓解(ALCR)患者和21例对照(非恶性血液病)患者骨髓单个核细胞中RYBP的表达情况。结果:SHI-1、HL-60及K562细胞株RYBP表达均为强阳性;21例阴性对照中RYBP表达均为阴性。AL组RYBP表达阳性率为73%,ALCR组阳性率为13%,AL组RYBP表达阳性率及表达量比ALCR组及对照组明显增高(P<0.05)。结论:RYBP在急性白血病细胞中表达水平异常增高,提示RYBP可能与急性白血病密切相关。     

RYBP基因沉默对HL-60细胞对化疗药物敏感性的影响

目的:用RNA干扰技术探讨白血病HL-60细胞株RYBP基因沉默后对化疗药物敏感性的影响。方法:构建针对RYBP基因的shRNA干扰质粒并建立稳定沉默RYBP基因的白血病HL-60细胞株,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测确认RYBP基因在mRNA和蛋白水平的沉默效果。然后用DNA ladder及Annexin V标记的流式细胞术检测各组HL-60细胞凋亡的情况,用CCK-8法检测各组HL-60细胞对化疗药物阿糖胞苷和柔红霉素的敏感性。结果:成功构建的RYBP shRNA慢病毒载体能够有效沉默HL-60中RYBP基因的表达。在没有加入化疗药物时RYBP shRNA组凋亡率低于空载体对照组(NC组)(P0.05);用阿糖胞苷处理时RYBP shRNA组凋亡率和抑制率均低于NC组(P0.05);用柔红霉素处理时RYBP shRNA组凋亡率虽然低于NC组,但是抑制率差异不明显。结论:HL-60细胞RYBP基因沉默能抑制细胞的凋亡,明显降低对阿糖胞苷的敏感性,但是对柔红霉素敏感性的改变不明显。     

白血病HL-60、HL-60A细胞Cyclin D1、hTERT表达和端粒酶活性及意义

本研究旨在观察cyclin D1、hTERT和端粒酶在正常人单个核细胞(MNC)、HL-60和HL-60A中的表达及活性,并探讨它们与白血病发生及耐药的关系。实验用正常人外周血MNC、耐药白血病细胞株HL-60和HL-60A,采用流式细胞仪检测细胞周期,Annex in V-FITC+PI染色法检测细胞凋亡,real-tim e PCR和W estern b lot检测细胞cyclin D1、hTERTmRNA及蛋白表达,TRAP-ELISA法检测细胞端粒酶活性。结果表明:MNC、HL-60、HL-60A的S期细胞比例分别为(10.21±2.11)%、(44.93±3.00)%、(51.38±1.10)%;凋亡细胞比例分别为(16.14±2.13)%、(7.53±0.92)%、(4.15±0.96)%;cyclin D1、hTERT的mRNA和蛋白水平依次增高;HL-60、HL-60A端粒酶活性较正常MNC增强(p=0.000),HL-60与HL-60A之间无明显差别(p=0.232);cyclin D1、hTERT与端粒酶活性呈正相关(p<0.01)。结论:与正常人MNC相比,HL-60、HL-60A的S期细胞增多,凋亡细胞减少,且以HL-60A更为明显,这可能与cyclin D1、hTERT、端粒酶活性上调有关。     

急性髓系白血病患者骨髓细胞Ang2 mRNA表达水平及其临床意义

血管生成素2(angiopoietin2,Ang2)为内皮细胞特异性生长因子之一,近年来研究发现其表达水平与急性髓系白血病(AML)预后密切相关[1-4].我们通过实时荧光定量PCR方法对57例初诊AML患者骨髓单个核细胞(MNC)中的Ang2 mRNA表达水平进行检测,并分析其与临床的关系.     

基质细胞衍生因子-1受体CXCR7在急性白血病细胞的表达及意义

目的研究基质细胞衍生因子-1(SDF-1)受体CXCR7在急性白血病(AL)细胞株和AL患者骨髓细胞中的表达及意义。方法使用RPMI-1640培养基培养人单核细胞白血病细胞株(THP-1细胞)、人原髓细胞白血病细胞株(HL-60细胞)和人T淋巴细胞白血病细胞株(Jurkat细胞),分离急性髓系白血病(AML)患者和急性淋巴细胞白血病(ALL)患者和正常人骨髓单个核细胞,抽取新鲜骨髓2 ml/(人)份,分为ALL组、AML组和正常组,用流式细胞仪和Western blot法观察各组CXCR7蛋白的表达情况。结果 1)CXCR7表达水平:THP-1细胞为(69.05±3.04)%,HL-60细胞为(20.17±1.53)%,Jurkat细胞为(3.41±2.46)%,THP-1细胞表达高于HL-60细胞(P0.01),而HL-60细胞表达又明显高于Jurkat细胞(P0.01)。2)CXCR7表达水平:AML组为(19.03±3.84)%,ALL组为(3.34±1.71)%,正常组为(2.40±1.27)%,AML组与正常组、ALL组相比,CXCR7表达水平明显增加(P0.01),ALL组与正常组对比,差异无统计学意义(P0.05)。结论 AML患者和HL-60细胞的CXCR7表达均明显增高,提示其在AML的发生、发展中可能具有有重要作用,并可能成为1种新的血液肿瘤诊断及治疗的思路和靶点。     

Rheb在人急性髓系白血病中的作用研究

目的:通过检测Rheb在成人急性髓系白血病患者(AML)骨髓细胞中的表达,探讨Rheb在AML发生发展中的作用。方法:选择27例AML患者和29例特发性血小板减少性紫癜(ITP)初诊患者的骨髓单个核细胞(BMMNC),用实时定量PCR(RT-PCR)方法检测Rheb的表达水平;分析Rheb表达水平与AML患者年龄、分型、融合基因、脾脏肿大、肝脏肿大相关性。比较Rheb高表达组与Rheb低表达组患者生存时间的差异。构建过表达Rheb的HL-60细胞,应用不同浓度阿糖胞苷处理HL-60细胞和过表达Rheb的HL-60细胞,用CCK-8法检测细胞增殖情况并计算IC_(50)。结果:Rheb在AML患者骨髓单核细胞中表达与ITP患者骨髓单核细胞的表达相比较没有明显差异。Rheb高表达患者相对预后较好,对阿糖胞苷治疗敏感。Rheb表达量与患者年龄、分型、融合基因和肝肿大不相关,与脾脏肿大相关(P0.05)。体外实验表明,在AML细胞系HL-60中过表达Rheb,可以提高细胞对阿糖胞苷敏感性(IC50=0.54μmol/L)。结论:Rheb低表达可以预示不良预后,且与AML患者脾脏肿大相关,对阿糖胞苷治疗不敏感。     

抗CXCR4单克隆抗体对HL-60细胞粘附性及Bcl-2、Fas蛋白表达的影响

本研究通过观察抗CXCR4单克隆抗体(12G5)对HL-60细胞粘附性及Bcl-2、Fas蛋白表达的影响，探讨趋化因子SDF-1在维持HL-60细胞生存中的作用。培养HL-60细胞，并再与骨髓基质细胞共培养，在抗CXCR4单克隆抗体阻断SDF-1生物活性后，观察骨髓基质层上HL-60细胞的粘附情况并测定其粘附率；应用免疫组织化学技术检测HL-60细胞Bcl-2及Fas蛋白的表达。结果显示，12G5显著降低HL-60细胞的粘附率，与此同时Bcl-2表达下调，Fas表达上调。结论：抑制SDF-1活性可一定程度地阻抑白血病细胞生存，促进凋亡。     

NME3蛋白在急性髓系白血病细胞株HL-60和患者骨髓表达趋势研究

为了验证HL-60细胞向粒、单两系分化前后非转移细胞蛋白3（NME3）的表达差异,并探讨该蛋白对急性髓系白血病的诊断价值,采用全反式维甲酸（ATRA）和甾体类新药NSC67657分别诱导急性髓系白血病HL-60细胞向粒系和单核系分化,通过细胞化学染色判断细胞分化方向,通过细胞表面分化抗原（CD11b／CD14）检测判断细胞分化程度,通过磷脂酰丝氨酸外翻排除细胞凋亡,建立细胞分化模型,应用RT-PCR和Western blot方法验证NME3基因和蛋白在细胞分化前后的差异表达情况。收集26例临床确诊的各种类型髓系白血病患者及5例正常人骨髓样本,比较分析NME3蛋白在不同样本组中的表达趋势。结果表明：ATRA（2μmol／L,5d）和NSC67657（10μmol／L,5d）可分别诱导HL-60细胞向粒系和单核系分化,其分化程度达到90％以上且不伴随凋亡发生,NME3基因与蛋白表达在细胞两系分化后明显下降。对患者骨髓有核细胞分析发现,NME3蛋白在急性髓系白血病患者骨髓样本中表达较慢性髓系白血病患者组及正常对照组明显升高。结论：NME3蛋白在HL-60细胞分化后表达下调．与其在患者样本中的袁达趋蛰相符．提示该蛋白可能作为鱼性醋系白血痛潜在的分平标点物。     

神经毡蛋白-1在急性髓系白血病细胞中的表达和作用

本研究旨在探索神经毡蛋白(neuropilin-1,NRP-1)和NRP-2在髓系白血病细胞中的表达及抑制NRP-1基因表达后对白血病细胞生长和迁移的影响.采用RT-PCR观察NRP-1和NRP-2 mRNA在24例急性髓系白血病(AML)患者骨髓单个核细胞(MNC)及7种髓系白血病细胞系中的表达;以小干扰RNA(siRNA)干扰NRP-1基因在HEL细胞的表达,用MTT和细胞迁移试验观察细胞增殖、迁移的变化.结果显示NRP-1在24例AML患者骨髓MNC中表达,其阳性率为100%,显著高于正常对照组67%(p=0.03).79%AML患者表达NRP-2,67%正常人表达NRP-2,两者无明显差异(p=0.6).NRP-1的表达与AML患者骨髓、外周血原始细胞比例呈正相关(r=0.5,r=0.4,p＜0.05).NRP-1和NRP-2 mRNA分别在6/7和3/7种髓系白血病细胞系表达.用siRNA转染HEL细胞24小时后NRP-1 mRNA和蛋白表达水平明显降低,当有VEGF165作用时,对照组细胞增殖明显增加,而干扰组无变化(MTT值对照组vs干扰组0.6±0.01 vs 0.49±0.02,p＜0.001).转染24小时后干扰组细胞迁移显著降低,其迁移细胞数干扰组vs对照组为500±17 vs 123±7(p＜0.001).结论NRP-1在AML患者骨髓MNC中表达增高,并在髓系白血病细胞的增殖和迁移中起重要作用.     

急性髓系白血病82例患者VEGF与MMP-2、MMP-9的相关性研究

为了探讨急性髓系白血病（AML）患者中血管内皮生长因子（VEGF）与基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的相互关系及二者在AML中的意义，采用半定量RT—PCR技术检测AML患者与正常人骨髓单个核细胞（MNC）MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA、VEOF mRNA的表达，用明胶酶谱的方法测定原代MNC和HL-60细胞分泌的MMP-2、MMP-9的活性。应用ELISA方法检测AML患者血清中VEGF蛋白的水平，分析VEGF和MMP-2、MMP-9 mRNA之间的关系。结果显示：AML患者MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA与VEGF mRNA的表达和VEGF蛋白水平呈正相关，缓解期患者和正常对照无相关性；VEGF阳性组发生髓外浸润率明显高于阴性组；VEOF上调HL-60细胞中bcl-2的表达：结论：AML患者中MMP-2，MMP-9的表达和VEGF具有正相关性，VEGF可以上调部分AML患者中MMP-2，MMP-9的表达，VEOF可能与MMP-2，MMP-9共同参与了白血病髓外浸润的发生。     

二甲基亚砜诱导HL-60细胞分化的比较蛋白质组学研究

不同的诱导分化剂可诱导急性髓系白血病细胞系HL-60细胞向不同谱系的细胞分化[1].二甲基亚砜( DMSO)由于其溶解极性和非极性化合物能力极强而被广泛用作溶剂.目前,DMSO作为细胞低温保鲜剂(浓度一般在10％)可直接给患者注射[2].据最新报道,DMS0可通过活化转录因子促进成骨细胞分化[3].我们采用比较蛋白质组学方法,研究DMSO诱导HL-60细胞分化过程中蛋白质的差异表达,并探讨其可能的分子机制.     

Cyclin D1、P16 mRNA在急性白血病检测中的意义

细胞周期蛋白(Cyclins)、依赖于细胞周期蛋白的激酶(Cyclin-dependent kinases,CDK)以及CDK抑制剂(Cyclin-de-pendent kinases inhibitors,CKI)三者活性调节的平衡是细胞正常生长增殖所必需,而任何导致Cyclins过表达或CKI失表达、失活均可能引起细胞增殖失控产生肿瘤[1],因而Cyc-lin D1及属于CKI家族的P16均被认为是潜在的肿瘤相关基因.为探讨Cyelin D1、P16 mRNA基因在急性白血病(AL)患者骨髓单个核细胞(MNC)中的表达及其临床意义,我们采用实时定量RT-PCR方法检测51例AL患者骨髓MNC中Cyc-lin D1、P16 mRNA的表达水平并分析其临床意义及二者间的相互作用.     

THBS1基因甲基化与急性髓系白血病发病关系的研究

目的探讨急性髓系白血病(AML)患者外周血白血病细胞及AML和骨髓增生异常综合征(MDS)细胞株中凝血酶敏感蛋白1(THBS1)基因甲基化状态及其与AML发病的关系。方法分别用改良型PRIM-1640培养基、IMDM培养基培养HL-60、HL-60/ADM、SKM-1、MV4-11细胞株;收集初诊急性髓系白血病患者30份(AML实验组)及健康成年人外周血20份(正常对照组),提取其各自基因组DNA;用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测2组外周血的THBS1基因甲基化发生率,以及白血病细胞株HL-60、HL-60/ADM、SKM-1、MV4-11中THBS1基因的甲基化水平。结果 AML组和对照组外周血中THBS1基因甲基化发生率为36.7%(11/30)vs 0(0/20)(P0.01);HL-60、HL-60/ADM、SKM-1、MV4-11细胞株均发生THBS1基因甲基化。结论 AML患者外周血白血病细胞及AML、MDS细胞株中均发生THBS1基因甲基化,提示这一现象与AML的发病有一定相关性。     

人髓性白血病细胞VEGF及其受体的检测

目的 建立人髓性白血病细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）及其受体KDR和Flt-1在基因转录和蛋白质水平上的检测方法,为临床判断白血病患者的预后提供技术支持。方法 用RT-PCR测定K562和HL-602种白血病细胞VEGF及其受体mRNA表达,免疫组织化学染色法检测VEGF及其受体蛋白表达;ELISA法检测细胞上清液中VEGF的分泌水平。结果 2种髓系白血病细胞均检测到VEGF的基因转录和蛋白表达。HL-60细胞同时表达Fh-1和KDR2种受体,而K562细胞仅有受体Flt-1的表达,未见受体KDR的mRNA和蛋白表达。细胞培养上清液中检出VEGF的高分泌。结论 VEGF及其受体在髓性白血病细胞表达增高,但不同细胞系VEGF受体表达有差异。VEGF及其受体在白血病的发生、发展中可能起重要作用。     

白细胞介素6受体的β亚单位基因和蛋白人白血病细胞中的表达

胞因子-受体系统介导的靶向杀伤作为新一代导向治疗策略的创立已经引起临床血液学及肿瘤治疗学研究者的极大关注[1].我们先前的动物实验结果业已证明,重组白细胞介素6(IL-6)-PE40外毒素融合蛋白能高度特异性地杀伤高表达人IL-6受体(IL-6R)的BNML大鼠急性早幼粒细胞白血病细胞,明显延长白血病大鼠的生存期,而对正常造血细胞无不良反应[2,3].新近我们的研究结果则显示,粒、单、红白血病细胞不但高表达IL-6Rα亚单位的基因和蛋白,而且还高表达高亲和力IL-6R.鉴于IL-6R的β亚单位在高亲和力IL-6R形成中所发挥的关键性作用[4,5],因此从理论上讲,白血病细胞表面高亲和力IL-6R的多寡与重组IL-6-PE40外毒素融合蛋白靶向杀伤白血病的生物学效应密切相关[6].所以,全面系统地阐明人类白血病细胞是否表达IL-6R的β亚单位基因和蛋白具有十分重要的临床指导意义.我们首次采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量技术并结合流式细胞术(FACS)对IL-6R的β亚单位mRNA和蛋白在8种极具代表性的人类白血病细胞系U937、HL-60、KG1、TF1、K562、HuT 28、CEM及Raji中的表达进行了深入的探索.     

Axl及其配体蛋白Gas6在急性白血病中的表达及其与诱导缓解治疗疗效之间的关系

Axl属于受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTK)家族成员,在基因转录调节中起重要作用,参与对细胞存活、增殖、黏附、迁移及抗凋亡的调节[1-2].Gas6为Axl的生物配体,已经发现Gas6-Axl与多种肿瘤细胞的增殖、存活、血管发生、侵袭有关[3-5].Hong等[6]在关于Gas6-Axl与白血病细胞株的体外研究中,发现Gas6-Axl可激活PI3K/Akt和Raf/MEK/ERK信号通路,从而介导白血病细胞多药耐药的发生.目前有关Gas6-Axl在急性白血病(AL)患者中的表达情况及其与多药耐药的关系报道甚少,为此我们采用实时定量RT-PCR法检测74例AL患者骨髓单个核细胞(MNC)中Axl、Gas6 mRNA的表达水平,并分析二者间的相互作用及其与临床疗效、多药耐药的关系.     

地西他滨联合柔红霉素对HL-60细胞增殖及PTEN基因表达的影响

人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(Phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten gene, PTEN)是近年发现的定位于染色体10q 23.3的一个重要抑癌基因,其编码的蛋白具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性,发挥双重肿瘤抑制功能[1].地西他滨(DAC)是目前研究较多的甲基化抑制剂,可逆转CpG岛甲基化,使多种因甲基化而失活的抑癌基因重新表达,抑制肿瘤细胞生长而达到治疗肿瘤的目的[2].我们以急性髓系白血病(AML)细胞系HL-60为研究对象,用不同浓度柔红霉素(DNR)、DAC及两药联合作用HL-60细胞,观察药物对白血病细胞增殖的抑制作用以及对PTEN mRNA表达的影响,旨在为临床应用提供理论依据.     

CIAPIN1基因在白血病患者骨髓单个核细胞中表达的研究

本研究旨在检测CIAPIN1基因在白血病患者中的表达,探讨其在白血病中的作用。收集112例初治白血病患者的新鲜骨髓,用TRIzoL一步法提取细胞总RNA、合成cDNA、以β-actin为内参,应用实时定量PCR方法检测CIAPIN1mRNA的表达;实验中选择10例正常人的骨髓作为对照。结果表明:骨髓单个核细胞(MNC)中CIAPIN1mRNA在急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性髓系白血病(CML)患者中的表达均高于正常人(p<0.05);在慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者中的表达与正常人相比差异无统计学意义(p>0.05)。结论 :CIAPIN1基因在初治白血病患者MNC中表达升高,其表达上调在白血病的发病中可能有一定的作用。     

初诊急性髓系白血病患者来源的骨髓间充质干细胞通过调节Caspase-3/survivin抑制DNR诱导的HL-60细胞凋亡

目的:探讨急性髓系白血病(AML)患者的骨髓微环境在化疗耐药中的作用,观察骨髓间充质干细胞(MSC)对柔红霉素(DNR)诱导的AML细胞HL-60凋亡的影响,并探索其初步作用机制。方法:分别将健康供者和初诊AML患者来源的骨髓MSC与HL-60细胞共培养,不同的实验组添加或者不添加DNR,采用流式细胞术检测AnnexinⅤ/PI标记的HL-60细胞凋亡;通过瑞氏-吉姆萨染色观察各组HL-60细胞形态,统计原始和分化细胞所占的比例;采用Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Survivin的表达情况。结果:流式细胞术显示,健康供者MSC以及初诊AML患者来源MSC分别与HL-60细胞共培养未见HL-60细胞的凋亡情况有显著变化。加入DNR后,HL-60细胞凋亡率为(49. 57±7. 44)%,健康供者MSC共培养加药组和初诊AML患者来源的MSC共培养加药组凋亡率显著降低,分别为(30. 72±4. 05)%(P 0. 01)和(22. 99±4. 08)%(P 0. 01),但健康供者MSC组与初诊AML患者来源MSC组对DNR诱导HL-60细胞凋亡的抑制作用无统计学差别(P 0. 05)。瑞氏-吉姆萨染色结果显示,初诊AML患者来源MSC共培养的HL-60细胞绝大多数处于原始状态,极少见到细胞分化。初诊AML患者来源MSC共培养组中,DNR引起的细胞凋亡和分化明显减少,HL-60细胞大多数处于原始状态。Western blot检测结果表明,初诊AML患者来源MSC和健康供者MSC共培养组的HL-60细胞内Caspase-3活性剪切均较HL-60细胞单独培养组下降,且初诊AML患者来源MSC组显著降低。此外,初诊AML患者来源MSC和健康供者MSC共培养的HL-60细胞Survivin的表达较单独药物作用组表达更高,且初诊AML患者来源MSC组表达显著增高。结论:初诊的AML患者骨髓中存在的MSC与健康人骨髓MSC可以抑制DNR诱导的HL-60细胞凋亡,其作用机制可能与抑制了HL-60细胞内Caspase-3活性,提高了Survivin的表达有关。     

干扰HMGA2基因表达抑制HL60细胞的增殖及浸润

目的:探索干扰高迁移率族蛋白A2(high mobility group protein A2,HMGA2)基因的表达对HL-60白血病细胞体外增殖、浸润的影响。方法:实验分为3组,实验组为稳定转染慢病毒干扰HMGA2基因表达载体的HL-60细胞;阴性对照组为稳定转染慢病毒空载体HL-60细胞;空白对照组为未转染的HL60细胞。3组分别接种BALB/c裸鼠建立种植瘤模型,检测接种后各个时间点裸鼠外周血和骨髓中白血病细胞的比例(肿瘤负荷)、生活质量,计算接种40 d后各组小鼠的肝脾指数。结果:RTPCR及Western印迹证明干扰RNA慢病毒表达载体可明显降低HL-60细胞靶基因的表达。接种后骨髓涂片结果显示裸鼠白血病模型成功建立。接种后21,28,40 d,实验组HL-60细胞在小鼠外周血和骨髓中的比例均明显低于阴性对照组及空白对照组,差异有统计学意义(P0.05),其白血病细胞比例随接种时间延长而增加的速度亦明显变缓;且实验组小鼠萎糜少动、腹部膨隆、皮下结节等并发症出现时间明显较空白对照组及阴性对照组延迟;接种40 d后实验组小鼠肝脾指数分别为66.76±5.56和20.57±0.75,均明显低于其余两组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:干扰HMGA2基因表达,可明显抑制HL60白血病细胞在小鼠体内增殖、浸润。