胆脂瘤上皮细胞增殖及分子调控机制的免疫组化研究

近年来研究表明胆脂瘤细胞的过度增殖行为与信号传导相关的蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases，PTKs)异常激活有关，信号传导中涉及细胞周期，G1期的重要调控者周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependen kinase4，CDK4)和其特异性抑制因子周期蛋白依赖性激酶抑制物p15调控结果对细胞周期产生重要影响，有决定细胞增殖还是凋亡的作用，因此，我们用超敏免疫组化技术(ultrasensitive immunohistochemistry，SP)检测胆脂瘤上皮细胞磷酸化PTKs、CDK4、p15的表达水平，报道如下。     

PTKs CDK4及p15在中耳胆脂瘤上皮的表达

目的 :从蛋白酪氨酸激酶 (PTKs)信号传递系统及细胞周期调控探讨胆脂瘤上皮细胞增殖的分子机制。方法 :采用免疫组织化学S P方法和计算机图像分析系统 ,观测 30例中耳胆脂瘤上皮及 19例胆脂瘤患者外耳道皮肤中磷酸化PTKs、周期蛋白依赖性激酶 4 (CDK4 )、p15的表达 ,并结合上皮下炎症浸润、骨质破坏程度作统计学分析。结果 :磷酸化PTKs以胞膜表达为主 ,CDK4胞核、胞质均有表达 ,以胞核为主 ,而p15仅以胞核表达。与外耳道皮肤相比 ,胆脂瘤上皮细胞磷酸化PTKs、CDK4、p15表达都显著增强 (P <0 .0 1) ,在重度皮下炎性浸润的上皮细胞磷酸化PTKs、CDK4表达增强 (P <0 .0 1) ;处于高水平磷酸化PTKs表达的胆脂瘤上皮细胞CDK4表达增强 (P <0 .0 1) ;两种骨质破坏程度中上述指标表达的差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。结论 :胆脂瘤上皮细胞具有过度增殖能力 ,同时也存在抑制细胞增殖的机制 ;局部的炎性浸润有增强胆脂瘤上皮细胞增殖能力的倾向     

细胞周期调控因子在中耳胆脂瘤上皮中的表达

目的根据细胞周期调控基因表达情况探讨中耳胆脂瘤上皮细胞增殖的分子机制。方法采用免疫组织化学方法检测胆脂瘤上皮细胞和胆脂瘤患者外耳道上皮细胞中周期蛋白依赖性激酶4(cyclindependentkinase4,CDK4)及其抑制因子p15、p16的表达,并结合炎症及骨质破坏程度作统计学分析。结果CDK4、p16在胞核、胞浆以棕黄色或棕褐色颗粒表达,并以胞核为主,而p15仅以胞核棕黄色或棕褐色颗粒表达。与皮肤相比,CDK4、p15、p16在胆脂瘤上皮细胞的表达显著增强,上皮下重度炎症可增强CDK4的表达;不同的骨质破坏程度上述指标的表达无显著性差异。结论胆脂瘤上皮细胞增殖活性增强,同时抑制细胞增殖的机制也增强;局部炎症可增强胆脂瘤上皮细胞的增殖活性。     

CDK4、P16在中耳胆脂瘤中的表达及意义

目的：观察细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P16在中耳胆脂瘤上皮的表达情况,探讨它们在胆脂瘤发病机制中的作用。方法：采用免疫组织化学技术SABC法检测CDK4、P16在中耳胆脂瘤35例、正常外耳道皮肤20例中的表达,并结合胆脂瘤对听小骨骨质破坏程度,采用SPSS11.5软件进行统计学分析。结果：CDK4、P16均表达于胆脂瘤上皮的棘细胞层、颗粒层和角质层,阳性率分别为68.6%、88.6%,高于对照组(前者P=0.011,后者P=0.02)。二者在胆脂瘤上皮的表达有一定的相关性,P＜0.05;与中耳胆脂瘤听小骨骨质破坏程度之间无明显相关性,P＞0.05。结论：CDK4与P16在中耳胆脂瘤发生中是共同而非单独起作用的,从细胞周期的角度可反映胆脂瘤上皮细胞过度增殖的同时也增强负调控因子来抑制增殖,使凋亡同时加快而达到新的平衡。但与骨质破坏程度可能无直接关系。     

ki-67、细胞周期蛋白依赖性激酶4在胆脂瘤型中耳乳突炎中的表达及意义

目的探讨ki-67、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)在中耳继发胆脂瘤上皮中的表达,研究它们在胆脂瘤型中耳乳突炎中的作用.方法利用免疫组化的方法,检察32例胆脂瘤上皮和11例正常外耳道皮肤中的ki-67、CDK4蛋白的表达情况.结果ki-67在胆脂瘤上皮和外耳道皮肤中均为阳性表达,阳性细胞率分别为33.2%±13.2%、14.5%±4.9%,两组之间的差异具有显著性(P＜0.05);CDK4在胆脂瘤上皮和外耳道皮肤中阳性细胞率分别为35.6%±14.6%、13.6%±5.1%,两组之间的差异具有显著性(P=0.001).结论ki-67和CDK4在胆脂瘤上皮表达增高.     

Stat3信号传导通路对喉癌细胞G1～S期的调控

目的:探讨Stat3信号传导通路对喉癌细胞G1～S期调控的可能机制.方法:应用阳离子脂质体介导Stat3反义寡核苷酸转染人喉癌Hep-2细胞,阻断其Stat3通路;MTT法检测细胞增殖状态;流式细胞术检测细胞周期;Western blot检测Stat3、磷酸化Stat3、G1期Cyclins、CDKs、p21、p27的表达.结果:转染Stat3反义寡核苷酸后喉癌细胞增殖受抑制,Stat3、磷酸化Stat3、G1期Cyclins、CDKs表达水平下降,p21与p27表达水平上升.结论:Stat3信号传导通路可能通过调节CDK/Cyclin复合物与细胞周期索依赖性激酶抑制因子(CKI)成员之间的平衡而调节喉癌细胞G1～S期转换.     

Stat3信号传导通路对喉癌细胞G3～S期的调控

目的：探讨Stat3信号传导通路对喉癌细胞G1～S期调控的可能机制。方法：应用阳离子脂质体介导Star3反义寡核苷酸转染人喉癌Hep-2细胞，阻断其Star3通路；MTT法检测细胞增殖状态；流式细胞术检测细胞周期；Western blot检测Stat3、磷酸化Star3、G1期Cyclins、CDKs、p21、p27的表达。结果：转染Star3反义寡核苷酸后喉癌细胞增殖受抑制，Stat3、磷酸化Star3、G1期Cyclins、CDKs表达水平下降，p21与p27表达水平上升。结论：Star3信号传导通路可能通过调节CDK／Cyclin复合物与细胞周期素依赖性激酶抑制因子（CKI）成员之间的平衡而调节喉癌细胞G1～S期转换。     

细胞周期蛋白质依赖激酶抑制蛋白在内耳的生物学作用

CDK抑制蛋白是能特异抑制细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)活性的一类家族蛋白,它们可以粘附于CDK-细胞周期蛋白复合物并使之失活,导致细胞周期停止,从而调控细胞的增殖过程.本文对CDK抑制蛋白在内耳的生物学作用做一综述.     

细胞周期蛋白质依赖激酶抑制蛋白在内耳的生物学作用

CDK抑制蛋白是能特异抑制细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)活性的一类家族蛋白，它们可以粘附于CDK-细胞周期蛋白复合物并使之失活，导致细胞周期停止，从而调控细胞的增殖过程。本对CDK抑制蛋白在内耳的生物学作用做一综述。     

p27Kipl在喉鳞状细胞癌癌变过程中表达的临床意义

依赖性激酶抑制蛋白 (ｃｙｃｌｉｎ ｄｅｐｅｎ ｄｅｎｔｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ,ＣＤＫＩ)是近年分离得到一类重要的细胞周期调控蛋白 ,参与细胞周期的负调控 ,可防止细胞过度增殖和恶变[1] 。ｐ2 7Ｋｉｐｌ(简写ｐ2 7)基因是新近发现的ＣＤＫＩ家族成员之一 ,其基因定位于 12ｐ12 13.1,编码的ｐ2 7蛋白可抑制细胞从Ｇ1期进入Ｓ期而参与细胞的负调控。本文采用免疫组化法通过对ｐ2 7蛋白在喉鳞状细胞癌 (ｌａｒｙｎｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ,ＬＳＣＣ)、喉不典型增生病变和喉正常粘膜的表达 ,探讨ｐ…     

转化生长因子β1和即刻早期基因及p27在中耳胆脂瘤上皮中的表达

目的　研究转化生长因子 β1(transforminggrowthfactor β1,TGF β1)、即刻早期基因 (c fos)、周期素依赖性激酶抑制蛋白 p2 7在中耳胆脂瘤上皮中的表达及相互之间的关系 ,探讨其表达对胆脂瘤侵袭能力的影响。方法　应用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白 过氧化酶染色法检测TGF β1、c fos和 p2 7在 31例胆脂瘤上皮、11例胆脂瘤患者外耳道上皮和 10例正常外耳道上皮中的表达 ,应用计算机图像分析系统对其阳性表达进行定量分析。结果　TGF β1和c fos在胆脂瘤上皮中表达阳性率分别为 87 1%和 83 9% ,与胆脂瘤患者外耳道上皮和正常外耳道上皮相比表达差异有显著性。而p2 7在胆脂瘤上皮和外耳道上皮组上皮中均未见阳性表达。胆脂瘤上皮中c fos与TGF β1表达无相关性 (r =0 339,P =0 331) ;胆脂瘤侵袭能力与c fos表达有高度显著相关关系 (r =- 0 96 5 ,P <0 0 1) ,与TGF β1表达也有高度相关关系 (r =- 0 4 0 6 ,P <0 0 1)。 结论　即刻早期基因c fos在胆脂瘤中表达显著增强 ,且与胆脂瘤的侵袭能力有高度显著相关性 ,提示高c fos表达是胆脂瘤高增殖特征的因素之一。TGF β1在胆脂瘤上皮中高表达亦表明其在胆脂瘤的高增殖能力方面起一定作用     

中华耳科学杂志2004年第2卷作者索引

B毕胜斌自制NECM修复兔耳廓软骨缺损的试验研 (1):48C陈雄血管内皮生长因子在中耳胆脂瘤中的表达及其临床意 (2):129陈乾美ki-67、细胞周期蛋白依赖性激酶4在胆脂瘤型中耳乳突炎中的表达及意 (2):126陈洪文测听室的隔声与屏 (3):227陈雷离体豚鼠前庭神经节细胞的分离及胞内钙离子活动的观 (3):215陈文文自体臼枪柱状听骨的听力疗效观 …     

熊果酸对喉鳞状细胞癌细胞周期阻滞的作用分析

目的　探讨熊果酸对喉鳞状细胞癌细胞周期阻滞的作用。方法　选取Hep-2喉鳞状细胞癌细胞接种于96孔板培养，依据随机数字表分为A组、B组、C组、D组，每组24孔，A组、B组、C组、D组分别给予0.0、12.5、25.0、50.0 μmol/L熊果酸培养，采用Western blot（WB）法检测细胞周期相关调控蛋白周期蛋白（cyclin B1、cyclin D1）和周期蛋白依赖性激酶（CDK1、CDK2）表达情况，采用流式细胞术检测细胞周期，采用细胞增殖实验（MTT法）检测细胞增殖能力。结果　在cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2的WB值及S期细胞占比中，D组明显低于C组，C组明显低于B组，B组明显低于A组，差异有统计学意义（P <0.05）；在G0/G1期细胞占比中，D组明显高于C组，C组明显高于B组，B组明显高于A组，差异有统计学意义（P <0.05）。在培养1、2、3天的细胞增殖抑制率中，D组明显高于C组，C组明显高于B组，差异有统计学意义（P <0.05）。结论　熊果酸可阻滞喉鳞状细胞癌细胞在G0/G1期细胞周期而抑制其细胞增殖，其机制作用可能够与下调cyclin B1、cyclin D1、CDK1、DK2表达有关。     

鼻咽癌干细胞增殖特征及细胞周期相关蛋白表达水平研究

目的　研究鼻咽癌干细胞的增殖特征并初步探讨其分子机制。方法　采用无血清悬浮培养法从鼻咽癌细胞CNE2和5-8F获得鼻咽癌干细胞CNE2-SC、5-8F-SC，分别采用细胞存活率分析计数器、细胞平板克隆形成试验观察鼻咽癌干细胞的增殖特性和克隆形成能力，Western blot法检测细胞周期相关蛋白表达水平。结果　鼻咽癌干细胞比其来源的鼻咽癌细胞增殖速度显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。鼻咽癌干细胞克隆形成率显著高于其来源鼻咽癌细胞（P＜0.01），但肿瘤干细胞克隆显著小于其来源细胞。与普通鼻咽癌细胞比较，鼻咽癌干细胞的细胞周期蛋白CylinD1、CylinD3及细胞周期调控蛋白CDK2、CDK4、CDK6的表达水平显著下调（P＜0.01）。结论　鼻咽癌干细胞比其来源的鼻咽癌细胞生长增殖缓慢，可能与其细胞周期蛋白和周期蛋白依赖激酶表达水平下调有关。     

喉鳞癌组织中CDK_4、cyclin D_1、P~(16)蛋白表达

目的：细胞周期中G1／S转换受到G1期的细胞周期蛋白及细胞周期蛋白的依赖激酶（CDKs）和它们的抑制剂的调节,cyclinD1／CDK4复合物磷酸化（pRB）基因产物、P16与cyclinD1竞争性地抑制CDK4,这些蛋白质的不正常表达就使细胞增殖失控,进而导致肿瘤的形成和发展。本研究从细胞周期调控的角度来探讨喉鳞状细胞癌的发生、发展与CDK4、cyclinD1及P16的关系。方法：用SP免疫组织化学的方法,检测了105例喉癌（其中声门上癌51例,声门癌54例）及28例声带息肉中CDK4、cyclinD1、P16蛋白表达的水平。结果显示：在喉癌组织中cyclinD1的表达以＋＋～＋＋＋为主,而在声带息肉组织中以阴性及弱阳性为主。它们之间存在着显著性的差异（P＜0．05）;而同样P16的表达在喉癌及对照组之间的差异非常显著（P＜0．001）。P16、CDK4的表达在声门上癌与声门癌之间差异显著,P值分别为P=0．002,P=0．021。经Spearman相关分析得出：喉癌组织中CDK4的表达与P16的表达和cyclinD1的表达具有相关性,相关系数分别为0．235、0．253。伴转移的喉癌组织中CDK4的表达与cyclinD1的表达相关明显,相关系数r=0．534。而在非转移的喉癌组织中CDK4与P16相关,相关系数r=0．253。由此我们推论：在喉癌的发生、发展中CDK4、cyclinD1及P16是共     

细胞周期抑制因子p27与头颈部肿瘤

细胞周期调控机制紊乱是肿瘤细胞最常见的改变 ,这一改变使细胞无限制的增殖 ,导致肿瘤的发生、发展和临床不良预后。细胞周期蛋白依赖性激酶 (ＣＤＫ)的时相性激活是细胞周期调控机制的核心 ,相应的ＣＤＫ与细胞周期蛋白 (Ｃｙｃｌｉｎ)结合后 ,其激活与否受到几种复杂机制的严格调控〔1〕。ＣＤＫ抑制物 (ＣＤＫＩｓ)机制是其主要的负性调节机制 ,它的破坏将促使细胞癌变 ,因此在肿瘤研究中具有重要意义〔1〕。根据其结构和功能的不同 ,可以将ＣＤＫＩｓ分为ＩＮＫ4家族与Ｃｉｐ/Ｋｉｐ家族两类。ＩＮＫ4家族包括ｐ1 5、ｐ1 6、ｐ1 8和 ｐ…     

喉癌组织中P16的表达及意义

细胞周期失控是癌变的重要原因.细胞周期素D1(cyclin D1),能激活CDK4,使细胞由G1期进入S期,进行DNA合成,开始增殖[1].新近发现的新型抑癌基因P16可限制此过程[2,3],P16基因位于人类染色体短臂9p21上,在许多肿瘤细胞系有缺失,缺失率达75%.p16蛋白与cyclin D1竞争地结合CDK4,抑制它的活性,使之解除对Rb的磷酸化,从而不能释放转录因子E2F,阻止细胞由G1期进入S期,抑制细胞无限增殖[3,5].本实验采用免疫组化S-P法,对P16在喉癌组织中的表达进行定量分析,探讨P16在喉癌发生中的作用及P16与喉癌的生物学行为的关系,以判断喉癌患者的预后.     

细胞周期蛋白依赖性激酶2抑制对人鼻咽癌细胞株CNE-2衰老的影响及机制研究

目的　研究抑制细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin dependent kinase，CDK2）对人鼻咽癌细胞株CNE-2衰老的影响并探讨其分子机制。方法　实验分为Control组、Control siRNA组、CDK2-siRNA组、CVT-313组，分别用PI单染流式细胞仪检测各组细胞增殖情况，衰老相关β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老情况，流式细胞仪检测细胞活性氧（ROS）含量，Annexin-PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况；进一步通过Western blot法检测衰老相关蛋白表达情况。结果　人鼻咽癌细胞株CNE-2中，CDK2-siRNA组和CVT-313组细胞增殖指数明显降低，衰老细胞增多，活性氧含量增加，与对照组相比较差异具有统计学意义（P <0.05），而细胞凋亡率无显著性变化（P >0.05）。CDK2-siRNA组和CVT-313组p53、p21、p16蛋白表达明显增加，而pRb蛋白表达明显减少。结论　抑制CDK2可诱导人鼻咽癌细胞株CNE-2的衰老，其机制可能是通过促进衰老相关蛋白的表达来实现的。     

EB病毒核抗原1对鼻咽癌细胞增殖及细胞周期的影响

目的 研究EB病毒核抗原1(Epstein-Barr virus nuclear antigen 1,EBNA1)对人鼻咽癌细胞增殖及细胞周期的影响.方法 构建特异性的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)EBNA1慢病毒干扰载体,包装慢病毒后感染过表达EBNA1的鼻咽癌细胞C666-EBNA1(简写为CE).应用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)和细胞计数法检测细胞增殖状态,流式细胞术、荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法检测细胞周期及相关调控因子变化.结果 成功构建含shRNA EBNA1的重组慢病毒,其感染可显著下调CE细胞中EBNA1表达.细胞计数和MTT均证明CE-shRNA细胞的增殖能力较CE-对照组显著下降(P值均＜0.05).细胞周期提示干扰EBNA1后CE细胞G0-G1期比例由(62.43±6.62)%升高到(89.66±0.64)%,两者比较差异有统计学意义(t=-7.091,P=0.002),S期比例由(34.93±7.36)%下降为(7.82±2.44)%,两者比较差异有统计学意义(t=6.095,P=0.004),G2-M期无明显变化(t=0.090,P=0.933).抑制EBNA1后,c-myc、CDK4、CDK6、pRb的mRNA水平分别下调65.60%、34.06%、41.05%、55.29%.蛋白免疫印迹法证实抑制EBNA1后4种蛋白的表达亦下调.结论 沉默EBNA1基因可抑制鼻咽癌细胞增殖,其机制之一可能是通过影响c-myc、CDK4、CDK6、pRb等基因的表达使鼻咽癌细胞阻滞于G0-G1期.     

喉鳞状细胞癌中CDK2对细胞增殖的作用

目的:研究喉鳞状细胞癌组织中CDK2激酶在引起DNA异倍体发生过程中的作用。方法:取手术中获得的50例喉鳞状细胞癌组织,12例非典型增生组织和30例声带息肉组织,用γ-微管蛋白抗体标记中心体,用免疫组织化学的方法检测CDK2激酶、γ-微管蛋白的表达。结果:在喉鳞状细胞癌组织中CDK2激酶,γ-微管蛋白阳性率表达分别为68%(34/50),78%(10/15),二者的表达都显著高于声带息肉组织(P<0.05);在喉鳞状细胞癌组织中,CDK2激酶的表达与γ-微管蛋白的表达具有相关性。结论:喉鳞状细胞癌中CDK2过度表达导致肿瘤细胞增殖异常。在诊断和治疗喉鳞状细胞癌中,CDK2可能是一个有重要作用的指标。