生物芯片技术与病理学发展

生物芯片技术是 80年代发展起来的一门新兴技术。它可以将成千上万乃至几十万个与生命相关的信息集成在一块厘米见方的芯片上 ,对基因、抗原活体细胞和组织等进行测试分析。近年来 ,以ＤＮＡ芯片为代表的生物芯片 (ｂｉｏｃｈｉｐ)技术得到了迅猛发展 ,目前已有多种芯片出现 ,以ＤＮＡ微阵列芯片、毛细管电泳、蛋白芯片和组织芯片为其代表[1] 。ＤＮＡ芯片技术能够用来分析基因组范畴的基因突变及表达变化 ,是在分子水平研究病理学的新途径。ＤＮＡ芯片一般包括ｃＤＮＡ芯片和寡聚核苷酸芯片 2种。ｃＤＮＡ芯片是由ｃＤＮＡ片段按矩阵方式固…     

单细胞cDNA的制备及扩增

目的建立微量细胞的基因表达分析系统,解决细胞全基因组表达模式分析和同质细胞材料获取困难之间的矛盾。方法挑取单细胞直接进行逆转录,随后以１个含有ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）的通用引物进行序列非依赖性的ｃＤＮＡ扩增并检测其代表性。结果从单个ＨＬ－６０细胞中成功地扩增了全ｃＤＮＡ。结论利用单个或少数细胞制备全ｃＤＮＡ探针,为在高分化的异质性系统中进行差异基因表达分析、建立细胞／组织特异性全基因表达图谱提供了一条合理的途径。     

DNA芯片技术及其在病理学研究中的应用前景

长期以来 ,传统的建立在电泳基础上的基因表达、序列测定、突变和多态性检测等研究方法 ,耗时费力 ,一次只能有限的观测一个基因。近年来ＤＮＡ芯片 (ＤＮＡｃｈｉｐｓ)技术的应运而生〔1～ 3〕,是基因分析技术的一项重大革命 ,使我们能够一次性地对上千种基因进行快速准确的检测 ,在基因组整体水平上研究疾病的发生发展规律。本文仅对ＤＮＡ芯片技术的原理、应用范围及其对医学科学发展的影响做一简要介绍 ,探讨其在病理学研究中的潜在作用。1　ＤＮＡ芯片技术的基本原理ＤＮＡ芯片 ,又称微阵列 (ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ) ,属于生物芯片的…     

氧化低密度脂蛋白新基因OLRG-1的克隆及组织分布

用改进的差异显示反转录－ＰＣＲ技术，从血管内皮细胞中获得了一个氧化低密度脂蛋白诱导差异表达的ｃＤＮＡ片段。以此片段为探针，从人主动脉ｃＤＮＡ文库中筛选了一个新的全长ｃＤＮＡ。其核苷酸总长４１３７ｂｐ，编码６４２个氨基酸的蛋白质。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析证实氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞后，该基因表达减低了３倍，基因定名为ＯＬＲＧ－１。ＯＬＲＧ－１为一多组织表达的基因，与人ＮＳ１－ＢＰ基因高度同源，氧     

未来的生物芯片——蛋白芯片

基因组学的革命已经为我们带来了ＤＮＡ芯片———它是由大量的短ＤＮＡ分子固定在介质表面组成的微阵列。从生物标本中提取ｍＲＮＡ ,通过检测ＤＮＡ分子与ｍＲＮＡ结合形成斑点的荧光强度 ,遗传学家可迅速地同时获得成千上万个基因活性的信息。ＤＮＡ微阵列正用于基因表达的研究。但有些科学家已经梦想着未来的生物芯片 ,他们梦想的芯片将携带数万个蛋白质捕获分子 ,每一捕获分子可识别一种特殊的蛋白质并与之结合。应用适当的检测系统 ,这种蛋白芯片将比与其对应的ＤＮＡ芯片更有价值 ,毕竟 ,蛋白质是基因表达的终末产物 ,通常也是药物作…     

枝状DNA信号放大与纸层析杂交检测方法的建立

血清中病原体的核酸 (ＤＮＡ或ＲＮＡ)水平可确切地反映病原体的复制能力。现有诊断方法中多以各种模式的聚合酶链式反应 (ＰＣＲ)为主 ,该方法灵敏度较高 ,但需要依赖一些设备 ,且易出现假阳性。测定分子水平的技术多因要求高 ,一般临床较少开展。近年发展了极为敏感的枝状ＤＮＡ (ｂｒａｎｃｈｅｄＤＮＡ ,ｂＤＮＡ)分析技术 ,通过一系列的杂交反应后 ,由显示探针上的酶催化发光底物发光 ,由光电比色计可定量记录信号 ,从而达到对病原体核酸的定量分析目的。纸层析杂交试验利用了毛细作用力使ＤＮＡ分子在膜上移动 ,通过杂交作用被固定在…     

基因表达数据分析

基因芯片或称微阵列 (gene chip或 microarrays)是最近分子生物学实验技术的一个突破 ,利用该技术可以对成千上万个基因的表达进行平行分析 ,已经产生了总量巨大的有用数据 ,分析与整理这些数据成为利用这一技术的一个主要瓶颈问题。原始的微阵列数据是图像 ,必须把它们转化成为基因表达矩阵表 ,矩阵的行代表基因 ,列代表各样本及条件(如 :组织、实验条件、处理因素等 ) ,每个格子的数据表示特定的基因在特定的样本中的表达水平。这些矩阵必须经过进一步的分析才能得到它们潜在生物学过程的信息。本文着重讨论了生物信息学方法在该领域的应用 ,主要探讨了监督与非监督数据分析方法在基因表达数据分析中的应用 ,如预测基因功能分类及恶性肿瘤分级。本文还讨论了如何利用基因表达矩阵预测序列中假想调控信号。     

提高组织芯片切片成功率的方法和体会

Ｋｏｎｏｎｅｎ等[1] 于 1998年创立了真正意义的组织芯片或称组织微阵列 (ｔｉｓｓｕｅｍｉｃｒｏａｒｒｙ ,ＴＭＡ)技术 ,将直径 0 .6ｍｍ的乳腺癌小组织样本 ,以阵列方式包埋于同一块 2 0ｍｍ× 45ｍｍ的石蜡块中 ,然后进行切片 ,用于同一实验指标的研究。而由此产生的蜡块切片可同时用于ＤＮＡ、ＲＮＡ或蛋白水平的原位组织学研究 ,使基因、蛋白水平的研究与组织形态学特征相结合。目前已应用到肿瘤的进展、预后、早期诊断以及与ｃＤＮＡ基因芯片相结合 ,进行高表达基因的定位研究 ,研究报道的有乳腺癌[1 3] 、前列腺癌[4 6 ] 、脑肿瘤…     

差异显示逆转录PCR技术及其应用和进展

差异显示逆转录ＰＣＲ（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）技术是一种筛选和克隆差异表达基因的新方法。该方法利用ｃＤＮＡ逆转录技术、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）的高效扩增和凝胶电泳分离技术，能同时显示多种来自相关细胞的ｍＲＮＡ样品。可用于多种研究目的，如鉴别和观察基因表达的改变；差异表达基因的迅速测序并与基因库比较；单个的差异表达基因片段能迅速克隆并制成探针从ｃＤＮＡ文库或基因组文库中分离基因等。ＤＤＲＴ－ＰＣＲ技术具有迅速、简便、灵敏和高效等优点，已被广泛地应用于癌症、心脏疾病、细胞分化、衰老及其它领域的研究中，并且在应用中被不断地改进和发展而更趋合理和完善。     

反义治疗与白血病靶基因研究进展

反义技术是根据碱基互补原理 ,利用与目标靶ＤＮＡ或ＲＮＡ互补的短链片断封闭基因表达。反义技术用于抗白血病的理论基础 ,是用反义核酸中止原癌基因或癌基因的表达 ,使白血病细胞分化或凋亡 ,达到治疗的目的。其特点是 ,特异性强 ,对正常细胞无明显影响。反义核酸能在核酸水平上抗白血病 ,优于在蛋白水平的作用。基本内容包括 :反义ＲＮＡ、反义ＤＮＡ、核酶 (ｒｉｂｏｚｙｍｅ)和三股螺旋ＤＮＡ(ＤＮＡ -Ｔｒｉｐｌｅｘ)。主要通过下列作用之一或联合作用抑制靶基因表达 :1 与双链ＤＮＡ形成三链结构 ,使ＤＮＡ转录受阻。 2 结合靶ｍＲ…     

基因表达数据分析

基因芯片或称微阵列（gene chip或microarrays)是最近分子生物学实验技术的一个突破,利用该技术可以对成千上万个基因的表达进行平行分析,已经产生了总量巨大的有用数据。分析与整理这些数据成为利用这一技术的一个主要瓶颈问题。原始的微阵列数据是图像,必须把它们转化成为基因表达矩阵表,矩阵的行代表基因,列代表各样本及条件（如：组织、实验条件、处理因素等）,每个格子的数据表示特定的基因在特定的样本中的表达水平。这些矩阵必须经过进一步的分析才能得到它们潜在生物学过程的信息,本着重讨论了生物信息学方法在该领域的应用,主要探讨了监督与非监督数据分析方法在基因表达数据分析中的应用,如预测基因功能分类及恶性肿瘤分级,本还讨论了如何利用基因表达矩阵预测序列中假想调控信号。     

组织芯片

组织芯片 (ｔｉｓｓｕｅｃｈｉｐ)是将数十至上千个小组织整齐地排放在一张载玻片上而制成的组织切片。它分为多组织片[1] (ｍｕｌｔｉ ｔｉｓｓｕｅｓｅｃｔｉｏｎ) ,组织阵列 (ｔｉｓｓｕｅａｒｒａｙ,ＭＴＡ ,最多可含 6 0个直径 2ｍｍ的组织 )和组织微阵列[2 ] (ｍｉｃｒｏｔｉｓｓｕｅａｒｒａｙ,最多可含 10 0 0个直径 0 6ｍｍ的组织 ) (图 1,2 )。组织芯片的特点是 :体积小 ,信息含量大 ,一次性实验即可获大量结果(ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ)。组织芯片可用于组织中的ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白质的定位分析和检测。像普通组织切片…     

用cDNA微阵列研究内毒素休克小鼠肺组织基因表达谱的改变

目的利用cDNA微阵列研究小鼠在内毒素休克早期及晚期肺组织基因表达谱(Gene expression profile)的改变,从基因组水平阐明内毒素休克的发生机制,并试图发现某些未知的内毒素休克相关基因.方法BALB/c小鼠经腹腔注射大肠杆菌内毒素0111B4(15mg/kg)2h及20h后摘取心、肝、肺、肾、脑等组织,Trizol提取总RNA,经反转录及a-32P-dATP掺入合成cDNA探针,与Clontech公司产含1176个基因的cDNA微阵列膜进行杂交并放射自显影,X光胶片经透射扫描仪扫描后用本科室开发的密度分析软件分析微阵列中各点阵杂交密度.结果1.注射内毒素后小鼠死亡率为59%,其中44%在24h内死亡.2.内毒素处理2h小鼠肺组织有128个基因表达明显上调(上调＞10倍者33个,5-10倍者24个,2-5倍者71个),并有4个基因表达明显下调.3.内毒素处理20h小鼠肺组织有51个基因表达明显上调(上调＞10倍者16个,5-10倍者7个,2-5倍者28个),并有21个基因表达明显下调.4.内毒素处理20h与处理2h小鼠肺组织相比有13个基因表达明显上调(上调5-l0倍者1个,上调2-5倍者12个),有105个基因表达明显下调.5.在内毒素处理2h表达明显上调的128个基因中,内毒素处理20h后有93个明显恢复或下调;有36个仍然上调.6.内毒素处理2h表达明显下调的4个基因中,内毒素处理20h后有2个明显恢复或上调;有2个仍然下调.7.为证实cDNA微阵列分析结果的可靠性,从休克20h表达增加的基因中选出4个进行RT-PCR检测,发现检测结果与cDNA微阵列分析结果相符.讨论内毒素休克的发病机制十分复杂,涉及多种组织、细胞的激活及大量炎症介质的表达.以往的研究常限于测定单个或几个炎症介质的表达或分析单一的细胞内信号转导途径的作用,忽略了多种炎症介质及信号传导途径的同时存在及相互作用,难以全面揭示内毒素休克的分子机制.本研究采用cDNA微阵列技术,首次发现内毒素休克2h有128个基因表达上调,表明内毒素休克早期是基因表达的活跃期,这些基因改变可能启动和维持了后续的病理生理变化.在休克20h有51个基因表达上调及21个基因下调,这些基因表达的变化可能是内毒素休克转入不可逆期的分子基础.目前本室正对上述基因表达变化的意义及内毒素休克小鼠其它组织中基因表达的改变做进一步的分析.本研究有助于从基因组水平阐明内毒素休克的分子机制,可能为进一步探讨内毒素休克的干预措施提供实验依据.     

温度梯度凝胶电泳及其在遗传学突变筛选中的应用

温度梯度凝胶电泳(ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ,ＴＧＧＥ)是近几年兴起的一种快速突变分析方法。该方法通过建立一定的温度梯度,可以筛选出发生单个或多个碱基突变的双链ＤＮＡ分子,为更加快速、准确地查找突变基因提供了一种先进技术。我们利用ＴＧＧＥ对家族性高胆固醇血症(ｆｍｉｌｉａｌｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｌｅｍｉａ,ＦＨ)患者的低密度脂蛋白受体(ｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ,ＬＤＬＲ)基因进行遗传学分析,获得了较满意的结果,现将此技术…     

采用IL－6cDNA控针检测人IL－6基因表达

采用缺口平移技术对ＩＬ—６ｃＤＮＡ进行了生物素和同位素标记，证明两种标记的ＩＬ－６ｃＤＮＡ（３０ｎｇ／ｍｌ）均可检出低至５ｐｇ的同源ＤＮＡ，而模拟探针（５００μｇ／ｍｌ）对高达１００ｎｇ的同源序列无此反应。应用ＩＬ－６ｃＤＮＡ对富含ＩＬ－６ｍＲＮＡ的标本进行斑点杂交或Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交，证明人参三醇皂甙促进了淋巴细胞ＩＬ—６基因表达（４倍），人胎脾单个核细胞、人胎脑组织匀浆和人胎胰岛细胞内均含有高浓度ＩＬ—６ｍＲＮＡ。     

采用LI—6cDNA探针检测人IL—6基因表达

采用缺口平移技术对ＩＬ－６ｃＤＮＡ进行了生物素和同位素标记，证明两种标记的ＩＬ－６ｃＤＮＡ（３０ｎｇ／ｍｌ）均可检出低至５ｐｇ的同源ＤＮＡ，而模拟探针（５００μｇ／ｍｌ）对高达１００ｎｇ的同源序列无此反应。应用ＩＬ－６ｃＤＮＡ对富含ＩＬ－６ｍＲＮＡ的标本进行斑点杂交或Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交，证明人参三醇皂甙促进了淋巴细胞ＩＬ－６基因表达（４倍），人胎脾单个核细胞、人胎脑细胞匀浆和胎胰岛细胞内均含有高     

人白细胞介素10（hIL—10）基因的克隆和序列测定

应用逆转录多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，自行设计并合成一对引物，成功地从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出ｈＩＬ－１０ｃＤＮＡ基因。并定向插入ｐＵＣ１８载体，经ＤＮＡ序列测定最终确定为ｈＩＬ－１０ｃＤＮＡ基因，这将为今后ｈＩＬ－１０基因探针的制备和基因表达，进一步在基因水平上探讨ｈＩＬ－１０的生物学功能提供了物质基础。     

基因芯片技术及其在药学领域的应用

１引言 １９９５年，Ｓｃｈｅｎａ［１］在《ｓｃｉｅｎｃｅ》杂志上发表文章，他把拟南芥菜植物的ｃＤＮＡ文库中的４８个ｃＤＮＡ用ＰＣＲ方法扩增后，把ＰＣＲ产物固化在玻璃片上，制成基因芯片（ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，也称 ＤＮＡ芯片）。然后从拟南芥菜的不同组织中提取ｍＡＮＡ反转录得到带荧光标记的ｃＤＮＡ，把不同组织来源的ｃＤＮＡ混合后与玻璃片上的ＤＮＡ进行杂交，用荧光双通道扫描系统对杂交点的荧光信号进行扫描分析，得到了拟南芥菜不同组织中基因的表达情况。自Ｓｃｈｅｎａ的成功报道后，短短四五年时间，有关…     

人白细胞介素10（hIL－10）基因的克隆和序列测定

应用逆转录多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，自行设计并合成一对引物，成功地从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出ｈＩＬ－１０ｃＤＮＡ基因。并定向插入ｐＵＣ１８载体中，经ＤＮＡ序列测定最终确定为ｈｌＬ－１０ｃＤＮＡ基困，这将为令后ｈＩＬ－１０基因探针的制备和基因表达，进一步在基因水平上探讨ｈＩＬ－１０的生物学功能提供了物质基础。     

血清HIV抗体阴性静脉药瘾者肝组织HIV DNA测定

为评估ＨＩＶ抗体阴性ＨＩＶ感染高危人群潜在的ＨＩＶ传播性 ,本研究对来自德国的 38例ＨＩＶ抗体阴性的静脉药瘾者肝组织样品进行常规ＤＮＡ抽提 ,用ＨＩＶ不同结构区 (ｇａｇ,ｐｏｌ,ｅｎｖ) 6对引物同时扩增ＨＩＶＤＮＡ。结果发现 38例肝组织中有 30例在ＨＩＶｇａｇ区 (Ｍ6 6 7 ｓｋ0 3ｃ ,Ｍ6 6 1 ｓｋ0 1ｃ)发生特异性扩增。 10例对ＨＩＶｅｎｖ区 (ｅｎｖ5 2 6 Ｃ0 2 ,ｅｎｖＣ0 1 5 71Ｋ)发生特异性扩增。进一步分析发现 38例中有 3例同时在ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ 3个区域产生特异性扩增 ,12例分别对ＨＩＶｇａｇ和ｐｏｌ区或ｇ…