miRNA-19对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其机制研究

目的　探讨miR-19在葡萄膜黑色素瘤（UM）细胞中的表达及其对UM细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法　qRT-PCR检测正常视网膜上皮细胞系ARPE-19和UM细胞系SP6.5、M23 中miR-19 的表达。将M23细胞分为miR-19 inhibitor组（转染miR-19-inhibitor）及miR-19 NC组(转染scramble）,MTT法检测各组细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,Western blot检测表皮生长因子受体(EGFR)/丝氨酸-苏氨酸激酶（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路蛋白表达。结果　正常视网膜上皮细胞系ARPE-19中miR-19 相对表达量为1.35±0.13,均显著低于UM细胞系SP6.5与M23中miR-19相对表达量8.35±0.73和9.35±0.43(均为P<0.01) 。 M23 细胞转染后,miR-19 inhibitor组中miR-19表达量低于miR-19 NC组 (1.05±0.33 vs 8.05±0.64,P<0.01)。MTT法检测结果显示,转染24 h,miR-19 inhibitor组与miR-19 NC组光密度值比较,差异无统计学意义（P>0.05);转染48 h、72 h、96 h,miR-19 inhibitor组光密度值均低于miR-19 NC组（均为P<0.05)。miR-19 inhibitor组细胞凋亡率高于miR-19 NC组［(15.34±2.35)% vs (8.23±0.72) %,P<0.05］。miR-19 inhibitor组细胞划痕愈合率低于miR-19 NC组 ［(23.7±2.1） % vs （68.9±5.1）%,P<0.05］。miR-19 inhibitor组侵袭细胞数少于miR-19 NC组［(45.1±3.9）个 vs （115.3±8.9）个,P<0.05］。miR-19 inhibitor组UM细胞系M23 EGFR蛋白表达量低于miR-19 NC组（0.43±0.03 vs 1.02±0.02,P<0.05) 。miR-19 inhibitor组AKT蛋白表达量低于miR-19 NC组（0.52±0.04 vs 1.12±0.05,P<0.05)。miR-19 inhibitor组mTOR蛋白表达量低于miR-19 NC组（0.63±0.05 vs 1.41±0.06,P<0.05）。结论　敲低miR-19 表达可抑制UM细胞增殖、迁移和侵袭能力并促进凋亡,其机制可能与EGFR/AKT/mTOR信号通路被抑制有关。     

上调microRNA-27b对血小板衍生因子诱导下的人视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用

目的　观察过表达的microRNA-27b(miR-27b)对血小板衍生因子（platelet-derived growth factor,PDGF）诱导下的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）增殖的抑制作用，探讨miR-27b在ARPE细胞生物学行为中的作用及其调控机制。方法　将miR-27b过表达质粒或空载体转入ARPE-19细胞36 h后，用终浓度为20 μg·L^-1的PDGF预处理ARPE-19细胞5 h。根据转染物不同，将实验分为空白对照组（control组）、miR-27b阴性对照组（miR-27b NC组）、miR-27b模拟物转染组（PDGF+mimics组）和空载体转染组（PDGF+NC组）。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测转染后各组ARPE-19细胞中miR-27b的表达水平；MTT法测定各组细胞活性；通过流式细胞术评估各组细胞周期的分布变化；Western blot检测各组细胞周期的正向调控因子cyclinD1、CDK4和负向调控因子p21^CIP1和p27^KIP1的表达水平。结果　qRT-PCR检测结果显示:经PDGF处理5 h，与miR-27b NC组相比，PDGF+NC组miR-27b的表达显著降低（P<0.01）；与PDGF+NC组相比，PDGF+mimics组miR-27b的表达增加（P<0.01）。MTT检测结果显示:与miR-27b NC组相比，PDGF+NC组ARPE-19细胞的光密度（D）值增加(P<0.01)；而与PDGF+NC组相比，PDGF+mimics组可明显抑制ARPE-19细胞的D值(P<0.01)。流式细胞术检测结果显示:与空白对照组和miR-27b NC组相比，PDGF+NC组G0/G1期细胞的百分比显著降低，S期细胞的百分比增加（P<0.05）；而与PDGF+NC组相比，PDGF+mimics组miR-27b的过表达显著增加了G0/G1期细胞的百分比，并抑制了细胞增殖（均为P<0.05）。Western blot检测结果显示:与PDGF-NC组相比，PDGF+mimics组miR-27b的过表达可显著降低cyclinD1蛋白和CDK4蛋白的表达，同时增强了p21^CIP1蛋白和p27^KIP1蛋白的表达（均为P<0.05）。结论　上调miR-27b表达可抑制PDGF诱导的ARPE细胞增殖。     

脑源性神经营养因子（BDNF）对高糖环境下视网膜Müller细胞的保护作用

目的　探讨脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）对高糖环境下视网膜Müller细胞的保护作用。方法　该研究实验分为3组,对照组、高糖组（对照组中添加25 mmol·L^-1葡萄糖）、BDNF组（高糖组添加100 mg·L^-1 BDNF）,实验干预24 h后,在倒置显微镜下观察各组细胞形态和生长状态,并进行各项指标检测。用倒置荧光显微镜观察各组视网膜Müller细胞的生长状态并检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）荧光强度;流式细胞仪检测视网膜Müller细胞凋亡率,Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达情况。结果　与对照组相比,高糖组Müller细胞生长状态差,细胞突起减少,细胞失去原有形态,由原来的不规则形变为类圆形,折光性增强;而BDNF组与对照组相比无明显差异;与高糖组相比,BDNF组细胞生长状态明显改善,细胞突起增多,细胞折光性减弱。与对照组相比,高糖组Müller细胞内ROS含量显著升高（P<0.01）,BDNF组细胞内ROS含量亦升高（P<0.01）;与高糖组相比,BDNF组ROS含量显著减少（P<0.01）。与对照组相比,高糖组细胞凋亡率显著升高（P<0.01）,BDNF组凋亡率仍高于对照组（P<0.01）;与高糖组相比,BDNF组凋亡率明显减少（P<0.01）。与对照组相比,高糖组Bcl-2蛋白相对表达量显著减少,Bax蛋白相对表达量明显升高,Bcl-2/Bax二者比值降低（P<0.01）,BDNF组与对照组相比相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）;与高糖组相比,BDNF组Bcl-2蛋白相对表达量明显升高,Bax蛋白表达减少,Bcl-2/Bax比值升高（P<0.01）。结论　高糖环境能诱导视网膜Müller细胞凋亡,而给予外源性BDNF能够显著抑制高糖环境诱导的视网膜Müller细胞凋亡,对视网膜Müller细胞起到保护作用。     

miR-370通过FoxM1相关通路调控人视网膜母细胞瘤细胞凋亡机制研究

目的　探讨miR-370对人视网膜母细胞瘤细胞Y79增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法　通过Lipofectamine TM 2000将miR-370-mimics、miR-370-NC及miR-370-inhibitor转染至Y79细胞内,分别建立miR-370过表达组（mimics组）、对照组（NC组）和抑制组（inhibitor组）,三组转染24 h、48 h、72 h和96 h时,均使用CCK-8检测各组细胞增殖活性;转染48 h后,RT-PCR检测各组细胞内miR-370表达;Annexin V-FITC/PI联合流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,Western Blot检测各组细胞PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达。结果　mimics组细胞miR-370 mRNA表达远高于其他两组（均为P<0.05）,inhibitor组细胞miR-370 mRNA表达显著低于其他两组（均为P<0.05）。自转染48 h起,inhibitor组细胞增殖活性显著高于其他两组（均为P<0.05）,而mimics组细胞增殖活性显著低于其他两组（均为P<0.05）,这种趋势一直持续至转染后96 h。mimics组细胞早期凋亡率显著高于其它两组（均为P<0.05）,而inhibitor组细胞早期凋亡率在三组中最低（P<0.05）。mimics组细胞内PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达均显著低于其他两组（均为P<0.05）,而inhibitor组细胞内PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达显著高于其他两组（均为P<0.05）。结论　miR-370能够抑制人视网膜母细胞瘤细胞Y79的增殖,促进其凋亡,这种影响可能是通过降低PI3K/AKT/FoxM1信号通路的活性实现的。     

miR-21对H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡及PTEN/AKT通路的影响

目的　探讨miR-21对H₂O₂诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡以及PTEN/AKT通路的影响。方法　体外培养人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19,实验分为四组:空白对照组、阴性对照组、H₂O₂组、H₂O₂+miR-21mimics组,使用q-RT-PCR法检测各组ARPE-19细胞中miR-21表达,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3以及人第10号染色体缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN）、磷酸化AKT蛋白表达。结果　与空白对照组和阴性对照组相比,H₂O₂组和H₂O₂+miR-21 mimics组miR-21表达量（1.14±0.23、2.18±0.44）、SOD水平［（5.49±1.10） U·L^-1、（14.28±2.86） U·L^-1］、Bcl-2蛋白含量（0.34±0.07、0.62±0.12）、p-PI3K表达水平（0.46±0.09、0.68±0.13）、p-AKT水平（0.53±0.11、1.16±0.13）均显著降低,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）,而活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）水平（30.58±7.96、23.25±5.67）、MDA水平［（3.95±0.79）mol·L^-1、（2.13±0.43）mol·L^-1］、凋亡率［（25.48±5.10）%、（17.63±3.52）%］、PTEN蛋白表达（0.59±0.12、0.43±0.11）、Bax表达（0.73±0.15、0.49±0.10）、Caspase-3蛋白表达（0.85±0.17、0.42±0.08）均显著升高,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。与H₂O₂组相比,H₂O₂+miR-21 mimics组miR-21表达量、SOD水平、Bcl-2蛋白表达、p-PI3K及p-AKT蛋白表达均显著升高（均为P＜0.05）,ROS水平、MDA水平、细胞凋亡率、PTEN蛋白表达、Bax及Caspase-3蛋白表达均显著降低（均为P＜0.05）。结论　上调miR-21可能通过激活PTEN/AKT信号通路抑制H₂O₂诱导的视网膜色素上皮细胞细胞凋亡。     

lncRNA MEG3对视网膜母细胞瘤细胞增殖与迁移的作用及其机制研究

目的　探讨长链非编码RNA母系表达基因3（lncRNA MEG3）对视网膜母细胞瘤（RB）细胞增殖、迁移的作用及其机制研究。方法　将对数生长期的人RB细胞分为对照组（不做任何处理）、NC组（含lncRNA MEG3-NC无序干扰序列的pcDNA3.1质粒）、lncRNA MEG3组（含lncRNA MEG3序列的pcDNA3.1质粒）、激活剂组（含lncRNA MEG3序列的pcDNA3.1质粒+Wnt/β-catenin通路激活剂LiCl）。利用RT-qPCR检测各组RB细胞中lncRNA MEG3的相对表达水平;CCK-8法检测lncRNA MEG3对RB细胞增殖的抑制作用;Transwell法检测lncRNA MEG3对RB细胞迁移的影响,RT-PCR检测各组RB细胞中Wnt1、β-catenin、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）mRNA相对表达水平;Western blot检测各组RB细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白相对表达水平。结果　对照组、NC组、lncRNA MEG3组和激活剂组RB细胞中lncRNA MEG3相对表达水平分别为0.81±0.27、0.78±0.26、3.88±0.39、3.76±0.38。与对照组和NC组相比,lncRNA MEG3组和激活剂组RB细胞中lncRNA MEG3相对表达水平均升高（均为P<0.05）。与NC组相比,lncRNA MEG3组RB细胞培养24 h、48 h、72 h细胞增殖抑制率逐渐升高（均为P<0.05）;与lncRNA MEG3组相比,激活剂组RB细胞培养24 h、48 h、72 h细胞增殖抑制率逐渐降低（均为P<0.05）。NC组、lncRNA MEG3组、激活剂组RB细胞增殖抑制率均随时间延长而升高（均为P<0.05）。与对照组和NC组相比,lncRNA MEG3组和激活剂组RB细胞迁移数均明显减少（均为P<0.05）;与lncRNA MEG3组相比,激活剂组RB细胞迁移数增多（P<0.05）。与对照组和NC组相比,lncRNA MEG3组和激活剂组RB细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 mRNA和蛋白相对表达水平均明显降低（均为P<0.05）;与lncRNA MEG3组比较,激活剂组RB细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 mRNA和蛋白相对表达水平均有升高（均为P<0.05）。结论　过表达lncRNA MEG3可抑制人RB细胞增殖及迁移,其可能是通过阻断Wnt/catenin通路发挥作用的。     

miR-101表达上调对视网膜母细胞瘤细胞的增殖及侵袭能力的抑制作用

目的　探究miR-101对视网膜母细胞瘤增殖及侵袭能力的影响。方法　收集31例视网膜母细胞瘤组织及7例正常视网膜组织。培养人正常视网膜血管内皮细胞系ACBRI-181及视网膜母细胞瘤系HXO-Rb44。Lipofectamine 2000转染HXO-Rb44细胞并分组:阴性对照（normal control,NC）1组［转染microRNA（miR）-101阴性对照物］、miR-101表达组（转染miRNA-101类似物）;NC 2组［转染组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶（EZH2）阴性对照序列］、siRNA-EZH2组（转染EZH2siRNA）、siRNA-EZH2+mimics组（转染EZH2siRNA和miRNA-101类似物）和EZH2+mimics组（转染EZH2表达载体和miRNA-101类似物）。正常HOX-Rb44细胞作为空白组。采用qRT-PCR检测miR-101、EZH2 mRNA表达,Western blot检测EZH2蛋白表达。MTT及Transwell实验分别测定细胞增殖及侵袭能力。荧光素酶报告基因实验确定miR-101和EZH2的靶向关系。裸鼠体内移植实验测定细胞体内增殖能力。结果　与正常视网膜组织和ACBRI-181细胞相比,视网膜母细胞瘤组织及HXO-Rb44细胞中miR-101的相对表达量均明显下调（均为P<0.05）。EZH2 mRNA及蛋白在miR-101表达组中的相对表达量均显著低于空白组和NC1组（均为P<0.05）。72~96 h,miR-101表达组的吸光度（A）值均显著低于空白组及NC1组（均为P<0.01）。miR-101表达组侵袭细胞数量（51±6）均显著低于空白组（97±11）及NC1组（92±8）（均为P<0.01）。EZH2是miR-101的靶基因。48~96 h,siRNA-EZH2组和siRNA-EZH2+mimics组的A值均显著低于空白组和NC2组（均为P<0.01）;72~96 h,siRNA-EZH2+mimics组的A值明显低于siRNA-EZH2组（P<0.05）;24～96 h,EZH2+mimics组的A值与空白组和NC2组之间的差异均无统计学意义（均为P>0.05）。siRNA-EZH2组侵袭细胞数量（48±4）和siRNA-EZH2+mimics组（38±3）均显著低于空白组（95±10）和NC2组（90±6）（均为P<0.01）,siRNA-EZH2+mimics组侵袭细胞数量明显低于siRNA-EZH2组（P<0.05）,EZH2+mimics组侵袭细胞数量与空白组和NC2组之间的差异均无统计学意义（均为P>0.05）。裸鼠体内移植5～7周,siRNA-EZH2组和siRNA-EZH2+mimics组的瘤体体积均显著低于空白组和NC2组（均为P<0.01）,siRNA-EZH2+mimics组的瘤体体积明显低于siRNA-EZH2组（P<0.05）,EZH2+mimics组的肿瘤体积与空白组和NC2组之间的差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　miR-101上调后可抑制HXO-Rb44细胞的增殖及侵袭能力,这可能是通过抑制EZH2表达实现的。     

miR-373在视网膜母细胞瘤Y79细胞中的表达及其抑制侵袭及迁移能力的实验研究

目的　观察miR-373在视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB）细胞中的表达及其对RB Y79细胞侵袭及迁移能力的影响和相关机制。方法　采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-373在RB细胞系RB Y79、SO-RB50和人正常视网膜血管内皮细胞系ACBRI-181中的表达水平,并应用脂质体转染法将miR-373 抑制物（miR-373抑制物组）和阴性对照（NC组）分别转染至Y79细胞,Transwell实验检测Y79细胞侵袭和迁移能力的变化,Western blot检测Y79细胞中上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关标志物E-Cadherin、Vimentin和N-Cadherin蛋白的表达变化。结果　qRT-PCR 结果显示,RB细胞系Y79、SO-RB50中miR-373的相对表达量分别为6.21±0.34、5.40±0.38,明显高于人正常视网膜血管内皮细胞系ACBRI-181中miR-373的相对表达量（1.02±0.04）（均为P＜0.05）。Transwell实验显示,miR-373抑制物组迁移细胞数（74±13）个,明显低于NC组（180±17）个（P＜0.05）,miR-373抑制物组侵袭细胞数（51±9）个明显低于NC组（113±14）个（P＜0.05）。Western blot结果显示,miR-373抑制物组E-Cadherin蛋白的表达（0.40±0.08）明显高于NC组（0.20±0.06）（P＜0.05）,Vimentin蛋白的表达（0.17±0.06）也明显低于NC组（0.51±0.10）（P＜0.05）,N-Cadherin蛋白的表达（0.12±0.06）也明显低于NC组（0.33±0.08）（P＜0.05）。结论　miR-373在RB细胞中表达异常增高,降低miR-373的表达能够通过调控EMT抑制RB Y79细胞的侵袭和迁移能力,为RB的靶向治疗提供了新的潜在靶点。     

miR-101-3p靶向TGFβR1/Smad抑制视网膜母细胞瘤细胞侵袭和迁移

目的　探索miR-101-3p对视网膜母细胞瘤细胞侵袭和迁移的影响及作用机制。方法　RT-PCR检测miR-101-3p及转化生长因子β受体1（transforming growth factor beta receptor 1，TGFβR1）表达水平；生物信息学预测miR-101-3p与TGFβR1的靶向关系并通过荧光素酶报告实验进行验证。将Y79细胞分为Control组、miR-101-3p mimic组（转染miR-101-3p mimic）、pcDNA-TGFβR1组（转染pc-TGFβR1）及miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1组（共转染miR-101-3p mimic和pc-TGFβR1），MTT检测细胞增殖速率，流式细胞术检测细胞凋亡，Transwell实验检测细胞侵袭，划痕实验检测细胞迁移，Western blot检测TGFβR1、Ki67、Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-9、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）-2、MMP-9、血管内皮生长因子、p-Smad2及p-Smad3的表达水平。结果　在视网膜母细胞瘤组织中,miR-101-3p的表达为0.35±0.05，明显低于正常视网膜组织（P<0.01）；视网膜母细胞瘤细胞株Y79中miR-101-3p的表达为0.24±0.04，明显低于视网膜上皮细胞株ARPE-19（P<0.01）；与Control组相比，miR-101-3p mimic组miR-101-3p mRNA水平显著升高、TGFβR1 mRNA水平显著降低（均为P<0.01）；miR-101-3p与TGFβR1之间存在连续结合片段。与Control组相比，miR-101-3p mimic组TGFβR1的表达水平显著降低，增殖速率及细胞中Ki67表达均显著降低，细胞凋亡率显著增加，Bax及cleaved Caspase-9表达显著升高、Bcl-2表达显著降低，侵袭细胞数目和划痕闭合率显著降低，MMP-2、MMP-9、血管内皮生长因子、TGFβR1、p-Smad2和p-Smad3的表达水平显著降低（均为P<0.01）。结论　miR-101-3p通过靶向下调TGFβR1抑制视网膜母细胞瘤细胞的侵袭和迁移。     

白藜芦醇对碘酸钠诱导后人视网膜色素上皮细胞凋亡的抑制作用

目的　研究白藜芦醇（resveratrol，RES）对碘酸钠诱导的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞凋亡的抑制作用及机制，探索该药是否可用于干性年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration,AMD)的治疗。方法　通过碘酸钠诱导的RPE细胞模拟干性AMD。RPE细胞传代培养分为空白对照组、碘酸钠损伤组、RES+碘酸钠损伤组，并观察各组细胞形态。MTT法检测RES对RPE细胞最佳保护作用的浓度以及最佳浓度下对不同浓度碘酸钠损伤的RPE细胞的保护作用。Western blot检测各组细胞的凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达情况。Hosste33342及流式细胞术检测各组细胞的凋亡总量变化以及凋亡种类之间的差别。结果　5 μmol·L^-1 RES对RPE细胞有较强的保护作用且此浓度下对不同损伤程度的RPE细胞都有较强的保护作用。RES+碘酸钠损伤组Bax蛋白的相对表达量（0.45±0.07）明显低于碘酸钠损伤组（0.90±0.09），差异有统计学意义（P<0.05），与空白对照组（0.34±0.06）差异无统计学意义（P>0.05）。RES+碘酸钠损伤组Bcl-2蛋白的相对表达量（0.56±0.14）与碘酸钠损伤组（0.24±0.04）差异有统计学意义（P<0.05），与空白对照组（0.73±0.08）差异无统计学意义（P>0.05）。Hosste33342检测结果显示，RES+碘酸钠损伤组凋亡细胞含量明显低于碘酸钠损伤组（P<0.05），且流式细胞术检测发现，RES+碘酸钠损伤组和碘酸钠损伤组比较，RES+碘酸钠损伤组早期凋亡的细胞含量相对较高，晚期凋亡细胞含量相对较少。结论　RES对碘酸钠诱导损伤的RPE细胞的凋亡具有良好的抑制作用，对干性AMD的治疗具有潜在价值。     

补阳还五汤对高糖环境下miR-21介导的人视网膜微血管内皮细胞自噬的影响

目的　观察补阳还五汤对高糖环境下miR-21介导的人视网膜微血管内皮细胞（HRCECs）自噬的影响，以期为DR自噬调控机制及药物治疗提供依据。方法　HRCECs随机分5组，即正常对照组、高糖组、补阳还五汤组、miR-21 mimic组、miR-21 mimic+补阳还五汤组。除正常对照组外，其余各组细胞于25.0 g·L^-1葡萄糖环境中培养,建立高糖损伤模型，补阳还五汤组加用5 g·L^-1补阳还五汤水提液干预；miR-21 mimic组孵育转染 miR-21 mimic的HRCECs；miR-21 mimic+补阳还五汤组用5 g·L^-1补阳还五汤水提液干预转染 miR-21 mimic的HRCECs。荧光显微镜下观察转染效率，实时荧光定量PCR检测各组细胞中miR-21的表达，Western blot检测各组细胞中LC3蛋白表达。结果　经转染miR-21 mimic后，大部分HRCECs呈绿色荧光，荧光强度为32.708±1.001。实时荧光定量PCR检测结果显示，miR-21 mimic组HRCECs的miR-21相对表达量为106.677±5.787，明显高于高糖组（5.892±0.341）和正常对照组（0.993±0.015），差异均有统计学意义（均为P<0.05）。高糖组和miR-21 mimic组HRCECs中LC3蛋白相对表达量均较正常对照组升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05），且miR-21 mimic组HRCECs中LC3蛋白相对表达量高于高糖组（P=0.001）。补阳还五汤组HRCECs中LC3蛋白相对表达量低于高糖组和miR-21 mimic组（均为P<0.05），与正常对照组比较差异无统计学意义（P=0.197）。miR-21 mimic+补阳还五汤组HRCECs中LC3蛋白相对表达量低于miR-21 mimic组，但高于补阳还五汤组，差异均有统计学意义（均为P<0.05），与高糖组比较差异无统计学意义（P=0.930）。结论　高糖环境下，miR-21介导HRCECs的自噬，补阳还五汤可以下调HRCECs的miR-21表达，进而减少细胞自噬。     

MicroRNA-4516、MicroRNA-198在视网膜母细胞瘤Y79细胞中的表达及其意义

目的 探究MicroRNA-4516(miR-4516)、MicroRNA-198(miR-198)在视网膜母细胞瘤(RB)Y79细胞中的表达及其临床意义.方法 收集2018年3月至2021年3月行眼球摘除术治疗的35例RB患儿的肿瘤组织及30例正常视网膜组织标本,比较肿瘤组织、正常视网膜组织和Y79细胞中miR-45...     

ghrelin-GHSR-1a对高糖环境下视网膜血管内皮细胞的保护作用

目的 观察ghrelin及其受体生长激素分泌素受体1a(GHSR-1a)在高糖环境下对视网膜血管内皮细胞的保护作用.方法 将体外培养的人视网膜血管内皮细胞(HRMECs)分为对照组和高浓度葡萄糖组.对照组细胞在含5.5 mmol·L-1葡萄糖的M199培养基中培养48 h,高浓度葡萄糖组细胞在含30.0 mmol·L-...     

miR-24对过氧化氢诱导的HLE-B3细胞凋亡的影响及其与线粒体Smac/Diablo-XIAP-caspase-9/3凋亡途径的关系

目的　探讨微小RNA-24(miR-24)对过氧化氢（H₂O₂）诱导的HLE-B3细胞凋亡的影响,分析其与线粒体中第二个线粒体衍生的胱天蛋白酶激活因子/低等电位点的凋亡抑制蛋白的直接结合蛋白（the second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low PI,Smac/Diablo）-XIAP-caspase-9/3凋亡途径的关系。方法　将HLE-B3细胞分为对照组、H₂O₂组、H₂O₂+miR-24 NC组和H₂O₂+miR-24 抑制剂组。先按照miR-24抑制剂、miR-24 NC试剂盒说明书转染H₂O₂+miR-24抑制剂组和H₂O₂+miR-24 NC组细胞24 h,然后向H₂O₂组、H₂O₂+miR-24 NC组和H₂O₂+miR-24 抑制剂组HLE-B3细胞中加入200 μmol·L^-1 H₂O₂干预24 h,收集细胞用于后续实验;将正常培养的HLE-B3细胞设置为对照组。采用实时荧光定量PCR检测各组HLE-B3细胞miR-24表达情况,CCK-8法检测各组HLE-B3细胞生长情况,用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,计算各组细胞存活率和细胞凋亡率。采用荧光探针JC-1法检测线粒体膜电位变化情况（利用红绿荧光强度比反映线粒体膜电位）;采用蛋白免疫印迹法检测各组HLE-B3细胞线粒体和细胞质分级中Smac/Diablo及细胞质分级中XIAP、caspase-9和caspase-3蛋白表达情况。对所得数据进行统计学分析。结果　当H₂O₂浓度大于200 μmol·L^-1时,细胞存活率均小于50%,本实验以200 μmol·L^-1 作为最适H₂O₂浓度。对照组、H₂O₂组、H₂O₂+miR-24 NC组和H₂O₂+miR-24抑制剂组细胞miR-24相对表达量分别为1.04±0.02、2.73±0.09、2.69±0.07 和1.15±0.06;与对照组相比,H₂O₂组细胞中miR-24表达升高（P<0.05）;与H₂O₂组和H₂O₂+miR-24 NC组相比,H₂O₂+miR-24抑制剂组中miR-24表达降低（均为P<0.05）,但H₂O₂组与H₂O₂+miR-24 NC组中miR-24表达差异无统计学意义（P>0.05）。与H₂O₂组和H₂O₂+miR-24 NC组相比,H₂O₂+miR-24抑制剂组细胞存活率显著升高、细胞凋亡率显著降低（均为P<0.05）,但H₂O₂组与H₂O₂+miR-24 NC组细胞存活率和细胞凋亡率差异均无统计学意义（均为P>0.05）。对照组、H₂O₂组、H₂O₂+miR-24 NC组和H₂O₂+miR-24抑制剂组红绿荧光强度比分别为0.24±0.02、0.12±0.02、0.15±0.03、0.31±0.06。与对照组相比,H₂O₂组红绿荧光强度比降低（P<0.05）;与H₂O₂组和H₂O₂+miR-24 NC组相比,H₂O₂+miR-24抑制剂组红绿荧光强度比均升高（均为P<0.05）,但H₂O₂组与H₂O₂+miR-24 NC组红绿荧光强度比比较,差异无统计学意义（P>0.05）。与H₂O₂组和H₂O₂+miR-24 NC组相比,H₂O₂+miR-24抑制剂组线粒体分级中Smac/Diablo蛋白及细胞质分级中XIAP蛋白表达升高（均为P<0.05）,细胞质分级中Smac/Diablo、caspase-9和caspase-3蛋白表达降低（均为P<0.05）,但H₂O₂组与H₂O₂+miR-24 NC组线粒体、细胞质分级中Smac/Diablo蛋白及细胞质分级中XIAP、caspase-9和caspase-3蛋白表达相比,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　miR-24可能通过抑制线粒体Smac/Diablo-XIAP-caspase-9/3凋亡途径,抑制H₂O₂诱导的HLE-B3细胞凋亡。     

miRNA-let-7c在逆转大鼠糖尿病视网膜病变中的作用

目的　探讨MicroRNA-let-7c（miRNA-let-7c）在逆转糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）中的作用。方法　制作DR大鼠模型48只，分为6组:空白模型组、miRNA-let-7c模拟物组、Anti-miRNA-let-7c组、阴性对照（NC）组、Anti-miRNA-let-7c+Anti-STAT3组、Anti-STAT3组；同时选择8只正常大鼠作为正常组。采用实时荧光定量PCR检测各组大鼠视网膜和转染后的293T细胞中miRNA-let-7c和STAT3的mRNA表达水平，Western blot检测各组大鼠视网膜中STAT3、VEGFA、BAX及Bcl蛋白水平，通过HE染色计数大鼠视网膜血管内皮细胞的数目以及荧光素酶报告基因分析miRNA-let-7c与STAT3的直接作用。结果　各组大鼠视网膜和转染后的293T细胞中miRNA let-7c与STAT3的mRNA表达呈负相关（r=-0.906，P<0.001）。与NC组的血管内皮细胞核［（22±3）个］相比，Anti-STAT3组的血管内皮细胞核［（14±3）个］明显减少（P<0.05）；而Anti-miRNA-let-7c组血管内皮细胞核［（58±6）个］显著增加（P<0.05）。与NC组相比，miRNA-let-7c组和Anti-STAT3组大鼠视网膜中的STAT3、VEGFA和Bax蛋白表达显著降低（P<0.05）；而Anti-miRNA-let-7c组大鼠视网膜中的STAT3、VEGFA和Bax蛋白表达显著升高（P<0.05）。此外，miRNA-let-7c组miRNA-let-7c mRNA表达为2.24±0.25，较NC组miRNA-let-7c mRNA表达（1.32±0.17）显著升高（P<0.05），而Anti-miRNA-let-7c组miRNA-let-7c mRNA表达（0.62±0.05）显著降低（P<0.05）。双荧光素酶报告基因检测结果显示，STAT3 3’UTR-WT的相对荧光素酶活性为0.55±0.03，低于WT + NC组的1.04±0.18，差异有统计学意义（P<0.05），表明STAT3是miRNA-let-7c的靶基因。结论　miRNA-let-7c的过表达可能下调STAT3的表达，从而阻止大鼠DR模型的发展。