肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体的构建及其活性表达

目的：克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,构建在肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体,研究p16基因表达对肝癌细胞的影响。方法：采用分子生物学技术手段,克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,将其插入腺病毒载体质粒中,并在293细胞中重组出携带p16基因的腺病毒AdAFP-p16。Western Blot检测p16基因在肝癌细胞中的特异性表达。细胞病变效应（CPE）观察p16基因表达对肝癌细胞生长的抑制作用。结果：AdAFP-p16能够介导p16基因在肝癌细胞中特异性表达,而对正常细胞中p16的表达没有影响;p16基因表达能够特异性抑制肝癌细胞的生长。结论：采用AFP启动子可以实现p16基因的肝癌细胞中定向而特异性表达,提高基因表达产物在肿瘤局部的浓度,有利于提高治疗效果。     

含甲胎蛋白肽段的重组腺病毒转染树突状细胞诱导细胞毒性T细胞对肝癌细胞的体外杀伤效应

目的 研究人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)转染含甲胎蛋白(AFP,137-145)片段的重组腺相关病毒后所诱导的特异性T细胞对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721的体外杀伤作用.方法 抽取健康志愿者外周血,分离单核细胞,体外培养,使用含AFP片断的重组腺相关病毒转染未成熟DC,诱导特异性T细胞.检测体外培养的DC和细胞毒性T细胞(CTL)活性,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测CTL对HepG2和SMMC-7721细胞的杀伤作用.结果 转染或未转染的体外培养的成熟DC高表达CD40、CD86和IL12,成熟DC诱导的CTL高表达IFNγ;修饰成熟后的DC后体外能诱导特异性CTL,该CTL在休外对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721均有杀伤作用.结论 重组腺相关病毒转染DC,不明显改变DC表型和刺激淋巴细胞增殖和分化功能,可诱导自体CTL增殖,含AFP(137～145)片断的腺相关病毒转染DC诱导自体CTL对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721细胞有明显杀伤作用,DC疫苗可以作为肝癌患者免疫治疗的有效补充.     

腺病毒介导CD/5FC“自杀基因”疗法对人肝癌裸鼠和小鼠结肠腺癌的治疗作用研究

“自杀基因”疗法应用于肿瘤治疗时,通常是在肿瘤局部直接转染“自杀基因”,以期达到在肿瘤局部发挥抗肿瘤作用而避免全身毒性.在本实验中,我们观察了腺病毒介导的“自杀基因”疗法(CD/5FC系统)对人肝细胞癌SMMC-7721及小鼠结肠腺癌CT26的生长抑制作用,证实了腺病毒介导的CD/5FC系统在体外能杀伤人肝癌细胞SMMC-7721,并且能明显地抑制裸鼠SMMC-7721肿瘤模型的生长,对小鼠的结肠腺癌CT26也有一定的治疗作用.同时观察了以AFP启动子驱动的CD基因合并5FC的使用对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用,证实了以肝癌特异启动子驱动的CD基因能在高表达AFP的肝癌细胞HepG2中特异表达,合并5FC的使用能在体外特异地杀伤HepG2细胞.这一组织特异性的“自杀基因”系统能特异地抑制高水平分泌AFP的人肝细胞癌裸鼠模型7721AFP( )的生长,上述研究结果表明,腺病毒介导的CD/5FC系统是一个有效的治疗方案,组织特异性的表达调控更能体现该疗法的实用价值.     

腺病毒介导的AFP基因修饰树突状细胞的体外生物学特性

目的: 探讨腺病毒介导AFP基因修饰树突状细胞瘤苗体外生物学活性。方法:将携带小鼠AFP全长cDNA的重组腺病毒表达载体AdAFP转染BMDC，构建AFPDC肝癌瘤苗，采用电化学发光免疫测定法确证AFPDC转染的有效性，FACS检测表面分子和内吞功能，3HTdR掺入法检测T细胞增殖反应的能力，51Cr 释放法检测CTL活性。结果: AFP基因转染12 h后DC及其培养上清中可检到AFP的表达，表明腺病毒介导的AFP基因转染的有效性。AFPDC与BMDC比较B7分子明显上调，MHC分子也有轻度升高，内吞功能降低(P<0.05)。AFPDC激发同基因型小鼠T细胞增殖功能均明显高于DC对照组和LacZDC组(P<0.05)。AFPDC体外诱导CTL对Hepa16肿瘤细胞的杀伤作用具有特异性。结论: 肝癌相关基因AFP可作为抗肝癌基因治疗的切入点，该研究为肝癌树突状细胞体内免疫治疗提供了实验依据。     

重组腺病毒介导survivin基因转染树突状细胞对肾细胞癌的免疫效应

目的:研究重组腺病毒介导survivin基因转染的树突状细胞(DCs)体外诱导特异性抗肾细胞癌的免疫效应.方法:以携带survivin基因的重组腺病毒(Ad-svv)感染DCs, Western bloting检测转染DCs的survivin的表达,流式细胞术检测DCs表面分子CD83、MHCⅡ、CD80、CD86的表达,ELISA法检测DCs培养上清中IL-12 的含量;混合淋巴细胞反应(MLR)测定DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力, ELISA法检测DCs刺激淋巴细胞后上清中IFN-γ含量,MTT法检测其诱导的特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)免疫效应.结果:各组Ad-svv转染DCs后均表现出成熟的DCs表型特征,均可见survivin蛋白表达;转染Ad-svv或转染空白腺病毒载体(Ad-CMV)的DCs上清中IL-12均高于对照组(P<0.01),转染Ad-svv的DCs上清中IL-12高于转染Ad-CMV-DCs组(P<0.01).MLR中,转染或未转染腺病毒的DCs均能刺激同种异体T淋巴细胞的增殖,Ad-svv-DC刺激T淋巴细胞增殖的能力最强(P<0.01);MLR后,转染或未转染重组腺病毒的DCs均能刺激T淋巴细胞IFN-γ的分泌,Ad-svv-DC组IFN-γ的分泌能力最强(P<0.01).Ad-svv-DCs组诱导的CTL对survivin表达阳性的786-0肾癌细胞的杀伤率明显高于无survivin表达的L-02肝细胞(P<0.01),Ad-CMV-DCs、空白DC对786-0肾癌细胞无杀伤作用.结论:重组腺病毒介导survivin基因转染能显著提高DCs对肾癌细胞抗原的提呈能力、激活特异性细胞毒性T淋巴细胞、诱导针对survivin的特异性抗癌免疫效应.     

乙肝病毒衣壳运载体甲胎蛋白启动子驱动的白细胞介素-2在肝癌细胞中的靶向表达

目的 利用乙肝病毒衣壳（HBVE）和人甲胎蛋白（AFP）启动子的双重靶向性,观察白细胞介素-2（IL-2）基因是否可以在肝癌细胞中靶向表达.方法 体外培养HepG2、L02、HepG2.2.15细胞,PEG8000浓缩法提取HBVE作为基因运载体,聚合酶链反应（PCR）法制备人AFP启动子-IL-2重组基因,瞬时转染HepG2细胞与L02细胞,反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）观察IL-2 mRNA表达,Western blot观察IL-2蛋白表达情况.结果 以HBVE为基因的运载体,包裹人AFP启动子-IL-2重组基因后转染HepG2细胞和L02细胞,RT-PCR和Westem blot检测到HepG2细胞有IL-2的表达,而对照组L02细胞无IL-2的表达.结论 以HBVE为基因运载体,可以使AFP启动子驱动的IL-2基因在AFP阳性的肝癌细胞靶向表达,从而提高了外源基因导入肝癌细胞的安全性.     

含人AFP基因重组腺病毒载体的构建及其转染树突状细胞瘤苗的制备

目的：构建含人AFP基因的腺病毒载体,体外转染树突状细胞,制备树突状细胞肝癌瘤苗。方法：将AFP基因亚克隆到pIND载体和Shuttle2载体中,构建穿梭载体Shuttle2-AFP。用PI—SceⅠ和I—Ceu Ⅰ双酶切后将所获AFP基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno—X连接,构成pAdeno—AFP重组腺病毒载体。其后,用重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装腺病毒表达载体。通过酶切、PCR对腺病毒载体进行鉴定。包装好的重组病毒载体pAdeno—AFP体外感染树突状细胞制备树突状细胞肝癌瘤苗后,FACS分析pAd-eno—AFP／DC表面分子的表达,酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测AFP水平。结果：酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒插入片段为AFP基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带AFP基因感染树突状细胞,pAdeno—AFP／DC能高水平的表达CD1a,CD11c,CD80,CD86以及HIA—DR,并分泌较高水平的AFP。结论：构建成功的含AFP腺病毒载体可以在树突状细胞中表达AFP,为DC瘤苗的进一步研究奠定了基础。     

腺病毒介导的肝癌自杀基因疗法的实验研究

本文观察了胞嘧啶脱氨酶(CD)基因/5-氟胞嘧啶(5FC)自杀基因疗法对肝癌模型的治疗作用。以CMV启动子调控CD基因的重组腺病毒载体AdexCMV.CD在体外能有效转染人肝癌细胞株SMMC-7721和HepG2,转染后的细胞体外生长能力无明显变化,对5FC的敏感性明显增高。当以AFP上游调控序列驱动CD基因的重组腺病毒载体AdexAFP.CD分别转染SMMC-7721和HepG2时,CD基因能在HepG2中表达,使HepG2对5FC的敏感性增高,但不能使SMMC-7721的生长受到5FC的抑制。[~3H]TdR掺入法观察体外旁观者效应时发现,当细胞总数中转染细胞数超过20％时,其生长明显被5FC抑制。将AdexCMV.CD直接注射入裸鼠接种SMMC-7721细胞形成的皮下肿瘤中,并全身应用5FC后,与对照组相比,肿瘤大小在开始治疗后第8天约缩小3倍,第18天约缩小4倍,以上结果表明,腺病毒介导的CD/5FC自杀基因系统能在体内、外有效地抑制肝癌的生长。以AFP上游调控序列驱动CD基因的腺病毒载体介导的基因转染能在AFP阳性的肝癌细胞中特异表达。     

肝癌靶向性腺病毒载体的构建及其作用的研究

背景与目的:抑癌基因p16是肿瘤基因治疗最常用的治疗基因之一,通过腺病毒载体介导p16基因表达引发肿瘤细胞凋亡在多种p16基因失活的肿瘤细胞系中都得到了证实。研究表明,p16在人原发性肝细胞癌中存在高频率失活。因此,本研究通过观察外源性p16基因经AFP启动子驱动表达后对AFP阳性肝癌细胞的影响,以探讨p16基因在肝癌靶向基因治疗中应用的可行性。方法:将外源性p16基因置于人AFP核心启动子AF0.3下游,构建了携带p16基因的重组复制缺陷型腺病毒Ad-AFP-p16,感染肝癌细胞后,应用MTT比色法、Westernblot、DNA片段化分析、流式细胞术分析等方法在体外研究外源性p16基因表达对细胞生长的影响。小鼠皮下接种感染重组腺病毒的鼠肝癌细胞H22,观察病毒对肝癌细胞体内成瘤性的影响。结果:感染Ad-AFP-p16的肝癌细胞高效表达P16蛋白,MTT结果显示细胞生长受到明显抑制,到第六天Ad-AFP-p16对肝癌细胞Bel-7402和HepG2的生长抑制率分别为(94.42±11.70)%和(94.99±6.74)%,DNA片段化分析和流式细胞术分析证实p16能诱导肝癌细胞发生显著凋亡,感染后48hBel-7402和HepG2的凋亡率分别为39.57%和39.75%。感染Ad-AFP-p16的肝癌细胞体内成瘤受到明显抑制,对照组、Ad-GFP组、Ad-AFP-p16组以及Ad-CMV-p16组瘤体体积分别为(1.54±0.65)cm3、(1.71±1.01)cm3、(0.25±0.39)cm3和(0.25±0.45)cm3。结论:AFP启动子驱动p16基因表达可以诱导肝癌细胞发生凋亡。     

肝癌选择性溶瘤腺病毒的构建及其体外抑瘤作用

目的: 构建由AFP基因增强子启动子调控,并携带自杀基因TK的新型条件复制型腺病毒载体,观察该载体的选择复制能力、溶瘤作用及其与前药GCV联合处理对肝癌细胞的杀伤作用。方法:以HepG2基因组DNA为模板,PCR扩增AFP基因启动子（AFPp）和增强子(AFPe),构建表达质粒pAFPpEGFPluc和pAFPepEGFPluc,再构建由AFPep调控E1A表达、并携带TK基因的穿梭质粒pDC311AFPepE1A/CMVTK,利用AdMax系统包装腺病毒Ad.AFPepE1A/CMVTK;利用Western blotting、病毒增殖测试、细胞病变效应实验、病毒联合前药GCV对肝癌细胞的杀伤实验等鉴定病毒的复制能力、溶瘤作用和对肝癌细胞的杀伤作用。结果：成功构建的腺病毒载体 Ad.AFPepE1A/CMVTK在AFP阳性细胞中选择性复制,病毒自身具有一定的溶瘤作用;该病毒载体联合GCV前药系统处理肝癌细胞后,AFP阳性肝癌HepG2细胞和Hep3B细胞的存活率分别为(10.35±1.07)%、(15.49±5.80)%,AFP阴性的张氏肝细胞和人肺癌NCIH460细胞的存活率分别为(73.55±436)%、(74.54±9.89)% (P<0.01)。结论:构建的新型溶瘤腺病毒载体具有选择性杀伤肝癌细胞的能力,在肝癌治疗方面有良好的应用前景。