蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶特异性锤头状核酶-GCV重组载体的构建

目的构建蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)特异性锤头状核酶-犬贾第虫病毒(Giardia canis virus,GCV)重组载体。方法采用RNAdraw软件分析贾第虫编码丙酮酸激酶的基因序列,并设计特异性反义锤头状核酶(PKH)序列,将其与犬贾第虫病毒(GCV)连接,构建重组载体pGCV-PKH。将重组载体线性化体外转录产物,分别进行贾第虫细胞外、细胞内目的mRNA切割实验,采用荧光显微镜观察转染后24h的各组虫体。采用实时PCR对切割产物进行相对定量分析。结果构建了载有蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶特异性锤头状核酶的犬贾第虫病毒重组载体pGCV-PKH。细胞内切割实验结果表明,荧光显微镜下只有pGCV-GFP转染组虫体显示绿色荧光,pGCV-PKH转染组丙酮酸激酶mRNA的相对含量约为正常对照组的33.14%。细胞外切割实验结果表明,该组载体能在细胞外有效切割丙酮酸激酶mRNA,在设定条件下,其切割效率为58.5%。结论重组载体pGCV-PKH能有效转染蓝氏贾第鞭毛虫细胞,并能在其细胞内外对丙酮酸激酶mRNA进行有效切割。     

蓝氏贾第鞭毛虫alpha-8贾第素特异性锤头状核酶-GCV重组载体的构建

目的构建蓝氏贾第鞭毛虫alpha-8贾第素(α-8 giardin)特异性锤头状核酶-GCV重组载体。方法采用RNA draw软件对蓝氏贾第鞭毛虫α-8贾第素基因序列(GenBank登录号为AY781323)的二级结构进行模拟分析,按照G∶C比例和锤头状核酶设计原则,选取合适的核酶切割靶点,设计特异性锤头状核酶(H8)序列,并将其与犬贾第虫病毒(GCV)连接,获得α-8贾第素特异性锤头状核酶-GCV重组载体(pGCV634/H8/1423)。将载体线性化体外转录产物电击转染至贾第虫滋养体细胞内。提取转染后24 h的各组虫体总RNA,并以其为模板采用RT-PCR验证转染效果及对靶mRNA的切割效果。结果成功设计、合成了蓝氏贾第鞭毛虫α-8贾第素mRNA锤头状核酶序列(H8),将其与犬贾第虫病毒载体(GCV)连接,成功构建了pGCV634/H8/1423;RT-PCR实验结果表明,重组载体pGCV634/H8/1423转染贾第虫细胞后24 h可检测到核酶RNA的存在,并实现了对α-8贾第素mRNA高效、特异的切割作用。结论构建的pGCV634/H8/1423能有效转染至贾第虫细胞内,并在其细胞内对α-8贾第素基因...     

抗半胱氨酸蛋白酶-7核酶的克隆、体外表达与切割活性的研究

目的 设计并合成抗小鼠半胱氯酸蛋白酶-7(Caspaso7)的锤头状核酶,并对它们的体外表与体外切割活性进行研究。方法 采用计算机软件对锤头状核酶和小鼠Caspase 7基因的二级结构进行分析,核酶的DNA序列在体外由自动合成仪合成,小鼠Caspase-7日的基因通过RTPCR扩增获得,将核酶基因和caspase-7基因分别克隆入载体pBSKneoU6’和pGEM-T中,通过体外转录得到核酶和caspase-7 mRNA,通过体外切割筛选出具有切割活性的核酶。结果 针对目的基因的333和394位点设计合成了两个核酶：Rz333和Rz394。成功获得caspase-7 mRNA的表达载体PC7及含有核酶的重组质粒PU6Rz333和pU6Rz394,通过体外转录表达出含有caspase7mRNA的987nt的靶mRNA及完整的核酶Rz333(47nt)和Rz394(50nt)。体外切割实验证实Rz333能够定点切割caspase-7mRNA,产生243nt和744nt的切割产物,切割效率为67．98％。Rz394不能切割靶基因。结论 核酶Rz333能够位点特异性的切割caspase-7 mRNA。     

抗Caspase-12核酶的制备与体外活性鉴定

目的 设计针对小鼠内质网应激凋亡途径中caspase-12mRNA的锤头状核酶(Rz138、Rz218)，通过靶基因及核酶的体外转录、切割，进行核酶活性鉴定，评估其应用前景。方法 小鼠Caspase-12基因的逆转录聚合酶链反应(RTPCR)扩增片段克隆于PGEMT载体的T7启动子下游，通过α-^32P UTP标记的体外转录物作为靶RNA。设计合成针对小鼠Caspase-12 mRNA的核酶，通过PCR方法扩增核酶的转录模板，采用非同位素标记法行体外转录，核酶与靶RNA进行体外切割实验。结果在37℃，Rz138、Rz218均有切割活性，Rz138的切割效率较高，几乎100％。结论 Rz138在体外具有良好的特异催化切割活性，它有望通过切割Caspase-12 mRNA而抑制内质网应激介导的细胞凋亡发生。     

特异性10-23脱氧核酶对肝癌相关基因IGF-ⅡmRNA的体外切割作用

目的 体外观察10-23脱氧核酶(DRz)对肝癌相关基因-胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ) mRNA的切割活性.方法 用RT-PCR方法扩增出IGF-Ⅱ基因的cDNA 片段,然后定向克隆到质粒PGEM-3Z T7 启动子的下游,获得重组质粒PGEM-3Z-IGF-Ⅱ,用限制性核酸内切酶HindⅢ将重组质粒线性化后,在体外转录出IGF-Ⅱ基因的mRNA片段,作为DRz切割的底物.结果 在无细胞系只观察到DRz1具有切割靶mRNA的作用,DRz2,DRz3和ASODN均未显示出切割活性.结论 筛选出的活性DRz1可进一步的用于细胞内实验.     

肝内胆管癌hTR反义RNA及锤头状核酶基因真核表达载体的构建

用反转录PCR法 ,调取肝内胆管癌细胞内的端粒酶RNA(hTR)基因 ,并针对其序列设计反义RNA封闭基因及锤头状核酶切割基因序列 ,将其构建入真核表达载体pTriEx 4内。根据hTRcDNA序列设计引物 ,经RT PCR法从体外培养的肝内胆管癌细胞内调取hTR模板区基因 ,根据其测序结果 ,合成反义RNA基因及核酶基因 ,与经相应酶切的真核表达载体连接 ,酶切鉴定重组体的正确性。经RT PCR从细胞内调出 68bp序列 ,与hTRcDNA比较 ,与模板区域碱基序列一致 ,反义RNA与核酶基因重组子经酶切鉴定序列正确。肝内胆管癌细胞内端粒酶的活性明显增高 ,RT PCR法可调出其hTR基因有效片段 ;成功构建了针对hTR模板区的反义RNA基因和核酶基因的真核表达载体     

U1 snRNA嵌合体核酶的抗丙型肝炎病毒作用

目的鉴定特异性抗丙型肝炎病毒(HCV)核酶与具有细胞核靶向性的U1 snRNA组成的嵌合体在体外切割HCV RNA的活性。方法通过聚合酶链反应及克降的力。法用HCV特异性核酶(Rz)序列戢代质粒pBSIISK U1(含有人类野生型U1 snRNA基因全序)中U1 snRNA第三个茎环结构，重组质粒命名为pBSIISK (U1-Rz)。再将pBSIlSK (U1-Rz)中核酶与U1 snRNA组成的嵌合体基因止向充隆于pGEM-T载体T7启动子的下游，重组质丰立命名为pGFM(U1-Rz)。质粒pGEM-(U1-Rz)和pGEM Rz[含有与pGEM(U1-Rz)相同的核酶序列]体外转录后，转录产物与靶RNAs在一定条件下进行切割反应，电泳后放射自显影。结果U1 snRNA嵌合体核酶构建成功。嵌合体核酶与核酶对靶RNAs均有切割活性，且二者的切割活性相似。随着时间的延长和工具酶体积比的增加切割效率增加。结论特异性抗HCV核酶与U1嵌合体在体外具有良好的持异性催化切割活性。     

犬贾第虫病毒转染载体介导的绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内的表达

目的 构建犬贾第虫病毒（Giardia canis virus，GCV）转染载体。 方法 根据GCV基因组（DQ238861）的转录起始位点、复制起始位点及包装位点的序列特征和表达外源基因的顺式作用元件，将绿色荧光蛋白（GFP）基因替换GCV基因部分编码区，构建GCV基因与 GFP基因的嵌合体，并置T7启动子之下。用T7 RNA聚合酶体外转录后经电穿孔转染犬贾第虫滋养体，并用荧光显微镜检测GFP表达情况，间接ELISA测定转染后GFP的表达量。 结果 构建了犬贾第虫病毒重组质粒pGCV634/GFP/GCV2174, 经SacⅠ和NotⅠ双酶切得到约2.0和3.5 kb两条带，与预计值相符。由其介导的绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内得到了高效表达，其表达量在转染后第1天达高峰(A₄₉₀=1.8)；以后随时间的延长而逐渐下降，14 d后绿色荧光信号基本消失。 结论 成功构建了犬贾第虫病毒转染载体，为贾第虫细胞基因表达调控的研究提供了方法。     

HBV特异性核酶与HDV重组体的体外转录及切割活性研究

目的利用基因重组技术,用核酶基因置换HDV部分基因,分别用HBV特异性核酶(rRZ)和核酶-HDV重组体(rHDVRZA、rHDVRZB和rHDVRZC)研究体外转录与剪切HBV的活性。方法 将含有83lbp的HBV C基因片段的质粒pTA-HBV用BamHI消化成线性后,体外转录获取5’端32P标记靶HBV C RNA。将获得的3个核酶-HBV重组体rHDVRZA、rHDVRZB和rHDVRZC克隆于pGEM-T载体T7启动子下游进行非标记的大量转录。分别将rRZ、rHDVRZA、rHDVRZB和rHDVRZC与卫32P-HBV C RNA按一定比例和条件保温切割。结果 体外实验证明rRZ、rHDVRZA、rHDVRZB和rHDVRZC在37℃具有酶切活性。提示所设计的核酶-HDV重组体rHDVRZA和rHDVRZB中核酶结构正确。结论在HDV基因组不同位置插入核酶,能够维持酶正确结构的核酶-HDV具有体外特异性切割HBV的活性。     

犬贾第虫病毒感染性体外转录体制备及转染试验

目的研究犬贾第虫病毒全长cDNA体外RNA转录体的感染性，为进一步研究犬贾第虫病毒的特性、深入阐明病毒的致病机理奠定基础。方法根据已知的GCV（长春株）基因序列设计一套特异性重叠引物，利用RT—PCR技术，构建感染性犬贾第虫病毒基因组全长cDNA；用T7RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System制备体外转录体，电穿孔方法感染无病毒株犬贾第虫滋养体，通过提取总核酸和超薄切片电镜观察感染情况。结果成功构建犬贾第虫病毒基因组全长cDNA，体外转录体电穿孔后72h，提取的总核酸中发现6．2kb的dsRNA带，电镜观察到完整的病毒粒子。结论该转录体具有感染性，可以在无病毒株犬贾第虫滋养体内复制表达，为进一步研究GCV奠定基础。     

锤头状核酶对肝癌突变基因p53的抑制作用

目的 探讨p53核酶对肝癌细胞突变型抑癌基因p53的抑制作用。方法 应用计算机设计并合成针对突变型p53(249位密码子AGG→AGT)的锤头状核酶RZ，构建其体外转录和真核表达载体，检测核酶对突变型p53(mtp53)的体外切割作用，并在Lipofect AMINE^TM2000的介导下转染肝癌细胞MHCC97，应用逆转录聚合酶联反应(RT—PCR)检测核酶对肝癌细胞突变型p53的抑制作用。结果 测序证实核酶基因被正确克隆人体外转录载体pBSKU6和真核载体pEGFPC1中。体外切割效率为42％，而野生型p53(wtp53)没有被切割。在Lipofect AMINETM2000的介导下成功转染肝癌细胞MHCC97，RT—PCR检测证实突变型p53的mRNA水平明显下降，细胞内的切割效率为69％。结论 p53核酶可成功抑制肝癌细胞中突变型p53的表达，为肝癌的基因治疗提供了一个新的选择。     

Overcoming multi-drug resistance by anti-MDR1 ribozyme

AIM: To reverse multidrug resistance (MDR) of HepG2 by anti-MDR1 hammerhead ribozyme. METHODS: We developed an anti-MDR1 hammerhead ribozyme and delivered it to P-gp-overproducing human hepatocarcinoma cell line HepG2 by a retroviral vector containing RNA polymerase III promoter. We detected the expression of mdr1/Pgp and Rz in HepG2, HepG2 multidrug-resistant cell line and HepG2 Rz-transfected cells by real-time RT-PCR, semi-quantitative RT-PCR and Western blot methods. Moreover, MTT assay was tested to detect sensitivity of these ribozyme-transfected cells, and Rhodamine123 (Rh123) applied to test the function of Pgp. RESULTS: The Rz- transfected HepG2 cells became doxorubicin-sensitive, concomitant with the decreases in MDR1 expression, P-gp amounts and efflux pump function. CONCLUSION: The approaches using either retrovirus or liposome-mediated transfer of anti-MDR1 ribozyme may be selectively applicable to the treatment of MDR cells.