蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶特异性锤头状核酶-GCV重组载体的构建

目的构建蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)特异性锤头状核酶-犬贾第虫病毒(Giardia canis virus,GCV)重组载体。方法采用RNAdraw软件分析贾第虫编码丙酮酸激酶的基因序列,并设计特异性反义锤头状核酶(PKH)序列,将其与犬贾第虫病毒(GCV)连接,构建重组载体pGCV-PKH。将重组载体线性化体外转录产物,分别进行贾第虫细胞外、细胞内目的mRNA切割实验,采用荧光显微镜观察转染后24h的各组虫体。采用实时PCR对切割产物进行相对定量分析。结果构建了载有蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶特异性锤头状核酶的犬贾第虫病毒重组载体pGCV-PKH。细胞内切割实验结果表明,荧光显微镜下只有pGCV-GFP转染组虫体显示绿色荧光,pGCV-PKH转染组丙酮酸激酶mRNA的相对含量约为正常对照组的33.14%。细胞外切割实验结果表明,该组载体能在细胞外有效切割丙酮酸激酶mRNA,在设定条件下,其切割效率为58.5%。结论重组载体pGCV-PKH能有效转染蓝氏贾第鞭毛虫细胞,并能在其细胞内外对丙酮酸激酶mRNA进行有效切割。     

特异性锤头状核酶对蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶mRNA的表达抑制

目的应用特异性锤头状核酶技术研究蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶(pyruvate kinase)mRNA的表达抑制。方法用电击转染的方法将含有针对贾第虫丙酮酸激酶mRNA的核酶pGCV-PKH载体导入蓝氏贾第鞭毛虫滋养体细胞内(A组),同时设单纯电击转染滋养体(B组)和正常培养滋养体(C组)为对照。转染后24、48、72和96h收集各组虫体,计算滋养体浓度,绘制虫体生长曲线。提取虫体总RNA,分别采用RT-PCR和实时PCR方法检测转染后各组各时间段(24、48、72和96h)核酶mRNA和丙酮酸激酶mRNA相对含量的变化,用紫外分光光度法检测丙酮酸激酶活性。结果虫体生长曲线显示,转染96h,A组虫体的生长受到明显抑制。RT-PCR检测结果表明,A组在转染后24h即可在贾第虫滋养体细胞内检测到核酶RNA,其水平可持续至转染后96h。A组在电击转染后24和48h,丙酮酸激酶mRNA的表达量分别下降至C组的5%(5.00±0.17)和8%(8.00±0.19),相应的酶活性下降至C组的32%(32.00±0.64)和38%(38.00±0.65)。结论特异性锤头状核酶显著抑制了蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶mRNA的表达。     

犬贾第虫病毒转染载体介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体切割效果的研究

目的 检测犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对犬贾第虫滋养体核仁功能性蛋白KRR1基因体外转录体切割效率。 方法 将两端携带反义KRR1基因的锤头状核酶(ribozyme, R酶)插入犬贾第虫病毒（Giardia canis virus, GCV）转染载体中, 构建两个核酶嵌合型犬贾第虫病毒载体： 短反义序列, 上游及下游均为21个碱基, 形成重组质粒KRzS； 长反义序列, 上游为288个碱基, 下游为507个碱基, 形成重组质粒KRzL。 另设两种阴性对照, 即重组质粒TRzL(即R酶两端含虫体反义磷酸丙糖异构酶基因, 上游为324个碱基, 下游为380个碱基)和重组质粒PKR(即犬贾第虫病毒转染载体中仅有KRR1 基因的反义片段而无R酶功能区)。应用荧光实时定量RT?鄄PCR法检测嵌合型锤头状核酶体外对KRR1 基因mRNA切割活性。 结果 KRzS、 KRzL转录体对KRR1 基因体外转录RNA切割效率分别达到74.0%和81.1%。而PKR对KRR1 mRNA反转录的影响较小, RT-PCR效率仅降低12.0%。TRzL对KRR1 mRNA反转录几乎无影响。 结论 犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体能进行有效切割, 为以后的体内锤头状核酶对KRR1基因表达抑制试验提供依据。     

犬贾第虫病毒转染载体介导的绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内的表达

目的 构建犬贾第虫病毒（Giardia canis virus，GCV）转染载体。 方法 根据GCV基因组（DQ238861）的转录起始位点、复制起始位点及包装位点的序列特征和表达外源基因的顺式作用元件，将绿色荧光蛋白（GFP）基因替换GCV基因部分编码区，构建GCV基因与 GFP基因的嵌合体，并置T7启动子之下。用T7 RNA聚合酶体外转录后经电穿孔转染犬贾第虫滋养体，并用荧光显微镜检测GFP表达情况，间接ELISA测定转染后GFP的表达量。 结果 构建了犬贾第虫病毒重组质粒pGCV634/GFP/GCV2174, 经SacⅠ和NotⅠ双酶切得到约2.0和3.5 kb两条带，与预计值相符。由其介导的绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内得到了高效表达，其表达量在转染后第1天达高峰(A₄₉₀=1.8)；以后随时间的延长而逐渐下降，14 d后绿色荧光信号基本消失。 结论 成功构建了犬贾第虫病毒转染载体，为贾第虫细胞基因表达调控的研究提供了方法。     

蓝氏贾第鞭毛虫α-19贾第素的单克隆抗体制备与亚细胞定位研究

目的 制备蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)α-19贾第素的特异性抗体,并通过免疫荧光对该贾第素的亚细胞定位进行鉴定。方法 经PCR获得α-19贾第素编码区片段,双酶切将目的 片段连入原核表达载体pET-28a(+)-α-19,重组载体转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE及 Western blot验证表达情况;采用设计的合成抗原肽免疫小鼠经细胞融合和筛选制备特异性单克隆抗体,分别用贾第虫滋养体裂解物和α-19贾第素重组蛋白Western blot验证抗体特异性和结合力,选择特异性最好的单克隆抗体通过免疫荧光技术对α-19贾第素的亚细胞定位进行观察。结果 成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-α-19,经SDS-PAGE及 Westernblot分析显示重组载体在大肠杆菌中表达出相对分子量约49 kD的重组蛋白,与理论值相符;Western blot显示单克隆杂交瘤细胞株α-19-3-7-3-5分泌的抗体结合力和特异性俱佳,可用于定位研究;免疫荧光定位结果表明α-19贾第素主要位于贾第虫滋养体的腹鞭毛。结论 制备了α-19贾第素的特异性单克隆抗体,免疫荧光显示α-19贾第素定位于贾第虫滋养体的腹鞭毛。     

蓝氏贾第鞭毛虫α-4贾第素的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化蓝氏贾第鞭毛虫的α-4贾第素蛋白。方法经RT—PCR获得a-4贾第素基因片段,经双酶切连入原核表达载体pET-28a（＋）,构建成为重组表达载体pET-28a（＋）-α-4,并转化大肠杆菌Rosetta（DE3）。IPTG诱导后,收集菌体,裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测,并用Ni—NTA亲和层析柱纯化融合蛋白。结果成功构建了原核表达载体pET-28a（＋）-α-4,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白以包涵体形式存在;SDS-PAGE及Western blot分析显示,在相对分子量约34kD的位置出现目的蛋白条带,与理论值相符;经Ni—NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的重组的α-4贾第素融合蛋白。结论成功克隆、表达并纯化了α-4贾第素蛋白,为α-4贾第素的细胞定位及功能研究提供了必要条件。     

蓝氏贾第鞭毛虫特异性细胞骨架蛋白——贾第素研究进展

蓝氏贾第鞭毛虫具有由微管、微丝和骨架蛋白构成的高度发达的细胞骨架系统.近年来,贾第虫的细胞骨架与其致病力的密切关系已经得到证实.在参与细胞骨架构成的众多蛋白质中,特异性细胞骨架蛋白——贾第素是其中重要的成分之一.对贾第素的研究不仅可为贾第虫细胞骨架的研究增添新的知识和研究资料,还可为贾第虫病的致病机制及抗贾第虫药物靶点的选择提供实验依据.     

C2株蓝氏贾第鞭毛虫组蛋白H2B基因的克隆与同源性分析

目的 获取C2株蓝氏贾第鞭毛虫H2B组蛋白基因序列,与WB株蓝氏贾第鞭毛虫及其他物种进行同源分析。方法 PCR扩增获取H2B组蛋白基因,连接pGM-T载体,转化E. coli DH5α感受态宿主细胞,挑选阳性克隆并进行序列分析,与美国WB株蓝氏贾第鞭毛虫及模式生物H2B组蛋白基因和蛋白序列进行同源分析。结果 测序C2株蓝氏贾第鞭毛虫H2B组蛋白基因序列,同源比对结果显示其基因序列与美国WB株完全一致,进化树分析表明贾第虫H2B组蛋白基因在进化过程中与其他物种分化较早。结论 蓝氏贾第鞭毛虫H2B组蛋白基因同源分析结果显示贾第虫与其他现存真核生物亲缘关系较为疏远,为进一步研究蓝氏贾第鞭毛虫的生物进化地位提供有价值的资料。     

蓝氏贾第鞭毛虫基因快速标记载体的构建

目的构建可快速标记蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)基因的重组载体。方法采用重叠PCR法将新霉素(Neo)基因置于gdh启动子调控下,并插入pGEM-5zf载体,获得带有Neo筛选标记的重组载体pGL gdh-Neo;并将基因合成所得3′末端带有3×HA标签的多克隆位点区克隆至重组载体pGL gdh-Neo,构建可快速标记贾第虫基因的重组载体pGLMCS-3HA-gdh-Neo。以该载体标记贾第虫H2A基因验证其可用性。PCR扩增组蛋白H2A基因序列,用EcoRⅠ和SpeⅠ双酶切后克隆至重组载体pGL MCS-3HA-gdh-Neo多克隆位点区。重组质粒线性化后转染虫体,并对G418筛选所获得的H2A贾第虫重组株进行基因组PCR、蛋白质印迹(Western blotting)和免疫荧光分析。结果构建了带有多克隆位点区和3×HA标签的可快速标记贾第虫基因的重组载体pGL MCS-3HA-gdh-Neo,其长度为4 260 bp;H2A重组质粒稳定转染至贾第虫滋养体并正确整合至其基因组,可表达相对分子质量(Mr)为16 900的H2A(含3×HA标签)。结论构建了可快速标记贾第虫基因的重组载体pGL MCS-3HA-gdh-Neo。     

α-11贾第素相互作用蛋白鉴定与验证

目的 鉴定并验证α-11贾第素的相互作用蛋白，为其功能研究提供实验依据。方法 构建C2株蓝氏贾第鞭毛虫酵母双杂交cDNA文库和α-11贾第素诱饵质粒，通过酵母双杂交筛选出可能与α-11贾第素相互作用的蛋白。将α-11贾第素和筛选出的可能互作蛋白基因分别构建入pBiFc-Vc-155、pBiFc-Vn-173质粒，共转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231，通过双分子荧光互补(bimolecular fluorescent complementation,BiFC)实验验证两种蛋白的相互作用。结果 构建了库容为2.715×10⁷细菌菌落总数(CFU)的蓝氏贾第鞭毛虫酵母双杂交cDNA文库和含有α-11贾第素基因的无自激活活性的诱饵质粒。通过酵母双杂交两轮阳性筛选，共筛选出6个可能与α-11贾第素相互作用的蛋白，分别为真核翻译起始因子5A(eukaryotic translation initiation factor 5A,EIF5A)、钙调蛋白激酶(calmodulin-dependent protein kinase,CAMKL)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸特异性谷氨...     

State of knowledge of helminth fauna of freshwater fishes of Poland

A total 89 fish and lamprey species has been recorded from Polish freshwater habitats. Twenty-seven of them (30.3%) have not been surveyed for parasitic helminthes. Some of the latter fishes are either rare or not easily accessible. Other live only in specific habitats in scattered localities. An important obstacle for studying parasite faunas of some fishes may be their status on an endangered species. Among the non-surveyed fishes, are those which have been relatively recently introduced to Poland or migrated there on their own. The present paper attempts to review all hitherto not studied helminthologically fish species, their habitats, localities and current protection status.