糖基化终末产物对破骨细胞骨吸收功能的影响

目的　观察糖基化终末产物 (AGEs)对破骨细胞骨吸收功能的影响。方法　用人血清白蛋白和葡萄糖恒温孵育制备人AGEs,采用甲苯胺蓝染色和图像分析评价AGE对破骨细胞形成骨吸收陷窝的影响。结果　低浓度AGEs(50～ 2 0 0 μg/ml)对骨吸收陷窝的面积和数目无明显影响 ;只有高浓度AGEs(50 0～ 1 0 0 0 μg/ml)才能促进骨吸收陷窝面积的扩大和数目增加 (P <0 .0 5)。结论　AGE可能促进破骨细胞的骨吸收功能     

降钙素对体外培养破骨细胞功能的影响

目的　观察降钙素对体外培养破骨细胞功能以及成骨细胞的骨保护素 (OPG)、细胞核因子 κB受体活化因子配基 (RANKL)的表达的影响。方法　分别用酶消化法和机械分离获得新生SD大鼠成骨细胞、破骨细胞 ,在培养液中分别加入不同浓度的降钙素 ,以抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)染色观察破骨细胞数目、形态 ,Image ProPlus图像软件分析骨片上骨吸收陷窝的数目和面积。用RT PCR方法观察成骨细胞OPG、RANKL的表达。结果　各组破骨细胞数目随着降钙素浓度增加而减少 (P <0 .0 5 )。骨片培养5天 ,吸收陷窝计数的结果显示 ,10 -14 mol/L以上浓度降钙素对破骨细胞吸收功能均有明显抑制作用 ,并呈剂量相关性。 10 -12 mol/L组陷窝面积为对照组的 49% (P <0 .0 1) ,10 -8mol/L组为对照组的 3 0 % (P <0 .0 1)。降钙素组破骨细胞OPGmRNA表达较对照组升高 ,RANKL降低 (均P <0 .0 5 )。结论　除了直接作用于破骨细胞外 ,降钙素还通过影响成骨细胞上OPG、RANKL的分泌间接调控破骨细胞功能 ,抑制骨吸收。     

葡萄糖对大鼠骨髓破骨细胞骨吸收功能的影响

目的 观察葡萄糖对大鼠骨髓破骨细胞骨吸收功能的影响,探讨糖尿病骨质疏松的发病机制.方法 用巨噬细胞集落刺激因子、RANKL诱导大鼠骨髓单个核细胞分化为破骨细胞,同时给予不同浓度的葡萄糖(0、5.5、15、25 mmol/L)干预,通过观察骨吸收陷窝数量和面积比及破骨细胞膜表面整合索αvβ3(CD61)表达水平分析葡萄糖对破骨细胞骨吸收功能的影响.结果 (1)高糖(25 mmoL/L)组培养7 d骨吸收陷窝数量和面积比与其他3组相比明显增多(P＜0.05或P＜0.01).(2)高糖组破骨细胞膜表面CD61表达量及平均荧光强度3 d时与其他3组相比均明显上调(P＜0.05或P＜0.01);5、7 d时与对照组(0 mmol/L)相比明显上调(P＜0.05).结论 高糖可增强破骨细胞的骨吸收功能,这可能是糖尿病骨质疏松的发病机制之一.     

雌激素对体外培养破骨细胞功能的影响

目的　探讨雌激素对体外培养破骨细胞功能的影响。　方法　利用酶动力学法测定培养基中酸性磷酸酶 (ACP)和抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)活性 ;共聚焦显微镜观察破骨细胞内氢离子随雌激素浓度的变化情况 ;LeicaQuantimet 5 0 0图像分析系统对骨吸收陷窝进行图像分析 ;扫描电镜观察骨吸收陷窝变化。　结果　随着雌激素浓度的升高 ,处理组与对照组ACP和TRAP的活性分别从(1 6 9± 0 13)U/L和 (1 6 0± 0 14)U/L降低到 (1 16± 0 31)U/L和 (0 93± 0 34)U/L(均为P <0 0 1) ,骨吸收陷窝的数目与面积从 (13 2 5± 1 5 2 )个 /片和 (4 82 2 7± 2 2 5 2 3) μm2 减少到 (4 6 8± 0 2 4)个 /片与(35 6 35± 145 41) μm2 ,处理组与对照组比较差异具有显著性意义 (P <0 0 1)。破骨细胞相对荧光值经过短暂的下降后持续上升 ,在第 12 0 0s时达到最高值。　结论　雌激素能够抑制氢离子释放 ,同时能改变ACP和TRAP活性 ,因而能直接抑制破骨细胞的骨吸收功能。     

IGF-Ⅰ对破骨细胞骨吸收的促进作用依赖于成骨细胞的协同

目的 探讨胰岛素样生长因子Ⅰ (IGF-Ⅰ)对破骨细胞骨吸收的促进作用是否需要成骨细胞的协同.方法 体外培养MC3T3小鼠成骨细胞及NF-κB受体的配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)诱导分化成熟的破骨细胞,分别给予重组人胰岛素样生长因子Ⅰ(rhIGF-Ⅰ)进行干预,Western印迹检测IGF-Ⅰ受体的活化情况.以0、10 ng/ml的rhIGF-Ⅰ直接干预破骨细胞或与成骨细胞在Transwell双层培养板中共培养的破骨细胞,MTT法测定破骨细胞增殖;流式细胞仪检测破骨细胞凋亡率;实时PCR检测组织蛋白酶K基因的表达.将不同方式干预的破骨细胞接种在骨磨片上,光镜观察骨吸收陷窝的形成.结果 在成骨细胞、破骨细胞表面均检测到可被IGF-Ⅰ激活的IGF-Ⅰ受体.仅在成骨细胞、破骨细胞共培养时rhIGF-Ⅰ能够促进破骨细胞活细胞的增殖(P＜0.05);抑制破骨细胞的凋亡(P＜0.05);上调组织蛋白酶K基因的表达(P＜0.05);增加骨吸收陷窝的数量及面积.IGF-Ⅰ对单独培养的破骨细胞则作用不明显.结论 IGF-Ⅰ对破骨细胞骨吸收的促进作用需要成骨细胞的协同.     

骨片吸收陷窝光镜计数法定量测定破骨细胞功能

目的检测体外培养破骨细胞(OC)的骨吸收功能。方法应用改良的Fenton等人的方法，接种大鼠OC于骨片上培养，不同时间取骨片超声去除细胞后，甲苯胺蓝染色．光学显微镜下可见骨吸收陷窝呈多种形态蓝紫色异染，并根据骨片上陷窝的数目定量OC的骨吸收能力。结果经与扫描电镜观察结果比较，证明该骨吸收陷窝计数法衡量体外培养破骨细胞(OC)的骨吸收能力，可靠简便快速。结论应用此方法可表明益钙宁（eCT)对OC骨吸收功能有明显抑制作用。     

Light诱导类风湿关节炎滑膜细胞向破骨细胞转化

目的 观察Light在类风湿关节炎(RA)滑膜细胞向破骨细胞转化过程中的作用.方法 取8例RA患者滑膜组织,胶原酶消化获取滑膜细胞,每例滑膜细胞分成5份培养,第1组加入巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)作阴性对照,第2组加入MCSF和LIGHT,第3组加入MCSF和核因子(NF)-κB受体激动剂配体(RANKL),第4组加入MCSF、LIGHT和RANKL,第5组加入LIGHT.体外培养2周后,行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,F肌动蛋白(F-actin)染色以及象牙片上骨吸收陷窝观察破骨细胞的形成和活性.结果 第1组和第5组TRAP(-),F-actin(-),象牙片上无骨吸收陷窝形成;第2组TRAP(+),F-actin(+),骨陷窝形成(+),多核破骨细胞呈圆形和椭圆形,体积较小,骨陷窝分散,体积较小;第3组TRAP(++).F-actin(++),骨陷窝形成(++),多核破骨细胞体积大,骨陷窝较多,体积大,形态不规则;第4组TRAP(+++),F-actin(+++),骨陷窝形成(++++),多核破骨细胞更多,骨陷窝大且有融合趋势.结论 Light能诱导RA滑膜细胞向破骨细胞转化,并能促进RANKL诱导滑膜细胞向破骨细胞转化的能力.     

类风湿关节炎滑膜细胞向破骨细胞分化实验研究

目的观察类风湿关节炎(RA)滑膜组织中破骨细胞来源以及核因子κB受体活化子配体(RANKL)在诱导破骨细胞分化过程中的作用。方法取6例RA和6名正常关节的滑膜组织,用胶原酶消化法获得滑膜细胞,通过免疫磁珠法分选获得CD68+/-滑膜细胞。用外源性RANKL16μg/L、巨细胞集落刺激因子(M-CSF)25μg/L及地塞米松醋酸酯1×10-8mol/L诱导各组滑膜细胞分化。通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、降钙素受体(CTR)免疫荧光检测、骨吸收陷窝形成方法鉴定破骨细胞。并在RA滑膜CD68+细胞中加入0~8ng/ml梯度浓度的RANKL,观察不同浓度RANKL对RA滑膜CD68+细胞分化的影响。结果RA滑膜CD68+细胞在RANKL诱导14d后,RA滑膜CD68+细胞组出现CTR阳性、TRAP染色阳性细胞并有骨吸收陷窝形成。RA滑膜CD68+细胞在体外经RANKL诱导后分化形成的破骨细胞功能与RANKL剂量有关。结论RA滑膜组织中前体破骨细胞来源于滑膜CD68+细胞,在体外RANKL诱导下可以分化为成熟破骨细胞。RANKL体外诱导剂量影响RA滑膜CD68+细胞分化功能。     

蛇床子素对NFATc1基因表达及破骨细胞分化的影响

目的研究蛇床子素(osthole,OST)对破骨细胞形成和骨吸收的影响,并初步分析其分子机制。方法体外构建破骨细胞诱导培养体系,通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)法、骨吸收陷窝扫描电镜观察鉴定成熟破骨细胞,采用CCK-8 (cell counting kit-8)法筛选无细胞毒性的药物浓度组,使用细胞骨架荧光染色法观察OST对其形态的影响。使用骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色进行面积定量分析,并统计吖啶橙荧光染色后凋亡破骨细胞的比例,采用荧光定量PCR法测定OST对NFATc1等相关破骨基因表达的影响。结果体外成功构建破骨细胞培养体系,通过CCK-8法筛选出10-6、10-5mol/L两组药物浓度。OST可使破骨细胞肌动蛋白环变细,伪足和褶皱区消失。OST 0、10-6、10-5mol/L组TRAP染色阳性数目分别为104. 6±4. 5、80. 4±3. 7、58. 2±3. 1,融合指数分别为(44. 3±3. 3)%、(20. 3±0. 9)%、(12. 6±0. 6)%,各浓度组组间比较,差异均有统计学意义(P0. 05);该3组诱导的破骨细胞产生的骨陷窝数目为41. 67±1. 16、34. 01±2. 65、26. 33±4. 16,骨陷窝面积(μm2/片)分别为1 445 942. 0±164 150. 0、904 080. 8±47 346. 0、641 049. 1±1 993. 0,各浓度组组间比较,差异均有统计学意义(P0. 05);该三组破骨细胞凋亡率分别为:26. 3%、30. 1%、37. 2%,OST组凋亡率较对照组明显升高,且差异有统计学意义(P0. 05),但两浓度组之间差异无统计学意义(P 0. 05)。RANKL诱导后NFATc1、CTSK、MMP-9、TRAP、INTE-BETA3、C-SRC的mRNA表达量分别为空白组的2. 147±0. 246、30. 5±1. 643、43. 54±2. 908、9. 116±0. 392、6. 664±0. 395、4. 131±0. 408倍,与空白组相比表达量均明显升高,差异具有统计学意义(P0. 01);OST干预后,各组表达量均受到明显抑制,OST组表达量与RANKL对照组相比差异也均具有统计学意义(P0. 05)。除了NFATc1外,两浓度组组间比较,差异均有统计学意义(P 0. 05)。结论 OST可以通过调控NFATc1等破骨基因表达抑制破骨细胞的分化。     

氟铝及联合作用对体外培养大鼠破骨细胞数量及骨吸收功能的影响

目的 观察单纯氟、铝及氟铝联合作用对体外培养大鼠破骨细胞功能的影响,探讨其作用机制.方法 机械分离法作用于新生SD大鼠四肢长骨,于TC199培养液(含10％胎牛血清)中获得破骨细胞和骨髓基质细胞,将破骨细胞接种于96孔培养板和象牙薄切片培养,骨髓基质细胞接种于6孔培养板培养.2h后换液并染毒(氟化钠和氯化铝),分为对照组(氟化钠和氯化铝浓度均为0 mol/L)、氟组(氟化钠1.0×10-4 mol/L)、铝组(氯化铝1.0×10-5 mol/L)和氟铝联合组(氟化钠1.0×10-4 mol/L,氯化铝1.0×10-5 mol/L).培养5d后,对培养板中破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,光镜下检查破骨细胞数目;象牙薄切片经1％甲苯胺蓝染色,光镜下分析破骨细胞骨吸收陷窝面积.骨髓基质细胞染毒培养8h后提取总RNA,实时荧光PCR法测定骨保护素(OPG)和细胞核因子κβ受体活化因子配体(RANKL)的表达量水平.结果 ①氟、铝、氟和铝的交互作用对破骨细胞数量均有影响(F值分别为7.15、6.56、7.98,P均＜0.05),氟组、铝组及氟铝联合组破骨细胞数量[(136.9±22.99)、(135.4±23.5)、(163.0±24.4)个/孔]均高于对照组[(92.5±22.1)个/孔,P均＜0.05],氟铝联合组高于氟组和铝组(P均＜0.05).②氟组、铝组及氟铝联合组对破骨细胞骨吸收陷窝面积均有影响(F值分别为10.47、12.64、14.29,P均＜0.05),氟组、铝组及氟铝联合组骨吸收陷窝面积[(0.242±0.031)、(0.293±0.026)、(0.333±0.016)mm2/片]均高于对照组[(0.088±0.030)mm2/片,P均＜0.05],氟铝联合组高于氟组和铝组(P均＜ 0.05).③氟、铝、氟和铝的交互作用对RANKL/OPG mRNA表达量的比值均有影响(F值分别为8.15、15.38、23.59,P均＜0.05),氟组、铝组、氟铝联合组[(193.98±137.93)％、(326.11±176.78)％、(599.84±275.82)％]均高于对照组[(100.00±56.02)％,P均＜0.05],氟铝联合组高于氟组和铝组(P均＜0.05).结论 氟、铝均可引起体外培养破骨细胞数量增多,促进其分化、增强骨吸收活性,该作用可能与其上调RANKL/OPG mRNA表达量比值有关.同时,氟铝联合作用对破骨细胞活性的刺激有叠加效果.