PrLZ基因3′-UTR区荧光素酶报告基因载体的构建及活性检测

目的分析前列腺亮氨酸拉链(PrLZ)基因3′非编码区(3′-UTR)可能的微小RNA(miRNA)调控位点,构建PrLZ基因3′-UTR荧光素酶报告载体,为研究PrLZ基因转录后的miRNA调控提供有效的工具。方法使用PCR方法从PrLZ阳性的C4-2细胞中扩增含PrLZ基因3′-UTR区序列,插入到T-Vector载体上,提高PCR产物的连接、克隆效率,通过Xbal和BamHI限制性内切酶双酶切后将其连入经相同内切酶双酶切后的荧光素酶报告基因载体pLUC中,构建pLUC-PrLZ 3′-UTR载体,使用生物信息学方法预测PrLZ基因3′-UTR可能是miR-34a的作用靶点,使用慢病毒载体构建对照载体(质粒名称-NC)和过表达miR-34a(质粒名称-miR-34a),包装成病毒颗粒后分别感染293-T细胞,然后通过X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂将pLUC空质粒和pLUC-PrLZ 3′-UTR重组质粒分别转染293-T细胞,Promega试剂盒测定荧光素酶的活性。结果得到含PrLZ基因3′-UTR序列的荧光素酶报告重组质粒,并用凝胶电泳和基因测序的方法验证了其序列的正确性。在miR-34a高表达组的293-T细胞中,重组质粒组荧光素酶活性比空质粒组低40%,差异具有统计学意义(P0.05)。结论成功构建PrLZ基因3′-UTR荧光素酶报告载体,miR-34a可以显著降低荧光素酶的活性,PrLZ基因3′-UTR上可能有miR-34a的调控作用靶点。     

PAK1基因3′-UTR区荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的针对人p21小GTP酶活化激酶1(p21-activated kinase-1,PAK1)基因的3′端非翻译区(3′-untranslated region,3′-UTR)构建PAK1的荧光素酶报告基因载体,并对其进行鉴定和筛选,为后续PAK1与microRNA-145(miR-145)的功能和机制研究提供实验基础。方法用PCR法扩增出PAK1基因3′-UTR片段,经连接、酶切插入到pGL3载体上,构建了PAK1 3′-UTR荧光素酶报告基因载体。通过生物信息学方法预测miR-145可能靶向作用于PAK1基因的3′-UTR,后将上述重组质粒以及miRNA mimics(miRNA模拟物)、miRNA-Con(miRNA control,miRNA阴性对照)瞬转到膀胱癌T24和J82细胞系中,并检测其相对荧光素酶活性。另外,利用实时定量PCR法检测不同实验组中PAK1的表达情况。结果成功构建了重组pGL3-PAK1 3′-UTR WT质粒,并通过双酶切以及测序的方法验证所得结果的正确性。且转染pGL3-PAK1 3′-UTR WT质粒后,T24/miR-145组和J82/miR-145的相对荧光素酶活性显著低于T24/miR-con和J82/miR-con组,差异有统计学意义(P0.05)。另外,通过实时定量PCR法发现,miR-145mimics组的PAK1表达水平显著低于miR-145con组。结论成功构建了PAK1基因3-UTR区荧光素酶报告载体,且miR-145能够显著降低其荧光素酶活性,提示miR-145能靶向负调控PAK1的表达。     

Speedy A蛋白调控相关miRNA的筛选及miR-23b靶标的验证

目的筛选和鉴定调控Speedy A蛋白表达的miRNAs。方法通过在线数据库TargetScan、miRNA和miRwalk预测与Speedy A相互作用的miRNAs,并结合本实验室前期建立的精原细胞和精母细胞小RNA数据库,筛选出评分较高的候选miRNAs。实时定量PCR检测小鼠7、14、21、35、64d睾丸中候选miRNAs和Speedy A基因的表达,筛选出表达趋势呈显著负相关的miRNAs。构建野生型Speedy A基因3’端非翻译区荧光素酶报告基因载体(WT-Speedy A-3’UTR)及miR-23b靶序列突变型载体(mut-Speedy A-3’UTR),分四组转染HEK-293T细胞株:野生型实验组,WT-Speedy A-3’UTR质粒+miR-23bmimic;野生型对照组,WT-Speedy A-3’UTR质粒+miR-23b mimic NC;突变型实验组,mut-Speedy A-3’UTR质粒+miR-23bmimic;突变型对照组:mut-Speedy A-3’UTR质粒+miR-23bmimic NC,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果通过生物信息学方法结合本实验室前期建立的精原细胞和精母细胞小RNA数据库筛选出4个评分较高的miRNA:miR-23b、miR-143、miR-345-3p和miR-881。实时荧光定量PCR检测不同发育时期小鼠睾丸中以上4种miRNAs和Speedy A基因的表达水平,结果显示在不同发育时期的小鼠睾丸中,miR-23b的表达趋势与Speedy A呈显著负相关(P0.01)。成功构建了重组野生型/突变型(WT/mut)Speedy A3’-UTR载体,通过双荧光素酶报告基因检测显示野生型实验组相比对照组吸光值明显降低,差异有统计学意义(P0.01)。结论野生型实验组对其它3组对照组荧光活性有明显的抑制作用,证实miR-23b能够靶向调控Speedy A基因的表达。     

MiR-17/RB通路调节血管平滑肌细胞增殖

目的探索miR-17在血管平滑肌细胞(VSMCs)中对视网膜母细胞瘤(RB)基因和蛋白水平的调控作用,以及对增殖效应的影响。方法培养HA-VSMCs并诱导其增殖,应用芯片技术筛选出差异表达水平最显著的微小RNA(miR)。在293T细胞应用荧光素酶报告基因验证生物信息学软件预测的miR-17与RB的靶向结合作用。分别向VSMC转染miR-17 mimic和miR-17 inhibitor并建立阴性对照,检测RB水平及细胞增殖相关指标PCNA表达水平。结果荧光素酶报告分析证实miR-17与RB mRNA-3’UTR具有靶向结合效应。转染miR-17 mimic促进VSMC增殖相关指标PCNA表达上调,并且可以下调RB蛋白及mRNA水平,转染miR-17 inhibitor后下调PCNA表达且可上调RB表达(P0.05)。结论miR-17通过靶向结合RB mRNA-3’UTR调控RB表达从而调控VSMCs增殖。     

miR-26a-5p/环腺苷酸反应元件结合蛋白1分子轴调控脂肪来源干细胞成骨分化的机制研究

目的 探讨miR-26a-5p通过调控环腺苷酸反应元件结合蛋白1(cAMP response element binding protein 1,CREB1)对脂肪来源干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）成骨分化的调控作用及其作用机制。方法 取4只3～4周龄雌性C57BL/6小鼠脂肪组织，采用消化分离法分离培养细胞并传代。经细胞形态学观察以及流式细胞仪检测鉴定其为ADSCs后，取第3代细胞行成骨分化诱导。于诱导培养0、3、7、14 d行茜素红染色观察细胞钙沉积，ALP活性检测，实时荧光定量PCR检测miR-26a-5p和CREB1 mRNA表达，Western blot检测CREB1蛋白及其磷酸化（phospho-CREB1,p-CREB1）水平以及p-CREB1/CREB1。经starBase数据库预测miR-26a-5p和CREB1存在靶向结合位点后，取HEK-293T细胞行双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系（以培养48 h后荧光素酶活性表示）。最后将miR-26a-p inhibitor（实验组）及对应阴性对照（对照组...     

微RNA-129-5p靶向Fas相关死亡功能域蛋白基因对体外培养人椎间盘髓核细胞凋亡的影响

目的研究微RNA-129-5p(miR-129-5p)靶向Fas相关死亡功能域蛋白(FADD)基因对人椎间盘髓核细胞(hNPC)凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法运用脂质体法将miR-219-5p抑制子转染至hNPC中抑制miR-219-5p表达,将pcDNA-FADD转染至hNPC中使FADD过表达,将miR-219-5p抑制子和FADD siRNA共转染至hNPC中抑制miR-219-5p和FADD表达。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测抑制miR-219-5p表达后hNPC细胞中FADD、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Bcl-2和Bax蛋白表达量。通过Targetscan软件预测miR-129-5p和FADD靶向结合位点,采用双荧光素酶报告基因实验检测二者的靶向关系。结果抑制miR-219-5p、过表达FADD均可明显促进hNPC凋亡。Targetscan软件预测发现FADD 3′-UTR上存在miR-219-5p的结合位点,双荧光素酶报告基因实验证实miR-129-5p和FADD具有靶向结合关系。抑制miR-219-5p的表达后,hNPC中FADD表达上调,同时促凋亡蛋白Caspase-3表达上调,抑凋亡蛋白Bcl-2表达下调。抑制FADD可逆转miR-219-5p低表达对hNPC凋亡的促进作用。结论低表达miR-219-5p可促进hNPC凋亡,其机制可能与miR-129-5p靶向FADD有关。     

miR-148-5p靶向H型血管调控因子Slit3的实验研究

目的 观察绝经后骨质疏松症中H型血管调控因子Slit3表达差异,进一步探讨其上游靶向调控miRNAs。方法 雌性SD大鼠随机分假手术组和模型组,Real-time PCR和免疫组化检测骨组织Slit3 mRNA和蛋白表达水平;生物信息学预测可能与Slit3-3’UTR互作的miRNAs,构建野生型和突变型Slit3-3’UTR重组荧光素酶报告载体,和miRNAs表达载体共转染293T细胞,双荧光素酶报告基因测定荧光素酶活性验证miRNA对Slit3-3’UTR的靶向作用。结果 与假手术组相比,模型组Slit3 mRNA表达水平略上调和平均光密度显著上调,生物信息学预测Slit3-3’UTR与miR-148a-5p、miR-148b-5p、miR-410-3p、miR-129-5p和miR-374-5p存在碱基结合位点,野生型Slit3-3’UTR共转染miR-148b-5p荧光活性下调至空白对照组的68.91%,突变型Slit3-3’UTR共转染miR-148b-5p荧光活性未见下调。结论 Slit3可能是绝经后骨质疏松症H型血管的调控基因,miR-148b-5p与Slit3-3’UTR的靶向结合直接调控Slit3的表达水平。     

MiR-134通过靶向调节KRAS抑制786-0肾透明细胞癌细胞上皮间质转化过程

目的探索miR-134在肾癌组织中的表达并研究其对肾透明细胞癌细胞786-0上皮间质转化的影响。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-134在20对肾癌组织和786-0细胞中的表达情况;miR-134模拟物转染786-0后,划痕实验和Transwell实验分别检测肾癌细胞迁移和侵袭能力的改变情况,Western blot检测细胞中靶蛋白KRAS及其相关信号通路蛋白表达情况;双荧光素酶报告基因检测miR-134与KRAS 3′-UTR结合情况。结果 MiR-134在20对肾癌组织和786-0细胞中明显低表达(P0.01);miR-134模拟物转染后能够抑制肿瘤细胞侵袭(P0.01)和迁移的能力(P0.05),显著降低肿瘤细胞中KRAS蛋白的水平(P0.05)并抑制RAS/MAPK/ERK通路中关键蛋白p-ERK的表达(P0.05);双荧光素酶报告基因显示miR-134能与KRAS 3′-UTR结合,显著降低荧光值(P0.05)。结论 MiR-134在肾透明细胞癌中显著低表达,能通过靶向抑制KRAS表达调控下游RAS/MAPK/ERK通路活性,阻滞786-0细胞上皮间质转化过程,抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。     

下调微小RNA-19a对胶质瘤细胞侵袭能力的影响及机制

目的 探讨下调微小RNA(miR)-19a的表达对人脑胶质瘤细胞株U87侵袭能力的影响及其机制.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测转染miR-19a抑制物的效率.转染后48 h,采用Western blot法检测U87细胞中多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)的表达,并通过Transwell实验检测U87细胞的侵袭能力.构建报告质粒,于转染后72 h用荧光素酶报告实验验证miR-19a和LRIG1的相互作用.结果 FQ-PCR结果显示转染miR-19a抑制物后,U87中miR-19a的表达量较对照组降低了(78.2±5.1)％,差异有统计学意义(P＜0.01).转染miR-19a抑制物后,U87穿膜细胞数较对照组明显减少,分别为(25.9±3.9)个和(85.3±6.1)个(P＜0.01).荧光素酶报告实验结果显示,下调miR-19a后野生型报告质粒的荧光素酶活性较对照组升高(4.89±0.26)倍(P＜0.01),而突变型质粒的荧光素酶活性较对照组无明显变化.Transwell实验结果表明在下调miR-19a后,LRIG1沉默组的穿膜细胞数较对照组明显增加,分别为(47.8±3.1)个和(22.7±4.2)个(P＜0.05).结论 下调miR-19a可以抑制U87细胞的侵袭力,其机制可能是上调LRIG1的表达.     

微小核糖核酸miR-613通过下调E2F5的表达抑制前列腺癌细胞增殖

目的研究微小核糖核酸miR-613在前列腺癌组织及细胞系中的表达及其对前列腺癌细胞增殖的影响。方法实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测前列腺癌组织及细胞系中miR-613的表达情况,并检测各组细胞中E2F5mRNA的表达情况;蛋白质印迹法检测E2F5蛋白的表达;通过细胞增殖实验检测过表达miR-613后细胞的增殖能力;集落形成实验检测单个细胞克隆增殖情况;双荧光素酶报告实验验证miR-613和E2F5是否靶向结合。结果 qPCR结果显示,miR-613在前列腺癌组织和细胞系均显示低表达。与Control组相比,转染miR-613组PC3和LnCap细胞中E2F5蛋白表达水平降低,细胞增殖明显受抑制。而在过表达E2F5后,PC3和LnCap细胞增殖又明显回升,可逆转miR-613的调节作用。双荧光素酶报告实验结果表明,miR-613能够直接靶向E2F5 3′-UTR。结论 miR-613能够通过下调E2F5转录因子的表达而抑制前列腺癌细胞增殖。     

miR-184靶向AGO2调控AKT/mTOR信号通路对膀胱癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

目的 研究miR-184在膀胱癌发生、发展过程中的作用及其相关机制。方法 收集2015年1月至2017年1月南阳市中心医院87例膀胱癌患者的手术切除标本,采用qRT-PCR检测膀胱癌及癌旁组织中miR-184的表达;通过生物信息学方法预测miR-184的靶基因并采用双荧光素酶实验及免疫荧光进行验证。在人膀胱癌细胞系T24中转染miR-184过表达质粒,MTT、Transwell侵袭和划痕实验检测细胞增殖、侵袭和迁移能力,Western blot检测AKT/mTOR通路蛋白的表达。结果 miR-184在膀胱癌组织中的相对表达水平1.238±0.026明显低于癌旁组织2.601±0.054,差异有统计学意义(t=22.57,P0.01);且其表达水平与膀胱癌患者的TNM分期(t=-5.61,P0.001)、淋巴结转移(t=-2.35,P=0.011)及组织学分级存在明显相关(t=2.171,P=0.033)。生物信息学预测及双荧光素酶报告基因实验证实miR-184能直接靶向结合AGO2基因3′-UTR。体外实验结果表明,转染miR-184模拟物后,膀胱癌细胞T24中AGO2mRNA和蛋白的表达水平明显下调,细胞增殖、迁移及侵袭能力降低,p-mTOR、p-AKT蛋白表达降低(P0.05)。结论 miR-184在膀胱癌组织中低表达,上调miR-184表达可抑制细胞的增殖、侵袭和迁移能力,其作用机制可能与AKT/mTOR信号通路的调节有关。     

SP1被鉴定为miR-122-5p的一个转录因子

目的:miR-122-5p跟精子发生相关,本研究主要是探究miR-122-5p在睾丸内的转录因子。方法:采用生物信息学方法预测到miR-122-5p启动子的可能转录因子为SP1和GATA4,然后分别构建双荧光素酶pGL3-miR-122-5p promoter载体、pcDNA3.1(+)-SP1表达载体和pcDNA3.1(+)-GATA4表达载体,再将pcDNA-SP1+pGL3-basic混合质粒和pcDNA-SP1+pGL3-miR-122-5p promoter混合质粒,以及pcDNA-GATA4+pGL3-basic混合质粒和pcDNA-GATA4+pGL3-miR-122-5p promoter混合质粒分别转入293T细胞,最后用双荧光素酶检测系统检测酶活性。结果:pcDNA3.1+pGL3-miR-122 promoter组的荧光值为0.0362±0.0004,显著高于pcDNA3.1+pGL3-basic组(P<0.05),表明已成功构建小鼠miR-122-5p启动子荧光素酶报告质粒。pcDNA-SP1+pGL3-miR-122-5p promoter组荧光值显著高于pcDNA-SP1+pGL3-basic(P<0.05),结果提示转录因子SP1能够促进miR-122的转录。pcDNA-GATA4+pGL3-basic混合质粒转染组的荧光值与pcDNA-GATA4+pGL3-miR-122-5p promoter混合质粒转染组之间差异不显著,表明GATA4不能增加miR-122-5p转录能力。结论:转录因子SP1能够促进miR-122-5p的转录,GATA4对miR-122-5p没有转录增强能力。     

microRNA-449a靶向Notch1抑制膀胱癌细胞J82的迁移

【摘要】〓目的〓研究microRNA-449a(miR-449a)对膀胱癌细胞J82迁移能力的影响以及对靶基因Notch1表达的影响。方法〓通过mimics转染膀胱癌细胞株J82使其过表达miR-449a,利用Transwell实验、细胞划痕实验观察细胞迁移能力的变化;采用实时定量PCR和蛋白印迹检测细胞Notch1表达水平的变化,并通过荧光素酶实验验证miR-449a与Notch1基因的直接调控关系。结果〓与对照组相比,转染miR-449a组的J82细胞的迁移能力减弱。过表达miR-449a后,J82细胞Notch1的mRNA表达无明显变化(P=0.5739),但Notch1蛋白表达下调(P=0.0135)。荧光素酶报告基因实验显示,miR-449a能明显抑制Notch1-3’UTR的荧光素酶活性(P=0.0016)。结论〓过表达miR-449a可能通过靶向降低Notch1基因的蛋白表达,抑制膀胱癌细胞的迁移。     

miR-200a靶向β-catenin对膀胱癌的上皮-间质转换影响的研究

目的:探讨miR-200a靶向β-catenin对膀胱癌细胞上皮-间质转换(EMT)的影响。方法:TOP/FOP闪光荧光素酶法鉴定miR-200a对β-catenin信号依赖性;使用荧光素酶法测定miR-200a对β-catenin编码基因CTNNB1的3'非翻译区(3'-UTR)的靶向作用;划痕试验和Transwell检测miR-200a对膀胱癌细胞5637的细胞活力、转移和侵袭影响。Western blotting确定miR-200a对Wnt/β-catenin信号下游分子的效应。结果:miR-200a可直接与β-catenin编码基因CTNNB1的3'UTR相互作用,并抑制β-catenin的表达。miR-200a抑制了5637细胞的活力、转移和侵袭。结论:miR-200a通过靶向β-catenin抑制了膀胱癌细胞5637的生物学功能。     

miR-124通过靶向调控PKM2基因的表达抑制前列腺癌PC3细胞的增殖

目的:探讨miR-124抑制前列腺癌PC3细胞增殖活性的机制。方法:利用荧光素酶报告基因验证miR-124能否靶向作用于丙酮酸激酶M2型(PKM2)3'端非编码区(UTR)。将miR-124 mimic转染至PC3细胞后,采用实时荧光定量PCR和Western印迹检测前列腺癌PC3细胞PKM2 mRNA和蛋白的表达水平,MTT法检测miR-124 mimic与PKM2 siRNA对PC3细胞生长活性的影响。结果:与人前列腺上皮细胞RWPE-1比较,PC3细胞中PKM2 mRNA和蛋白水平表达分别上调(5.12±0.35)倍和(4.05±0.20)倍(P0.05)。荧光素酶报告基因结果证实,PKM2是miR-124调控的靶基因,miR-124可特异性地结合于PKM2 mRNA的3'-UTR。转染miR-124 mimic 24 h后,PKM2蛋白水平下调至阴性对照组(0.16±0.04)倍(P0.05),但对PKM2 mRNA表达无显著影响(P0.05)。MTT结果显示,转染miR-124 mimic和PKM2 siRNA都能显著抑制PC3细胞的增殖,但miR-124 mimic对PC3细胞生长活性的抑制能力较PKM2 siRNA强。转染miR-124 mimic和PKM2 siRNA 24 h和48 h后,PC3细胞的增殖率分别为(66.20±5.10)%和(82.10±6.35)%(P0.05)、(49.34±2.37)%和(70.10±5.80)%(P0.05)。结论:miR-124可通过靶向调控PKM2基因的表达而抑制前列腺癌PC3细胞的增殖。     

微RNA-23a通过缝隙连接蛋白43对颈椎后纵韧带细胞骨向分化的作用机制

目的 探讨微RNA（miR）-23a通过缝隙连接蛋白43（Cx43）对颈椎后纵韧带细胞骨向分化的作用及相关机制。方法 选取本院收治的50例间断型颈椎后纵韧带骨化症（OPLL）患者（OPLL组）、50例颈椎外伤非OPLL患者（对照A组）和50例颈椎病非OPLL患者（对照B组）颈椎后纵韧带组织，培养后纵韧带细胞，实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测3组细胞miR-23a、Cx43 mRNA的表达，采用Western blotingt检测Cx43蛋白的表达。取OPLL组对数期后纵韧带细胞，分别转染miR-23a agomir质粒（miR-23a过表达组）、miR-23a antagomir质粒（miR-23a低表达组）、agomir NC质粒（转染对照组），未经处理的后纵韧带细胞为空白组。采用双荧光素酶实验验证miR-23a与Cx43的靶向关系；采用碱性磷酸酶（ALP）染色检测矿化情况；采用Western blotingt检测p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）、细胞外信号调节激酶（ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的蛋白表达。结果 与对照A、B组比较，OPLL组miR-23a表达降低，Cx43 mRNA及蛋白表达升高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。与空白组、转染对照组比较，miR-23a过表达组miR-23a表达量升高、Cx43 mRNA表达量降低，miR-23a低表达组miR-23a表达量降低、Cx43 mRNA表达量升高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。双荧光素酶实验显示，miR-23a可有效抑制野生型质粒荧光素酶活性；与空白组、转染对照组比较，miR-23a过表达组矿化面积百分比、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表达、p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达降低，miR-23a低表达组矿化面积百分比、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表达、p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达升高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论OPLL病理条件下，颈椎后纵韧带细胞中miR-23a异常低表达，通过靶向上调Cx43激活MAPK信号通路，促进成骨分化。     

miR-124抑制结肠癌细胞增殖和侵袭与TET蛋白家族的关系

目的:探讨miR-124是否通过靶向调节TET蛋白家族的表达而抑制结肠癌细胞增殖与侵袭。方法:用双荧光素酶报告基因检测系统分别检测miR-124对TET家族(TET1、TET2、TET3)的3'UTR-荧光素酶活性的影响;用q RT-PCR与Western blot检测miR-124模拟物转染结肠癌HT29细胞后TET家族的m RNA与蛋白表达水平的变化;用MTS和Transwell实验观察HT29细胞转染miR-124模拟物及TET si RNA后增殖和侵袭能力的变化。结果:双荧光素酶报告基因检测结果显示,各TET m RNA的3'UTR均被miR-124特异性结合,其荧光素酶活性被明显抑制(均P0.05);转染miR-124模拟物后的HT29细胞TET的m RNA与蛋白表达水平明显减低(均P0.05);HT29细胞转染miR-124模拟物或TET si RNA后,增殖和侵袭能力均明显降低(均P0.05)。结论:miR-124可能通过直接靶向调控TET基因的表达,而抑制结肠癌细胞增殖和侵袭。     

miR-124-3p靶向Axin1 调控糖尿病骨质疏松成骨的研究

目的 研究miR-124-3p靶向Axin1 调控糖尿病骨质疏松症大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells ，BMSCs）成骨分化的作用。方法 20只糖尿病大鼠模型-SPF级SD雌性大鼠分为分组对照组10例、实验组10例，经过药物注射，测血生化指标，测骨密度。BMSCs培养，流式细胞学鉴定。检测对照组和实验组miR-124-3p mRNA的表达。过表达miR-124-3p（模拟物）7、14、21 d，检测ALP、茜素红染色成骨能力。第7天检测miR-124-3p mRNA表达水平。实验组细胞用miR-124-3p模拟物转染，分为高糖组和低糖组，检测中Axin1 mRNA水平。构建载体，与模拟物共转染，荧光素酶报告基因检测miR-124-3p和Axin1靶向结合。将实验组BMSCs分为高糖组和低糖组，检测实验组BMSCs高糖组及低糖组miR-124-3p、Runx2 mRNA的表达及茜素红染色和ALP染色结果。检测实验组模拟物在高糖组及低糖组miR-124-3p、Runx2 mRNA的表达及茜素红染色和ALP染色结果。结果 ELISA检测血生化指标，实验组TG、TC、FPG、HbA1C值上调，β-CTX和SOST上调，OC和骨密度下调。BMSCs培养，流式细胞学鉴定显示CD73和CD105的表达为阳性， CD34 和 CD45 的表达呈阴性。符合间充质干细胞的抗原特点，证实为BMSCs。实验组miR-124-3p表达明显低于对照组。过表达miR-124-3p（模拟物）7、14、21 d，ALP、茜素红染色随时间逐渐升高。第7天miR-124-3p表达水平显著升高。实验组细胞用miR-124-3p模拟物转染，结果高糖组Axin1 mRNA表达水平上调，但用miR-124-3p模拟物转染时水平下降。荧光素酶报告基因检测miR-124-3p和Axin1可以靶向结合。RT-qPCR检测实验组BMSCs高糖摄入显著降低了miR-124-3p、Runx2表达；高糖可抑制成骨分化，减少钙沉积，减少ALP表达。高血糖条件下miR-124-3p过表达（模拟物）中Runx2的表达显示，高糖+对照明显低于低糖+对照组；高糖+miR-124-3p模拟物明显高于高糖+对照组。茜素红染色和ALP染色显示，高糖+对照明显低于低糖+对照组；高糖+miR-124-3p模拟物明显高于高糖+对照组。结论 miR-124-3p能通过靶向抑制Axin1促进糖尿病骨质疏松症大鼠BMSC的成骨发生。     

miR-21在肾癌细胞中抗凋亡的机制研究

目的 探讨miR-21对肾癌细胞中抗凋亡的机制。方法 人类肾癌细胞株Caki-1和OS-RC-2 细胞,分别以As-miR-21转染沉默miR-21,转染无关乱码寡核苷酸序列作阴性对照,以及不转染寡核苷酸的作空白对照,以AnnexinV FITC凋亡检测试剂盒检测凋亡,用Caspase-Glo 3/7试剂测半胱天冬酶3/7活性,用Western Blot 分析测定FASL和TIMP3的表达,用荧光素酶报告实验测定miR-21与FASL和TIMP3的结合,将PGL3-WT-TIMP3-3’UTR质粒中miR-21 结合位点“AUAAGCU”剪切后用Lipofectamine 2000转染至细胞测定As-miR-21对细胞凋亡的影响。结果 转染AS-miR-21的细胞凋亡率相对于阴性和空白对照细胞显著增加（P<0.05）。转染AS-miR-21后48h,Caki-1细胞中半胱天冬酶3/7活性显著增加（P<0.05）。转染PGL3-WT-FASL-3’UTR 和PGL3-WT-TIMP3-3’UTR质粒的Caki-1和OS-RC-2细胞中沉默miR-21荧光素酶活性显著增加,而转染去除miR-21结合位点的PGL3-MUT-FASL-3’UTR 和PGL3-MUT-TIMP3-3’UTR质粒的细胞荧光素酶活性不变。将缺乏3’-UTR的TIMP3质粒转染Caki-1和OS-RC-2细胞,再转染miR-21,TIMP3表达不受影响。而细胞过表达TIMP3则凋亡增加,但转染缺乏3’-UTR的TIMP3可以拮抗miR-21导致的抗凋亡作用。结论 miR-21通过FASL和TIMP3多条途径增加肾癌细胞的抗凋亡力。     

miR-135b靶向GSK3B抑制地塞米松诱导成骨细胞凋亡

目的探究miR-135b靶向糖原合成酶激酶3B(glycogen synthase kinase 3B,GSK3B)对地塞米松诱导的成骨细胞(MC3T3-E1)凋亡的影响。方法 CCK8检测地塞米松对MC3T3-E1细胞活力的影响,筛选最适地塞米松浓度进行后续实验。流式细胞术检测细胞凋亡,RT-qPCR检测miR-135b和GSK3B表达,荧光素酶报告实验验证miR-135b和GSK3B靶向作用关系。细胞实验分为对照组(Control)、地塞米松组(Dex)、阴性对照mimics组(mimics NC)、miR-135b组、miR-135b+糖原合成酶激酶3B组(miR-135b+pc-GSK3B)。蛋白印迹检测蛋白表达。结果与对照组比较,Dex组细胞凋亡增加,并且miR-135b表达下降,GSK3B表达升高,荧光素酶报告实验显示,miR-135b和GSK3B存在靶向作用关系。与Dex组比较,miR-135b组细胞凋亡减少,同时GSK3B、Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平下降,Bcl-2蛋白水平升高,与miR-135b组比较,miR-135b+pc-GSK3B组细胞凋亡增加,同时GSK3B、Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低。结论 miR-135b可通过靶向作用于GSK3B,抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡,这一作用与其对Bax/Bcl-2表达和caspase-3/9活化的调控有关。