噬菌体表达短肽模拟血吸虫致弱尾蚴特异性抗原表位的研究

目的　从噬菌体随机肽库中筛选模拟血吸虫致弱尾蚴特异性抗原表位的噬菌体克隆 ,并探讨其免疫保护效果。方法　用紫外线致弱尾蚴免疫兔血清IgG筛选以融合蛋白形式在丝状噬菌体外壳蛋白Ⅲ表达的随机 7肽库 ,三轮免疫筛选后获得的噬菌体克隆经皮下免疫小鼠 3次 ,攻击感染 45d后剖杀 ,观察减虫和减卵效果。结果　经三轮筛选 ,特异性结合的噬菌体富集增加了 10 0多倍 ,随机挑取 2 4个噬菌体克隆经ELISA测定 ,有 2 2个克隆能与致弱尾蚴免疫兔血清IgG特异性反应。混合噬菌体克隆免疫小鼠试验的减虫率与减卵率分别为 33.5 7%和 5 6 .0 7% (P均 <0 .0 0 1)。结论　采用噬菌体随机肽库技术可获得模拟致弱尾蚴特异性抗原表位的短肽分子 ,这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫     

日本血吸虫（中国大陆株）线粒体相关蛋白对小鼠免疫保护性的初步研究

目的 研究日本血吸虫（中国大陆株）线粒体相关蛋白（rSj338/26GST)对小鼠的免疫保护性，预测其作为血吸虫疫苗候选分子的潜能。方法 将编码日本血吸虫线粒体相关蛋白的cDNA经PCR扩增后亚克隆人载体质粒pGEX-6p-1进行表达，并用表达的重组抗原的融合蛋白免疫BABL／c小鼠。结果 与对照组相比，rSj338/26GST重组蛋白免疫小鼠获得了32．3％的减虫率及46．5％肝总减卵率；与Sj26GST免疫组相比，rSj338抗原可能使小鼠获得22．5％的减虫率及30．0％的肝总 减卵率。结论 证明重组的日本血吸虫线粒体相关蛋白(rSj338/26GST及rSj338)可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力，可望成为新的疫苗候选分子。     

日本血吸虫雌虫抗原模拟表位的筛选及免疫保护性

目的　筛选日本血吸虫雌虫抗原的模拟表位 ,并探讨其抗日本血吸虫的免疫保护效果。　方法　用日本血吸虫雌虫免疫兔血清IgG作配体对噬菌体随机 12肽库进行 3轮亲和筛选 ,随机挑取 18个噬菌体克隆用Dot ELISA检测其特异性 ,并对其中的 4个阳性克隆进行测序。分别在 0、2、4周用混合噬菌体克隆免疫小鼠 3次 ,第 6周每鼠经腹部感染 40条日本血吸虫尾蚴 ,42d后剖杀冲虫 ,计数虫数和每克肝卵数。　结果　经 3轮筛选 ,特异性噬菌体富集了 2 0 0多倍 ,随机挑取的 18个克隆经Dot ELISA鉴定有 17个能与雌虫抗原免疫兔血清呈阳性反应。DNA自动测序的 4个序列与GenBank的已知序列均无同源性。与对照组相比 ,混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率为 2 6.5 7% ,减卵率为 65 .3 4%。　结论　采用噬菌体随机肽库技术可获得模拟日本血吸虫雌虫特异性抗原表位的短肽分子 ,这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫。     

日本血吸虫重组线粒体相关蛋白免疫学活性鉴定

分子筛进一步纯化并复性的融合蛋白均能刺激家兔产生特异性抗体 ,粗提包涵体蛋白免疫家兔 ,血清抗体滴度为 1∶2 5 6 0 0 ,复性蛋白及经分子筛纯化的蛋白免疫的家兔血清抗体滴度均为 1∶5 12 0 0 ,Westernblot结果显示 ,粗提包涵体蛋白、复性蛋白及经过分子筛进一步纯化并复性的蛋白均能被重感染兔血清和rSj338/2 6GST特异性免疫兔血清所识别。攻击实验中 ,粗提包涵体蛋白和经分子筛纯化的蛋白分别可诱导小鼠产生 2 7.8% (P <0 .0 1)和 30 .4 % (P <0 .0 1)的减虫率 ,4 0 .4 % (P <0 .0 1)和 4 3.5 % (P <0 .0 1)肝总减卵率。粗提包涵体蛋白中rSj338和经分子筛纯化的蛋白中rSj338分别可诱导小鼠产生 13.9% (P <0 .0 5 )和 2 0 .0 % (P <0 .0 5 )的减虫率 ,30 .0 % (P <0 .0 1)和 4 1.7% (P <0 .0 1)肝总减卵率。结论　获得的日本血吸虫线粒体相关的重组融合蛋白(rSj338/2 6GST)具有良好的免疫学活性 ,重组融合蛋白 (rSj338/2 6GST)及rSj338均可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力。     

重组白细胞介素-4增强日本血吸虫组织蛋白酶B核酸疫苗诱导小鼠的保护力

目的?摇探讨重组白细胞介素－4（IL-4）真核表达质粒增强日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗对小鼠的免疫保护效果。 方法 将小鼠IL-4 基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1以构建小鼠重组IL-4表达质粒， 并联合日本血吸虫组织蛋白酶B的表达质粒DNA (VR1012-Sj31)肌注免疫小鼠，设重组IL-4表达质粒、组织蛋白酶B表达质粒和2种空载体质粒对照组。免疫组化检测IL-4和组织蛋白酶B在小鼠肌细胞内的表达，末次免疫3周后攻击感染，用减虫率及减卵率表示保护力。 结果 重组IL-4和组织蛋白酶B DNA均在小鼠肌细胞表达，重组IL-4和组织蛋白酶B DNA联合免疫小鼠，产生43.2% 的减虫率和76.6% 的减卵率，与组织蛋白酶B DNA单独免疫相比差异有显著性（P<0.01，P<0.05 ）。 结论 重组IL-4 能提高日本血吸虫组织蛋白酶B 核酸疫苗的抗血吸虫保护力作用，具有佐剂的免疫效应。     

日本血吸虫31kDa组织蛋白酶B DNA疫苗保护性免疫效果观察

目的观察日本血吸虫31kDa组织蛋白酶BDNA疫苗(Sj31B1N)在小鼠体内的保护性免疫效果.方法用Sj31B1N和Sj31B1N+pUCDNA疫苗肌注免疫BALB/C小鼠,用空白质粒载体VR1012做对照,在0、4、8周共免疫3次,每次免疫前及末次免疫后4周从尾静脉采血收集血清,经ELISA法检测小鼠血清抗体升高时,用日本血吸虫尾蚴攻击感染小鼠.结果Sj31B1N和Sj31B1N+pUC减虫率分别为24.2%和22.0%;肝卵减少率分别为34.9%和39.5%,每雌肝卵减少率分别为30.4%和35.3%.结论小鼠接种Sj31B1N后对日本血吸虫感染有减虫、减卵作用及抗雌虫生殖的作用.加质粒佐剂pUC未见有增强免疫效果的作用.     

日本血吸虫(中国大陆株)基因工程疫苗的研究

本文报道应用PCR技术或RT－PCR技术从日本血吸虫成虫cDNA文库或成虫mRNA中扩增到Sj28GST、C－Sjparamyosin、H-Sj23、Sj14、Sj22．6和Sj．TPI6个编码日本血吸虫中国大陆株抗原的基因，并把它们克隆入适合载体中，在大肠杆菌系统和蚕核型多角体病毒（BmNPV）系统中进行表达．免疫学检测证明这6种基因重组抗原都具有较好的抗原性。我们进一步应用4种比较成熟的基因重组抗原Sj26GST、Sj28GST、C－Sj．paramyosin和H－Sj23进行3批绵羊试验和1批黄、水牛田间试验，评估这几种重组抗原在绵羊和黄、水牛中的免疫保护效果，rSj26GST和rSj28GST分别获得62．1％和50.4％－68.5％的显著保护；n－paramyosin获得42.9％－55．3％、r－C－paramyosin获得44．2％－47．1％的显著保护，r－H－Sj23为51．2％－66．1％的显著保护．各组免疫后的粪便虫卵数和组织虫卵数也有不同程度的减少．用r－C－Sjparamyosin、r－Sj28GST和r－H－Sj23免疫典、水牛在血吸虫重疫区田间试验的结果表明，减虫率水牛高于黄牛，显示上述试验的3种日本血吸虫重组分子抗原有希望成为家畜日本血吸虫病的候选疫苗抗原．     

抗日本血吸虫噬菌体抗体库的筛选和阳性克隆的鉴定

目的　研制抗日本血吸虫循环抗原SjMAg的单链抗体。　方法　用日本血吸虫成虫代谢抗原SjMAg包板,对已构建的抗日本血吸虫噬菌体抗体库进行3轮富集,然后用ELISA法从富集的次级抗体库中筛选阳性克隆,最后借助ELISA、SDSPAGE和Western印迹等方法,根据阳性克隆表达产物与其它4种吸虫抗原反应的情况,进行特异性鉴定。　结果　从随机挑取的72个克隆中筛选到阳性克隆6个,经交叉筛选和鉴定最终获得特异性抗日本血吸虫阳性克隆2个。　结论　用固相富集和ELISA筛选法可以从抗体库中有效地筛选到抗日本血吸虫循环抗原的阳性克隆,获得的抗体克隆可用于抗日本血吸虫循环抗原单链抗体的制备。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3DNA免疫保护作用的观察

目的　研究日本血吸虫 (中国大陆株 )重组信号蛋白 14 - 3- 3(rSj14 - 3- 3)DNA作为血吸虫病疫苗候选分子的潜能。方法　碱裂解法大量制备rSj14 - 3- 3和rSjGSTDNA ,将两种DNA分别免疫BALB/c小鼠进行攻击感染实验。 结果　在尾蚴攻击感染 6w后 ,剖杀小鼠计算各组的减虫率 ,rSj14 - 3- 3DNA组为 34 2 0 % ,rSj14 - 3- 3+rSjGSTDNA组为32 4 0 % ;减卵率为 (按以上组序 ) 5 0 74 %和 5 5 2 3%。结论　重组Sj14 - 3- 3DNA具有一定的抗血吸虫病潜能 ,有可能作为日本血吸虫病的候选疫苗 ,但未见Sj14 - 3- 3、SjGST两种重组DNA的协同作用。     

抗日本血吸虫14?3?3蛋白单克隆抗体5C6抗原识别表位的鉴定

目的 目的 采用噬菌体展示肽技术鉴定抗日本血吸虫14?3?3蛋白单克隆抗体5C6的抗原识别表位。 方法 方法 将纯化的抗日本血吸虫14?3?3蛋白单克隆抗体5C6作为固相配基筛选噬菌体随机展示12肽库, 按照吸附?洗脱?扩增的淘洗过程进行3轮生物淘洗, 富集特异性结合的噬菌体颗粒。随机挑取第3轮洗脱的独立噬菌体克隆, 分别依次进行噬菌体扩增、基因组DNA抽提和DNA序列分析。选择外源性插入DNA序列完全相同或高度相似的同源性噬菌体, 采用ELISA及免疫印迹分析对其免疫反应性作进一步鉴定, 以确定单克隆抗体5C6的抗原识别表位。 结果 结果 第3轮淘洗物中33个独立噬菌体克隆的DNA测序结果显示, 其中25个噬菌体编码外源性插入肽的核酸序列均为5′?CCACCTAGTAGCAGACCGATTCT? CAGTCGAAGGAAA?3′, 其对应的演绎氨基酸序列为PPSSRPILSRRK, 该肽与日本血吸虫信号蛋白14?3?3及自然界其他已知蛋白的氨基酸序列均无同源性。免疫印迹试验证实此短肽可被自然感染的日本血吸虫病人血清所识别, 而不与健康人血清反应。 结论 结论 本研究成功鉴定了抗日本血吸虫14?3?3蛋白单克隆抗体5C6所识别的模拟抗原表位, 并证明该表位为空间构像表位。     

日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定

目的为探索血吸虫病疫苗的新路径,对日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定.方法分析本室筛选日本血吸虫成虫cDNA文库获得的一cDNA片段(Sj338/24)的开读框序列,在其上下游分别设计引物A和B,并以该cDNA片段为模板进行PCR扩增后将该片段重组于pGEM-T中并进行DNA测序鉴定及检索.再经酶切后将该基因片段亚克隆入表达载体pGEX-6P-1,并进行蛋白表达、纯化及抗原性鉴定.结果该目的基因PCR产物全长共487bp,其开读框由459bp组成,编码153个氨基酸残基组成的多肽.DNA序列同源性分析发现,Sj338克隆基因与人及褐鼠的线粒体外膜蛋白的部分编码基因较高度同源.重组质料pPEX-6P-1/Sj338能高效融合表达,融合蛋白的分子量为43kDa.SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,重组蛋白rSj338具有良好的抗原性.结论·Sj338可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因,重组蛋白有望成为新的疫苗侯选分子.     

紫外线致弱童虫免疫家兔血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的　用致弱疫苗免疫血清、感染血清筛选文库获取新的日本血吸虫特异性未知抗原基因。　方法　用紫外线致弱童虫免疫兔血清、感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cD?鄄NA文库 ,对阳性重组子进行克隆、测序 ,利用软件对核酸序列进行分析 ,确定目的基因。　结果　筛选出 6种蛋白分子基因 :3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) ,丝氨酸蛋白酶抑制剂 (serpin) ,线粒体编码蛋白 ,肌球蛋白 (myosin)部分重链基因以及两个未知新基因。　结论　紫外线致弱疫苗免疫血清筛选cDNA文库为寻找新的抗血吸虫病疫苗提供了又一途径。     

日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定

[目的 ]探索研制血吸虫病疫苗的新路径 ,对日本血吸虫线粒体相关蛋白进行基因克隆及特性鉴定。[方法 ]分析本室筛选日本血吸虫成虫cDNA文库获得的 1个cDNA片段 (Sj338 2 4)的开读框序列 ,在其上下游分别设计引物A和B ,并以该cDNA片段为模板进行PCR扩增后 ,将该片段重组于pGEM T中并进行DNA测序鉴定及检索。再经酶切后将该基因片段亚克隆入表达载体pGEX 6P 1,并进行蛋白表达、纯化及抗原性鉴定。 [结果 ]该目的基因PCR产物全长共 487bp ,其开读框由 45 9bp组成 ,编码 15 3个氨基酸经残基组成的多肽。DNA序列同源性分析发现Sj338克隆基因与人及褐鼠的线粒体外膜蛋白的部分编码基因较高度同源。重组质粒pPEX 6P 1 Sj338能高效融合表达 ,理论蛋白的分子量为 17kDa。SDS PAGE和Westernblotting检测结果表明 ,重组蛋白rSj338具有良好的抗原性。 [结论 ]Sj338可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因 ,重组蛋白有望成为新的疫苗候选分子。     

日本血吸虫编码抱雌沟蛋白保守区cDNA核酸疫苗的研究

目的　为研究血吸虫性别特异性表达基因的核酸免疫特性。方法　本研究将所克隆的编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因保守区cDNA片段克隆到真核表达载体 pcDNA3中 ,得到的重组质粒直接免疫昆明系小鼠 ,感染血吸虫尾蚴 ,7周后剖杀小鼠冲虫 ,进行成虫和虫卵计数。结果　其减虫率为 32 4 % ,肝脏减卵率为 4 6 9% ,与对照组比较差异显著。结论　初步显示血吸虫抱雌沟蛋白基因DNA疫苗具有一定的核酸免疫保护功能     

Protective efficacy evaluation induced by recombinant protein LHD-Sj23-GST of Schistosoma japonicum emulsified with three different adjuvants

As a complement to chemotherapy and other control approaches, the development of an effective vaccine is necessary to combat Schistosomiasis japonica that remains a serious public health problem in China. In the present study, mice were vaccinated with purified recombinant protein LHD-Sj23-GST (large hydrophilic domain of 23 kDa antigen of S. japonicum fused with Sj26GST) emulsified with Freund's adjuvant (FA), Montanide ISA 206 and Montanide ISA 70 M and challenged with cercariae, the protective efficacy induced by the recombinant protein was evaluated, and the LHD-Sj23-GST-specific IgG and its subtypes were determined. The result revealed that a significant worm burden reduction (58.8%, 26.3% and 54.3%; P<0.05) was obtained in mice vaccinated with LHD-Sj23-GST emulsified with three different adjuvants compared to those mice treated with respective adjuvant only. ELISA test suggested that the high-level production of LHD-Sj23-GST-specific IgG1, IgG2a and IgG3 antibodies may participate in protecting against schistosome infection.     

日本血吸虫rSj338及膜蛋白rSj22.6抗原表位联合免疫对小鼠的保护性研究

目的 观察日本血吸虫（中国大陆株）的线粒体相关蛋白rSj338及膜蛋白rSj22.6有效抗原表位混合后对小鼠的免疫保护性，为将来复合疫苗的研制提供理论依据。方法 分别用特异性抗rSj338抗体和抗rSj22.6的抗体筛选噬菌体随机12肽库，将获得的rSj338的有效抗原表位与rSj22.6有效抗表位混合后免疫BALB／c小鼠，并与rSj338的有效抗原表位混合免疫组进行比较。结果 rSj338的4种表位和rSj22.6抗原的4种表位混合免疫组小鼠获得了45．4％（P＜0．01）的减虫率及59．1％（P＜0．01）肝总减卵率，rSj338的4种表位混合免疫组小鼠获得了34．2％（P＜0．01）的减虫率及46．8％（P＜0．01）肝总减卵率；rSj338 4种表位和rSj22.6的4种表位混合免疫组获得的减虫率和肝总减卵率均高于rSj338的4种表位混合免疫组，差异有显著性（P＜0．05）。结论 两种抗原分子的有效抗原表位联合免疫的效果优于单个抗原分子的有效抗原表位。     

日本血吸虫抗原模拟表位免疫学活性的初步研究

目的　研究从噬菌体 12肽库中筛选得到的日本血吸虫抗原模拟表位的免疫学活性。　方法　以日本血吸虫急感患者血清免疫球蛋白 (Ig)作为靶分子 ,筛选噬菌体 12肽库。经过 3轮吸附 -洗脱 -扩增的淘筛过程 ,在筛选得到的阳性噬菌斑中随机挑取 42个扩增 ,用ELISA检测不同寄生虫病患者和正常人血清 ,以分析其敏感性和特异性。并进一步免疫昆明株小鼠 ,经日本血吸虫尾蚴攻击感染后剖检 ,计算减虫率和减卵率 ,以分析其在小鼠体内诱导的免疫保护性。　结果　在挑取的 42个阳性克隆中 ,有 9个与日本血吸虫急感患者血清有不同程度的结合 (6.2 5 %～ 10 0 % )。除其中 1个灵敏性较低的克隆与其它寄生虫病患者血清有一定的交叉反应外 ,其余均未发现。而经其免疫后的小鼠也分别获得了 2 9.3 %减虫率和 3 5 .9%减卵率。　结论　从噬菌体 12肽库中筛选到的日本血吸虫抗原模拟表位具有较高的特异性和敏感性 ,并能够在小鼠体内诱导一定的免疫保护力。     

日本血吸虫Sj32DNA疫苗免疫效果的观察

目的：探讨血吸虫Ｓｊ３２ＤＮＡ疫苗抗血吸虫感染的免疫效果。方法：采用ＰＣＲ技术,人工合成引物,以重组ＤＮＡｐＳｊ３２为模板,扩增出编码３２ｋＤａ天冬酰胺肽链酶,即Ｓｊ３２全长ｃＤＮＡ和引入了起始密码子终止密码子的部分ｃＤＮＡ片段,将其分别克隆到ｐＫＢ－ＣＭＶ,构建真核表达载体ｐＢＫ－Ｓｊ３２－１和ｐＢＫ－Ｓｊ３２－２。采用脂质体介导的基因转移将两种重组ＤＮＡ导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞,间接免疫荧光法证实Ｓｊ３２在真核细胞中表达。小批量制备纯化ＤＮＡ,进行动物免疫试验。将两种构建的真核表达载体分别直接ｉｍＢＡＬＢ／ｃ小鼠,共免疫３次,攻击感染后６ｗｋ剖杀小鼠。收集血清,ＥＬＩＳＡ法检测抗体水平,并计数成虫负荷及肝组织虫卵数。结果：ｐＢＫ－Ｓｊ３２－１组与ｐＢＫ－Ｓｊ３２－２组免疫小鼠后的减虫率分别为３８．６％和３０．９％,肝组织减卵率分别为５５．７％和５５．２％,与对照组比较,其间差别均具有极显著性意义（Ｐ＜０．０１）。各ＤＮＡ疫苗免疫组能诱导一定水平的抗血吸虫抗体。结论：Ｓｊ３２ＤＮＡ疫苗可诱导小鼠产生一定程度的保护性免疫力,有可能作为血吸虫疫苗候选抗原分子。     

旋毛虫感染鼠血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 探讨旋毛虫与血吸虫之间交叉免疫的分子机制,并寻找有效的日本血吸虫疫苗侯选分子。方法 以旋毛虫感染鼠血清为探针,筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,对获得的阳性克隆插入片段进行PCR扩增。结果 共筛选出11个阳性克隆,其插入的cDNA片段大小在1．4－5．0kb之间,其中1．4kb片段2个,5．0kb片段9个。结论 获得的阳性在隆插入基因片段可能为编码旋毛虫与日本血吸虫共同的抗原基因,其表达产物可能有抗日本血吸虫感染的作用。     

日本血吸虫雄虫免疫血清对成虫cDNA文库的筛选及克隆分析

目的　筛选和分析日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新基因 ,为血吸虫疫苗研究提供新的候选分子。 方法　以日本血吸虫雄性成虫抗原免疫兔血清为探针 ,筛选Sj成虫cDNA文库 ,对阳性克隆的插入片段进行PCR鉴定及测序分析。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析 ,并预测新基因编码蛋白的结构与功能。结果　筛选获 11个阳性克隆 ,其插入SjcDNA片段大小在 0 7～ 2 3kb之间。对部分阳性克隆进行测序分析 ,获两个Sj新基因 ,即Sj-MA及Sj -Cp8(登录号分别为AF5 1980 8和AF5 2 4 896 ) ,分别编码 2 4 9和 71个氨基酸的核内蛋白和胞浆蛋白。Sj-MA蛋白含有 9个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个酪氨酸激酶磷酸化位点和 1个N -肉豆蔻酸化位点。Sj-Cp8蛋白含一个跨膜区、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个N -肉豆蔻酸化位点。结论　筛选Sj成虫cDNA文库所获得两个新基因 ,其编码的蛋白可能为存在于胞浆和胞核内的日本血吸虫的重要信息传递分子 ,有望成为新的血吸虫病疫苗候选分子。