建立永生化皮肤成纤维细胞的初步研究:pIRES2-EGFP-hTERT真核表达载体的构建

目的:构建同时含有荧光蛋白表达基因和端粒酶催化亚单位(hTERT)表达基因的真核质粒载体,为hTERTcDNA的稳定转染提供快速有效的鉴定手段,并为建立永生化的皮肤成纤维细胞,为皮肤试验提供稳定的细胞系奠定基础。方法:选取带有荧光蛋白表达基因的空载体和带有hTERTcDNA的载体,利用基因重组技术,获得新的载体pIRES2-EGFP-hTERT,筛选阳性克隆进行酶切和序列测定。结果:酶切电泳分析,获得了3.4kb和5.3kb大小的两条片段;测序结果两端序列正确。结论:重组载体pIRES2-EGFP-hTERT构建成功,为hTERTcDNA的稳定转染提供快速有效的鉴定手段,为建立永生化的皮肤成纤维细胞系奠定了基础。     

利用基因工程技术构建重组人血小板因子4真核表达载体

目的：构建携带绿色荧光蛋白标签的重组人血小板因子4基因(plateletfactor4，PF4)的真核表达载体，并在真核细胞中表达，为研究其生物学功能奠定基础。方法：人工合成PF4基因模板，通过PCR方法扩增PF4-cDNA，然后克隆至pUCl9克隆载体，经序列测定后重组入pIRES2-EGFP真核表达载体并进行酶切鉴定。将鉴定正确的质粒用脂质体转染法瞬式转染至COS7细胞中。结果：获得了PF4-cDNA基因，序列分析表明，该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明，PF4基因已与pIRES2-EGFP真核表达载体正确连接。荧光显微镜示，此载体成功转染至COS7细胞中。并获得有效表达。结论：利用基因工程技术，成功的构建了携带绿色荧光蛋白标签的PF4的真核表达载体，并在真核细胞中获得有效表达，为下一步研究其在真核细胞中的生物学功能奠定基础。     

构建永生化人肝细胞系人端粒酶反转录酶真核表达质粒

目的：构建人端粒酶反转录酶真核表达质粒，为人端粒酶反转录酶稳定转染细胞提供简单、快速的检测方法。方法：实验于2005—06／2006—03在解放军第三О二医院病毒研究室完成。①聚合酶链反应扩增人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白基因。②利用基因重组技术构建真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP—C1-hTERT，筛选阳性克隆进行双酶切、聚合酶链反应和序列测定。③转染HepG2细胞，荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白的表达情况。结果：①聚合酶链反应扩增目的基因：电泳显示人端粒酶反转录酶基因的聚合酶链反应产物在3．5kb处有特异性目的条带，绿色荧光蛋白基因的聚合酶链反应产物在750bp处显示特异性目的条带。②质粒VR1012-GFP—hTERT和pEGFP—C1-hTERT的构建和鉴定结果：双酶切、聚合酶链反应鉴定和测序结果与预期完全相符。③转染HepG2细胞结果：荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白主要分布在细胞核内。结论：①初步验证所构建的真核表达质粒VR1012-GFP—hTERT和pEGFP—C1-hTERT的正确性。两种质粒可使转染细胞同时表达人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白，通过观察绿色荧光蛋白的表达对转染效率和结果进行及时、快捷的观察。②重组真核表达质粒VR1012-GFP—hTERT和pEGFP—C1-hTERT的构建成功，为人端粒酶反转录酶转染细胞提供简洁、快速、实时的检测方法，并为建立永生化人肝细胞系奠定基础．     

构建真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3及其在脐血CD34^＋细胞中的表达

目的：构建真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3配体,为研究Flt3配体对急性放射复合伤造血功能恢复作用提供实验物质基础.方法：实验于2003-05/09在第三军医大学劳动卫生教研室完成.先用SalⅠ和BglⅡ双酶切pUMVC3-hFLT3配体,得到全长的人FLT3配体序列（0.8kb）,两端抹平后克隆至pIRES2-EGFP载体的BglⅡ位点.然后用NheⅠ和XhoⅠ酶切鉴定;最后用脂质体转染的方法将重组质粒转入脐血CD34^＋细胞中,经过G418筛选,在荧光显微镜下观察其表达.结果：①构建了双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-FLT3.②重组质粒pIRES2-EGFP-FLT3能在脐血CD34^＋细胞中的表达,凝胶电泳和测序结果证明将FLT3 cDNA亚克隆入pIRES2-EGFP内,荧光显微镜下可见脐血CD34^＋细胞胞体发出绿色荧光.③转染效率为10.3%.结论：①携带标记基因的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3能稳定地转入真核细胞表达载体.②该质粒转染到分离纯化的脐血CD34^＋细胞中,并获得阳性转染细胞的克隆.     

利用基因工程技术构建重组人血小板因子4真核表达载体

目的:构建携带绿色荧光蛋白标签的重组人血小板因子4基因(plateletfactor4,PF4)的真核表达载体,并在真核细胞中表达,为研究其生物学功能奠定基础。方法:人工合成PF4基因模板,通过PCR方法扩增PF4-cDNA,然后克隆至pUC19克隆载体,经序列测定后重组入pIRES2-EGFP真核表达载体并进行酶切鉴定。将鉴定正确的质粒用脂质体转染法瞬式转染至COS7细胞中。结果:获得了PF4-cDNA基因,序列分析表明,该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明,PF4基因已与pIRES2-EGFP真核表达载体正确连接。荧光显微镜示,此载体成功转染至COS7细胞中,并获得有效表达。结论:利用基因工程技术,成功的构建了携带绿色荧光蛋白标签的PF4的真核表达载体,并在真核细胞中获得有效表达,为下一步研究其在真核细胞中的生物学功能奠定基础。     

构建真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3及其在脐血CD34+细胞中的表达

目的构建真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3配体,为研究Flt3配体对急性放射复合伤造血功能恢复作用提供实验物质基础.方法实验于2003-05/09在第三军医大学劳动卫生教研室完成.先用SalⅠ和BglⅡ双酶切pUMVC3-hFLT3配体,得到全长的人FLT3配体序列(0.8kb),两端抹平后克隆至pIRES2-EGFP载体的BglⅡ位点.然后用NheⅠ和XhoⅠ酶切鉴定;最后用脂质体转染的方法将重组质粒转入脐血CD34+细胞中,经过G418筛选,在荧光显微镜下观察其表达.结果①构建了双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-FLT3.②重组质粒pIRES2-EGFP-FLT3能在脐血CD34+细胞中的表达,凝胶电泳和测序结果证明将FLT3 cDNA亚克隆入pIRES2-EGFP内,荧光显微镜下可见脐血CD34+细胞胞体发出绿色荧光.③转染效率为10.3%.结论①携带标记基因的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3能稳定地转入真核细胞表达载体.②该质粒转染到分离纯化的脐血CD34+细胞中,并获得阳性转染细胞的克隆.     

大鼠SLPI基因真核表达载体的构建及其在真皮多能干细胞中的表达

目的 克隆大鼠白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)基因,构建其真核表达载体,并转染大鼠真皮多能干细胞,以探讨SLPI在创伤及炎症性疾病中的意义.方法 PCR扩增大鼠皮肤SLPI基因 cDNA,酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N2重组,将SLPI基因 cDNA片段连接到pEGFP-N2载体的多克隆位点,形成重组载体pEGFP/SLPI,转化大肠杆菌DH5α菌株,构建成SLPI基因真核表达载体质粒.扩增DH5α后抽提质粒DNA,Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切,电泳,DNA测序鉴定.鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染大鼠真皮多能干细胞,通过荧光显微镜和RT-PCR方法 来检测基因转染及表达.结果从大鼠皮肤cDNA扩增出392 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N2载体中.经酶切和DNA测序验证,插入载体的DNA片段为SLPI基因,插入方向正确.重组质粒经脂质体转染真皮多能干细胞,24 h后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的 基因SLPI表达.结论 大鼠SLPI基因的克隆和真核表达载体构建获得成功,为进一步研究其功能奠定了基础.     

SV40T抗原荧光真核表达载体构建及在胰岛细胞中的表达

背景：有研究表明小鼠胰岛细胞永生化以后增殖能力明显增强，但功能减弱。然而，小鼠的端粒和人类的端粒有差别，大鼠的端粒与人类的相似。 目的：设计和构建SV40T荧光真核表达载体，导入大鼠胰岛细胞中进行表达鉴定。 设计、时间及地点：细胞观察实验，于2007—10／2008—04在深圳市人民医院中心实验室完成。材料：选用成年雄性SD大鼠2只；pCMV—SV40T质粒：pSC—A质粒：pIRES2-ZsGreen1质粒。 方法：用Not I和Xho I将SV40T片断从pCMV-SV40T质粒上双酶切下来，回收后克隆到载体pSC-A中成为pSC—SV40T，再用Xho I和Sac II将SV40T片断双酶切下来，回收后正向克隆到荧光真核表达载体pIRES2-ZsGreen1中，酶切鉴定重组质粒；用脂质体转染的方法将构建的载体导入原代培养的大鼠胰岛细胞；检测SV40T基因在胰岛细胞中的表达。 主要观察指标：绿色荧光蛋白的表达：SV40T的转录和翻译。结果：①经XhoI和SacII双酶切后，重组质粒被切成5.3 kb和2．4 kb 2个片段，与理论预期长度相符。②pIRES2-ZsGreen1—SV40T重组基因经脂质体法转染，G418筛选，在胰岛细胞内可见绿色荧光，反转录-聚合酶链反应及细胞免疫荧光染色可见SV40T mRNA转录及其蛋白的表达。 结论：实验成功构建了SV40T荧光真核表达载体，并可在大鼠胰岛细胞中表达。     

pIRES2-EGFP/cbfa1真核双表达载体的构建及鉴定

目的 构建成骨细胞特异性转录因子Cbfa1双表达载体，以期用于成骨的体内、外研究。 方法 以含有全长cDNA的pCMV/Cbfa1为模板，PCR扩增Cbfa1，T-A克隆，酶切亚克隆到pIRES2-EGFP载体上，酶切、PCR及测序鉴定正确后命名为pIRES2-EGFP，脂质体转染NIH3T3细胞，G418筛选稳定表达后，提取细胞的总蛋白，Westerbblot检测Cbfa1蛋白的表达，以未转染组为对照。结果 酶切、PCR及测序证实pIRES2-EGFP/Cbfa1载体序列正确，脂质体法转染NIH3T3细胞后可见绿色荧光蛋白的表达，Western-blotting检测到cbfa1在蛋白水平的表达。结论 pIRES2-EGFP/Cbfa1载体构建成功，为后续研究奠定基础。     

pIRES2-EGFP／Cbfal真核双表达载体的构建及鉴定

目的:构建成骨细胞特异性转录因子Cbfa1双表达载体,以期用于成骨的体内、外研究。方法:以含有全长cDNA的pCMV/Cbfa1为模板,PCR扩增Cbfa1,T-A克隆,酶切亚克隆到pIRES2-EGFP载体上,酶切、PCR及测序鉴定正确后命名为pIRES2-EGFP,脂质体转染NIH3T3细胞,G418筛选稳定表达后,提取细胞的总蛋白,Western blot检测Cbfa1蛋白的表达,以未转染组为对照。结果:酶切、PCR及测序证实pIRES2-EGFP/Cbfa1载体序列正确,脂质体法转染NIH3T3细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测到Cbfa1在蛋白水平的表达。结论:pIRES2-EGFP/Cbfa1载体构建成功,可为后续研究奠定基础。     

构建pcDNA3.1/Hygro(+)-Lefty A真核表达载体及Lefty A的稳定表达细胞系

背景:Leffy基因可能通过拮抗转化生长因子β1,信号通路发挥抗肾纤维化作用.目的:为验证其抗纤维化作用,构建pcDNA3.1/Hygro(+)-LeffyA真核表达载体,并建立LeftyA稳定表达细胞系.设计、时间及地点:基因克隆构建,单一样本观察,于2008-04/07在武汉大学人民医院中心实验室完成.材料:人肾小管上皮细胞株购于中国协和医科大学细胞库;真核表达载体pcDNA3.1/Hygro(+)由美国纽约州石溪大学SiamakTabibzadeh教授惠赠;Leffy A克隆载体pCMV-SPORT6购自武汉晶赛公司.方法:以pCMV-SPORT6为模板经PCR反应获得Leffy A编码区DNA,将其插入pcDNA3.1/Hygro(+)中构建Leffy A真核表达载体;通过LipofectamineTM2000将此重组质粒转染入人肾小管上皮细胞中,通过Hygromycin筛选挑取阳性表达克隆从而构建Leffy A稳定表达细胞系.主要观察指标:PCR扩增产物电泳鉴定结果.重组质粒的酶切鉴定结果.重组质粒基因测序结果.Leffy A稳定表达细胞系的筛选及其细胞内Leffy A mRNA表达.结果:pCMV-SPORT6经针对人Leffy A基因编码区序列的上下游引物PCR扩增后,10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,在10 kb条带处出现稍大于1.0 kb的特异性扩增条带,与预期1.1 kb目的片段大小相符.重组质粒分别被Hind Ⅲ、BamH Ⅰ单酶切后所得片段大小一致,均为6.7 kb,与重组质粒理论大小一致;经双酶切后得到大小分别为5.6 kb和1.1 kb的2条片段,与pcDNA3.1/Hygro(+)及Leffy A片段大小相符.将酶切鉴定阳性重组质粒测序,对测序结果进行生物信息学分析,发现与人Leffy A基因编码区序列完全一致.稳定转染Leffy A重组质粒的人肾小管上皮细胞高表达Leffy A mRNA.结论:pcDNA3.1/Hygro(+)-Leffy A真核表达载体构建成功,并建立了Lefty A稳定表达细胞系.     

人PTEN绿色荧光蛋白真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人PTEN绿色荧光蛋白真核表达载体并进行鉴定.方法 参照PTEN基因全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自的酶切位点.从正常人胎盘组织中提取mRNA作为模板合成第一链,并扩增目的基因序列片段,经双酶切后定向克隆至绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中,筛选阳性重组质粒,分别经双酶切、测序法对重组质粒进行鉴定.结果 双酶切和特异PCR结果表明克隆的基因片段约1.2 kb;测序法进一步证实该基因为PTEN编码基因,经NCBIBLAST分析与Gene Bank中基因序列完全相同.结论 成功构建了人PTEN绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1-PTEN,为研究在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础.     

人脑源性神经营养因子和神经营养素3真核双表达载体的构建与鉴定

背景：脑源性神经营养因子（brain-derived ;neurotrophic factor,BDNF）和神经营养素3（Neurotrophines-3,NT-3）在细胞分化过程中有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。目的：构建双基因共表达载体pIRES 2-BDNF-NT-3并对其进行鉴定。方法： BDNF和NT-3基因核心序列是通过直接PCR的方法从外周血单个核细胞的基因组DNA中获取。然后将BDNF的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建pIRES2-BDNF-EGFP载体,随后将NT-3 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-BDNF-EGFP中,最后构建成为含有内部核糖体进入位点（IRES）的pIRES2-BDNF-NT-3双基因共表达载体。实验通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。 结果与结论：DNA测序显示,提取的BDNF和NT-3均与基因库报道序列一致。构建的pIRES 2-BDNF-NT-3双基因共表达载体经Eco RⅠ/Bam HⅠ切出BDNF条带,经Bam HⅠ/NotⅠ双酶切后切出IRES-NT-3片段,经Eco RⅠ/NotⅠ双酶切后切出BDNF-IRES-NT-3片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后的HEK293细胞均能表达BDNF和NT-3 mRNA和蛋白。结果证实,实验成功采用IRES序列构建了能分别表达的 BDNF 和 NT-3双基因真核表达载体。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-PDLIM2的构建及在EJ细胞中的表达

背景：核因子κB在肿瘤生成过程中起重要作用,PDLIM2基因可以介导终止核因子κB的活性,解除核因子κB对肿瘤细胞的凋亡抑制作用。目的：克隆人PDLIM2全长基因,构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。方法：采用反转录-聚合酶链反应从新鲜膀胱组织总RNA中克隆PDLIM2全长基因,与经BamHI、XhoⅠ相同双酶切的pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PDLIM2,经酶切及测序鉴定重组质粒中PDLIM2基因的完整性和忠实性。荧光显微镜下观察重组质粒转染的EJ细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞PDLIM2的表达进行RT-PCR检测。结果与结论：经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的EJ细胞中获得PDLIM2的高效表达。表明用反转录-聚合酶链反应方法成功从膀胱组织中克隆出PDLIM2全长基因,成功构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体在骨髓间充质干细胞中的表达

背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，是一种理想的治疗性细胞和基因治疗的靶细胞。目的：观察脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达。设计、时间及地点：单一样本观察的细胞基因工程实验，于2006—03／2007—04在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。材料：5月龄新西兰大自耳兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养。方法：采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。酶切鉴定后，采用Lipofectamine 2000介导胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞。主要观察指标：倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。结果：成功克隆了胞嘧啶脱氨酶基因，基因测序结果同Genbank中公布的序列一致。将胞嘧啶脱氨酶基因亚克隆到pIRES2-AcGFP1质粒上，构建了pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体。利用脂质体介导法将胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞，24h后在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体已成功转入骨髓间充质干细胞中，说明骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。