低温对大鼠胶质细胞间缝隙连接通讯功能的影响

目的探讨低温治疗对大鼠胶质细胞间缝隙连接通讯功能的影响。方法常规体外培养大鼠神经干细胞,传代2次后加入10％胎牛血清诱导其向神经胶质细胞分化,25个培养皿中胶质细胞培养至致密单层细胞,平均分为5组:常温组,培养皿置入37℃,5％CO2饱和湿度培养箱内继续培养24h; 低温组,置入30℃,5％CO2饱和湿度培养箱内继续培养24h;常温轻度缺氧组,使用封口膜封闭培养皿, 置入37℃,5％CO2饱和湿度培养箱内继续培养24h;低温轻度缺氧组,使用封口膜封闭培养皿,置于30 ℃,5％CO2饱和湿度培养箱内继续培养24h;佛波酯阳性对照组,于37℃,5％CO2饱和湿度培养箱内继续培养22h,加入佛波酯继续培养2h,工作液浓度5ng／ml。各组培养至24h后,利用划痕标记染料示踪技术在激光扫描共聚焦显微镜下,通过荧光黄扩散距离测定胶质细胞间缝隙连接通讯水平。结果常温组染料5min扩散距离为(160．5±8．6)μm;低温组缝隙连接通讯明显受到抑制,扩散距离为(126．2±10．4) μm,与常温组相比差异具有显著性意义(P<0．05);常温轻度缺氧组扩散距离为(154．1±6．9)μm;低温轻度缺氧组扩散距离为(122．8±6．0)μm,与常温轻度缺氧组相比差异亦有显著性意义(P<0．05);但常温组与常温轻度缺氧组相比,低温组与低温轻度缺氧组相比,差异均无显著性意义(P>0．05)。结论低温能够降低神经胶质细胞间缝隙连接通讯功能。     

脑蛋白水解液对大鼠神经胶质细胞间缝隙连接通讯的研究

目的探讨脑蛋白水解液对大鼠神经胶质细胞间缝隙连接通讯功能的影响。方法由大鼠神经干细胞诱导培养神经胶质细胞至致密单层，分为脑蛋白水解液组、对照组及佛波酯阴性对照组继续培养，利用划痕标记染料示踪技术，以荧光黄染料在细胞间的扩散距离作为评价缝隙连接通讯的指标，测定脑蛋白水解液对大鼠胶质细胞间缝隙连接通讯的影响；采用逆转录-聚合酶链反应法检测脑蛋白水解液组和对照组细胞Cx43 mRNA表达的变化。结果脑蛋白水解液组荧光黄染料5min扩散距离为（189．80±6．56）μm，对照组扩散距离为（154．70±6．02）μm，组间差异有统计学意义（P〈0．01）；逆转录．聚合酶链反应检测显示脑蛋白水解液组细胞中Cx43mRNA相对表达量为0．89±0．13，高于对照组细胞的0．67±0．10，两组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论脑蛋白水解液可通过上调胶质细胞Cx43基因的表达水平，增强大鼠胶质细胞间缝隙连接通讯，这可能是其在机体损伤修复过程中对胶质细胞起保护作用的重要机制。     

氧糖剥离对星形胶质细胞CX43蛋白表达及分布的影响

目的探讨氧糖剥离(oxygen-glucose deprivation,OGD)对星形胶质细胞缝隙连接蛋白Cx43蛋白表达及分布的影响,为急性脑缺血早期临床治疗提供理论基础。方法通过OGD模拟缺血缺氧诱导激活培养的原代星形胶质细胞,采用免疫印迹及荧光显微镜观察缝隙连接蛋白Cx43的蛋白表达变化及细胞内亚分布特点。结果星形胶质细胞经OGD诱导后在再灌12h Cx43表达上调约1.5倍(P0.01),有统计学意义;再灌24h时Cx43表达轻度下调(P=0.13),无统计学意义;在再灌48h其下降约34%,与对照组相比,有统计学意义(P0.01)。同时在再灌24h时可见部分Cx43定位分布到细胞核。结论 OGD导致星形胶质细胞Cx43蛋白表达呈先升高后下降的动态变化并且有部分Cx43蛋白定位到细胞核,提示针对Cx43蛋白的干预治疗应考虑治疗时间窗。     

缺氧/复氧后星形胶质细胞AQP5表达的变化及亚低温的干预效应

目的观察缺氧/复氧条件下大脑星形胶质细胞水通道蛋白5(AQP5)的表达变化以及亚低温对其表达的影响。方法利用新生24 h内的SD大鼠,进行原代、传代培养,将星形胶质细胞分为对照组、常温组及亚低温组。用台盼蓝染色法测定37℃及32℃时,缺氧/复氧不同时间点星形胶质细胞的存活率,作为细胞受损指标,用倒置相差显微镜对细胞进行形态学观察,应用细胞免疫化学技术检测星形胶质细胞缺氧/复氧各个时间点AQP5的表达变化及亚低温的干预效果。结果 (1)缺氧4、8 h细胞形态变化不明显,随着复氧时间的延长,可见活化逐渐明显,而亚低温干预的细胞形态及细胞存活力变化均较相应的常温组明显减轻;(2)缺氧及复氧早期AQP5的表达水平降低,复氧后6 h随着时间延长AQP5表达明显增多,在复氧≤8 h常温组及亚低温组的表达水平均低于对照组(P<0.05或0.01),而复氧后10、12 h AQP5蛋白表达水平均明显高于对照组(P<0.05或0.01);(3)在复氧后各时间点亚低温组AQP5的表达水平均明显低于常温组(P<0.05或0.01)。结论亚低温可以减轻缺氧/复氧后星形胶质细胞的损伤,通过降低AQP5的表达水平,可能是亚低温减轻缺血性脑水肿的作用机制之一。     

脑白质低灌注损伤后星形胶质细胞缝隙连接蛋白43的表达变化

目的研究慢性脑白质缺血后星形胶质细胞和缝隙连接蛋白Connexin43(Cx43)的变化。方法原代培养星形胶质细胞,建立体外慢性缺氧模型;双侧颈总动脉狭窄法,建立慢性低灌注脑白质损伤小鼠模型;免疫荧光共染观察星形胶质细胞活化与Cx43表达。Western蛋白定量分析髓鞘相关指标髓鞘相关糖蛋白MAG,星形胶质细胞标记物GFAP和Cx43的表达。结果与对照组相比,细胞慢性缺氧7d后,星形胶质细胞明显增生活化,伴随Cx43表达水平明显上调。Western blot发现,在慢性脑白质缺血过程中,MAG的表达逐渐降低,GFAP持续增高,Cx43表达明显上调。免疫荧光共标记可见,星形胶质细胞中Cx43表达上调,主要分布于胼胝体中央区。结论慢性脑白质缺血损伤过程伴随星形胶质细胞Cx43表达增加,Cx43可能成为临床治疗血管性认知障碍的新靶点。     

实验性自身免疫性脑脊髓炎脑内缝隙连接蛋白Cx43和Cx32的表达变化

目的 观察豚鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型脑内星形胶质细胞(AS)缝隙连接(GJ)蛋白Cx43与神经元缝隙连接蛋白Cx32表达变化及相互关系,以探讨胶质细胞和神经元表面缝隙连接与EAE模型损伤的关系.方法 采用免疫组化方法,显示EAE模型豚鼠脑内胶质细胞和神经元表面缝隙连接蛋白Cx43和Cx32的表达变化及分布规律.结果 EAE豚鼠模型建立成功后,脑内星形胶质细胞Cx43-Li细胞表达明显增加,呈斑点样或分枝样;神经元Cx32-Li细胞表达也增加,并存在一定时间相关性.结论 EAE豚鼠脑内Cx43和Cx32表达增加,提示EAE发生后星形胶质细胞与神经元间信息交流可能加强.     

亚低温对缺氧/复氧后星形胶质细胞AQP4表达的影响

目的 观察缺氧/复氧条件下大脑星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)的表达变化以及亚低温对其表达的影响,探讨脑缺血再灌注脑水肿与AQP4的关系以及亚低温对脑缺血再灌注损伤的保护机制.方法 利用新生24 h内的SD大鼠,进行原代、传代培养,将星形胶质细胞分为对照组、常温组及亚低温组.用台盼蓝染色法测定37℃及32℃时,缺氧/复氧不同时间点星形胶质细胞的存活率,作为细胞受损指标,用倒置相差显微镜对细胞进行形态学观察,应用细胞免疫化学技术检测星形胶质细胞缺氧/复氧各个时间点AQP4的表达变化及亚低温的干预效果.结果 (1)缺氧4,8h时细胞形态变化不明显,随着复氧时间的延长,可见细化逐渐明显,而亚低温干预的细胞形态及细胞存活力变化均较相应的常温组明显减轻;(2)缺氧及复氧早期AQP4的表达降低,复氧后6h随着时间延长AQP4表达明显增多,在复氧≤8h,常温组及亚低温组的表达均低于对照组(均P＜0.05或0.01),而复氧后10,12h,AQP4蛋白表达均明显高于对照组(均P＜0.05或0.01);(3)在复氧后各时间点亚低温组AQP4的表达均明显低于常温组(均P＜0.05或0.01).结论 星形胶质细胞对缺氧的耐受能力较强,亚低温可以减轻缺氧/复氧后星形胶质细胞的损伤,通过降低AQP4的表达,可能是亚低温减轻缺血性脑水肿的作用机制之一.     

亚低温对缺氧/复氧条件下星型胶质细胞AQP4表达的影响

目的:探讨亚低温对缺氧/复氧条件下星形胶质细胞（astrocytes,AS）AQP4表达变化的影响。方法:分离新生24h内的SD大鼠皮质,进行星形胶质细胞培养,分为正常对照组(C)、常温缺氧/复氧组(H)、亚低温干预缺氧/复氧组(M)。用台盼蓝染色法测定37℃及32℃时缺氧/复氧不同时间点AS的存活率,对细胞进行形态学观察,应用细胞免疫化学技术检测缺氧/复氧各个时间点AQP4的表达水平。结果:(1)与对照组比较,常温组缺氧后4h及8h有少量细胞死亡(P＜0.05),随着复氧时间延长死亡细胞数亦逐渐增多（P＜0.01）;缺氧4h及8h时,亚低温组细胞死亡数与常温组比较无明显差异,从复氧4h开始,亚低温组细胞死亡数明显少于常温组(P＜0.05)。(2)常温组缺氧4h及8h后,AQP4阳性表达细胞数减少(P＜0.01),而复氧后AQP4阳性表达细胞数逐渐升高并随时间延长呈增高趋势(P＜0.01)。至复氧后8h,亚低温组缺氧/复氧时AQP4阳性表达细胞数均较常温组减少(P＜0.05)。结论:亚低温干预条件下,星形胶质细胞AQP4表达水平降低,可能是亚低温神经保护作用机制之一。     

RNAi抑制星形胶质细胞Cx43对缺氧/再复氧后细胞凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术对星形胶质细胞Cx43蛋白的抑制作用以及对细胞缺氧/再复氧后凋亡的影响。方法化学合成针对大鼠Cx43基因的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)及其阴性RNA,通过脂质体转染体外培养原代星形胶质细胞,Western blot检测Cx43蛋白表达情况,MTT法检测siRNA转染对细胞的毒性作用;通过流式细胞术观察抑制Cx43蛋白对星形胶质细胞缺氧/再复氧后细胞凋亡情况的影响。结果 Western blot结果可见,转染siRNA后12h,Cx43蛋白表达开始抑制,48h抑制最明显,MTT结果显示siRNA组和脂质体组的细胞活性明显低于未转染组(P0.05),siRNA组与脂质体组未见明显区别(P0.05);流式细胞术示缺氧12h复氧不同时间,凋亡率逐渐增加,复氧48h凋亡率最高,siRNA干扰组明显低于正常对照组(P0.05)。结论 RNAi技术是研究Cx43功能的一种有效方法,siRNA转染能有效抑制星形胶质细胞Cx43蛋白表达,siRNA转染时,细胞毒性来自脂质体;siRNA抑制Cx43蛋白能够明显减轻星形胶质细胞缺氧/再复氧后的细胞凋亡。     

星形胶质细胞Cx43与癫痫发作的研究

正近年来随着研究的逐渐深入,发现癫痫持续状态后星形胶质细胞Cx43(connexin43,Cx43)的表达明显增加,提示它们在癫痫发生过程中扮演重要的角色。因此,寻找有效的癫痫防治措施是当今癫痫研究的热点。本文就星形胶质细胞Cx43与癫痫发作的研究做一综述。一、缝隙连接与缝隙连接蛋白缝隙连接(gap junction,GJ)是细胞膜上的一种特殊结构,其构成相邻细胞间重要的离子通道,它通过神经元-胶质细胞或胶质-胶质细胞的相互作用参与信息的传递。     

反义miR-221/222上调Cx43恢复人胶质瘤细胞系U251细胞间缝隙连接通讯的体外研究

目的 探讨反义miR-221/222上调缝隙连接蛋白43(Cx43)以恢复人胶质瘤细胞系U251细胞间缝隙连接通讯的作用机制.方法 脂质体共转染反义寡核苷酸(AS-miR-221/222),下调U251细胞miR-221和miR-222表达水平,采用Northern blotting法检测U251细胞miR-221和miR-222表达水平;虫荧光素酶活性分析并获得靶基因;Western blotting法和免疫荧光法检测U251细胞Cx43表达水平;划痕标记染料示踪技术检测细胞间缝隙连接通讯.结果 AS-miR-221/222组U251细胞miR-221(t=1312.152,P=0.000)和miR-222(t=1226.031,P=0.000)表达水平明显降低;荧光活性明显高于其他各组(均P=0.000),证实Cx43基因为miR-221和miR-222靶基因;Cx43表达水平亦明显升高,且高于无义序列组(t=735.768,P=0.000)和对照组(t=686.252,P=0.000).对照组和无义序列组U251细胞细胞间缝隙连接通讯缺失,罗氏黄仅传递划痕细胞边缘单列细胞;AS-miR-221/222组U251细胞细胞间缝隙连接通讯明显恢复,罗氏黄传递至划痕细胞邻近7～8列细胞.结论 反义miR-221/222可通过上调Cx43表达水平恢复人胶质瘤细胞系U251细胞间缝隙连接通讯.     

缝隙连接、缝隙连接蛋白43与癫痫

<正>缝隙连接(Gap junction,GJ)为细胞膜上的一种特殊结构,构成相邻细胞间的通道,离子及小分子可经其进行细胞间转运,通过缝隙连接可以介导细胞间的通讯和电传导,是电突触的基本结构[1]。缝隙连接蛋白(Connexin,Cx)是缝隙连接的组成部分,缝隙连接蛋白43(Cx43)在哺乳动物的中枢神经系统中数量最多,表达活性最强,其主要在脑组织星形胶质细胞中表达,和细胞信息传导等多个方面关系密切。Cx43在中枢神经系统的同步化放电、信息传递及生长发育     

缝隙连接蛋白43与创伤后脑水肿相关性研究

目的探讨缝隙连接蛋白43（Cx43）与创伤后脑水肿的相关性。方法大鼠脑损伤前2h经侧脑室注射Cx43特异性阻断剂反义寡核苷酸（ODNs）或生理盐水，用Feeney＇s自由落体法制作局灶性脑损伤动物模型，通过星形胶质细胞的特异性标记物-胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光染色，观察脑皮质区星形胶质细胞的形态、数量的变化，同时观察脑组织的水肿情况。结果脑损伤后生理盐水对照组GFAP标记的星形胶质细胞数量较ODNs预处理组明显增多（P〈0．05），细胞胞体较肥大；ODNs预处理组脑水肿较生理盐水对照组明显减轻（P〈0．05）。结论阻断Cx43可减轻脑创伤后脑水肿的程度，Cx43参与了脑损伤后的脑水肿的形成。     

高渗刺激后大鼠视上核星形胶质细胞和神经元的反应及其相互关系的光、电镜研究

目的探讨大鼠尾静脉注射高渗盐水(9％NaCl，5．5mL／kg)后，视上核(SON)内星形胶质细胞和神经元的可塑性反应及相互间的关系。方法用免疫组织化学和免疫电镜技术，观察刺激后15，45，90，180和360minSON内缝隙连接蛋白43(Cx43)和蛋白32(Cx32)的变化及超微结构。结果光镜下观察到Cx43阳性星形胶质细胞在15min出现，45min达到高峰；Cx32阳性神经元90min达到高峰。电镜下在SON内，观察到下列四种超微结构：(1)突触样结构(synapse like structure)，位于神经元的轴突末梢与Cx43阳性的星形胶质细胞突起之间；(2)三成分的突触复合体(tripartite synaptic structure)，由突触前膜、突触后膜和靠近此突触的星形胶质细胞突起共同组成；(3)同源性缝隙连接(gap junction，GJ)，位于星形胶质细胞突起之间，两侧均为Cx43；(4)“异源性缝隙连接样结构”(heterotypic gap junctions，HGJ)，是由Cx32阳性神经元和Cx43阳性星形胶质细胞突起组成的一种超微结构。结论高渗刺激后，SON内Cx43阳性星形胶质细胞和Cx32阳性神经元明显增加，前者出现和高峰的时间早于神经元；两者之间的HGJ数量明显增加，其他结构的数量变化不明显，因此两者可能是通过HGJ进行快速的信息交流。     

星形胶质细胞连接蛋白43及其半通道在脑缺血再灌注损伤中的作用

目的探讨星形胶质细胞连接蛋白43(Cx43)及其半通道在缺血再灌注(IR)损伤中的作用。方法 32只Wistar鼠被随机分为IR 0 h组、IR 4 h组和IR 24 h组和对照组,每组8只鼠。用免疫组化和Western印迹法检测各组大鼠星形胶质细胞Cx43、半通道抗体1(HC1)和半胱天冬酶3(Casp3)的表达。在氧葡萄糖剥夺-再恢复(OGDR)0 h,4 h和24 h,用MTT法检测星形胶质细胞活性,用免疫组化和Western印迹法检测Cx43,HC1和Casp3表达的改变。结果大鼠星形胶质细胞中HC1的表达明显少于Cx43的表达。与对照组比较,IR 4 h组大鼠脑组织中Cx43、HC1和Casp3的表达明显增加(均P0.05),而IR 0 h组和IR 24 h组却没有明显的变化。OGDR后星形胶质细胞cell line和Psup细胞中Cx43、HC1和Casp3的表达在OGDR 4h组明显高于对照组(均P0.05),在OGDR 24 h组则与对照组差异无统计学意义。OGDR后shRNA星形胶质细胞中Cx43、HC1和Casp3的表达无统计学意义上变化。结论 Cx43及HCl在星形胶质细胞凋亡过程中起到了促进作用,这可能是IR损伤发生及发展的机制之一。     

低温抑制兔血管平滑肌细胞间缝隙连接通讯的研究

目的探讨凝血块混合物对血管平滑肌缝隙连接通讯(GJIC)功能的影响,阐明低温治疗具有抑制此种GJIC的作用。方法培养兔血管平滑肌细胞至致密单层,分别加凝血块混合物在常温、低温下培养组,以及无凝血块混合物的常温培养组,利用划痕标记染料示踪技术(SLDT)测定GJIC水平。结果加凝血块混合物常温组(组①)染料5min扩散距离较无凝血块混合物的常温培养组(组②)远;加凝血块混合物低温组(组③)扩散距离较组①染料5min扩散距离明显缩短。①与②、①与③有统计学意义(P<0.01)。结论凝血块混合物具有增强血管平滑肌细胞GJIC的功能;低温具有降低此种GJIC功能的作用,可能是低温治疗蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管痉挛(CVS)的作用机理之一。     

七氟醚预处理对脑缺血再灌注损伤后星形胶质细胞缝隙连接的影响

目的探讨七氟醚预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后星形胶质细胞缝隙连接蛋白43(CX-43)以及缝隙连接超微结构的影响。方法雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血对照组(对照组)和七氟醚预处理组。采用线栓法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。脑缺血再灌注24 h后,采用透射电镜观察星形胶质细胞间缝隙连接超微结构的改变;脑缺血再灌注24和72 h后,免疫荧光染色和蛋白免疫印迹法检测缺血侧脑组织内CX-43的表达。结果脑缺血再灌注24 h后,对照组仅残留少量缝隙连接,七氟醚预处理组细胞间缝隙连接超微结构完整。脑缺血再灌注24 h后,对照组CX-43含量显著低于七氟醚预处理组(P0.05)。结论七氟醚预处理可能通过减轻脑缺血再灌注损伤后缝隙连接的破坏和CX-43的缺失起到神经保护作用。     

柚皮苷对脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的研究柚皮苷(Naringin,NRG)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及星形胶质细胞是否参与其中。方法柚皮苷连续灌胃7 d后进行大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO),缺血2 h后拔出线栓进行再灌注。24 h后TUNEL染色观察凋亡细胞数量,苏木精-伊红(hematoxyli-eosin,HE)染色观察形态学改变,免疫荧光染色分别检测星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)。结果同模型组相比,柚皮苷预干预后凋亡细胞数量显著减少(P0.05),细胞损伤明显减轻。免疫染色显示柚皮苷可以减轻星形胶质细胞的激活程度,同时Cx43的表达也有所降低(P0.05)。结论柚皮苷预干预可有效减轻脑缺血再灌注损伤,该保护作用同降低星形胶质细胞Cx43表达密切相关。     

伽玛刀照射后胶质细胞CX43和GFAP表达变化及意义

目的研究伽玛刀照射后胶质细胞缝隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)和胶质纤维酸蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)表达的变化。方法体外培养原代星形胶质细胞(astrocytes,Ast)分为正常对照组和γ刀照射组,后者经γ刀照射(边缘剂量4～36Gy),培养72小时后检测GFAP,Cx43。结果4～12Gy组与正常对照组无显著差异,至16Gy组胶质细胞开始增生GFAP表达阳性细胞数大于正常对照组且呈剂量依赖性增高至32Gy组GFAP表达达最大值。Cx43表达在12Gy组即开始明显下降且Cx43表达呈计量依赖性减低,在24～32Gy降低尤为显著至32Gy组达最低值。结论原代培养Ast经伽玛刀照射后GFAP表达增高,同时Cx43表达减低。Cx43的异常低表达可能是胶质增生及放射损伤的重要原因。     

缝隙连接蛋白Cx43在神经系统领域研究进展

缝隙连接(gap junction,GJ)通道是对抗细胞间电阻,实现兴奋在细胞间传播的主要途径.缝隙连接蛋白(connexin,Cx)是构成细胞间缝隙连接通道的基本结构和功能的一大类膜蛋白[1],6个缝隙连接蛋白单体形成同源六聚体,中间有一个亲水性通道,每侧膜上的通道相当于一个半通道,两侧膜相对,形成缝隙连接通道.这些通道通常是开放的,允许水溶性分子和离子通过,一个细胞产生的动作电位可通过缝隙连接的局部电流传播到另一个细胞.其中,缝隙连接蛋白CX43在神经系统信号传递中发挥重要作用.Cx43在星形胶质细胞、室管膜细胞和软膜内皮细胞中表达,以星形胶质细胞中含量最丰富,在神经系统信号传递及各种反应中发挥重要作用[2].本文主要探讨Cx43在神经系统生理及某些神经系统疾病领域的研究进展.