hTERT启动子的克隆及hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的转录活性

目的 克隆hTERT启动子核心序列,研究hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的联合转录活性。 方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增hTERT启动子核心片段;将其分别插入荧光素酶基因报告质粒pGL3-Basic和pGL3-Enhancer中,构建hTERT启动子调控的表达载体pGL3-hTERTp和由hTERT启动子/SV40增强子联合调控的表达载体pGL3-hTERTp-SV40en,将上述重组质粒分别瞬时转染食管癌细胞Eca-109、EC1和人胚肺成纤维细胞MRC-5,用荧光素酶检测试剂盒检测转染细胞中荧光素酶基因的表达水平并以此计算hTERT启动子和hTERT启动子/SV40增强子在各种细胞中的转录活性。结果 克隆出长213 bp的hTETR启动子核心片段,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子的碱基序列完全一致;成功构建真核表达载体pGL3-hTERTp和pGL3-hTERTp-SV40en;hTETR启动子在食管癌细胞Eca-109和EC1中均有转录活性,在MRC-5细胞中无明显转录活性;hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞Eca-109和EC1中的转录活性显著高于hTETR启动子的单独转录活性。结论 hTERT启动子在食管癌细胞中具有靶向性转录活性,SV40增强子能显著增强hTERT启动子在食管癌细胞中的转录活性,有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的转录调控元件。     

hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT载体的构建及其应用

目的 构建hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT表达载体,研究其对人胃癌细胞SGC7901的体外靶向性杀伤作用。方法 PCR扩增hTERT核心启动子片段,克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3 Basic,检测hTERT启动子在人胃癌细胞SGC7901和人成纤维细胞HLF中的转录活性。构建hTERT启动子调控的CD:UPRT基因表达载体hTERT CD:UPRT,将其和CMV启动子调控的CD:UPRT基因表达载体pcDNA3.1 CD:UPRT用脂质体转染法分别转染入SGC7901和HLF细胞,筛选稳定表达细胞系,用RT PCR和Western blot方法检测CD基因的表达,用MTT法检测5 FC对转染细胞的杀伤作用。结果 成功克隆hTERT核心启动子;荧光素酶活性检测显示,hTERT启动子在SGC7901细胞中的转录活性为阳性对照的(21.50±2.15)%,而在HLF细胞中仅有背景活性。成功构建hTERT启动子调控的CD:UPRT基因表达载体,转染pcDNA3.1 CD:UPRT的SGC7901和HLF细胞以及转染hTERT CD:UPRT的SGC7901细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到CD基因的表达,且对5 FC敏感;而转染hTERT CD:UPRT的HLF细胞未检测到CD基因的表达,对5 FC不敏感。结论 构建的hTERT启动子调控的融合自杀基因系统CD:UPRT/5 FC能在体外靶向性杀伤SGC7901细胞。     

前列腺特异性抗原启动子增强子调控重组质粒的构建及鉴定

目的:利用前列腺特异性抗原(pros-tate-specific antigen,PSA)组织特异性表达的特点,克隆出其上游增强子(prostate-specific antigen enhancer,PSAE)和启动子(prostate-specificantigen promoter,PSAP)片断,并对其表达效率和组织特异性表达进行初步研究。方法:从前列腺癌组织提取基因组DNA,并采用PCR方法分别扩增PSA增强子和启动子序列;利用报告基因pEGFP-1,分别构建含不同调控序列的表达载体;脂质体介导基因转染不同细胞并观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况。结果:成功构建质粒pPSAE-EGFP、pPSAP-EGFP和pPSAE-PS-AP-EGFP;转染结果显示,pPSAE-PSAP-EGFP在前列腺癌细胞PC-3中的荧光强度明显高于pPSAP-EGFP,pPSAE-EGFP同样观察到荧光表达,说明PSA增强子能显著提高PSA启动子的转录能力,并具有单独调控基因表达的能力。结论:PSA增强子和启动子的共同调控可以提高基因表达的有效性和细胞特异性,为前列腺癌的临床基因治疗提供实验依据。     

人类生存蛋白启动子的克隆及其在淋巴瘤细胞中的转录活性研究

  目的　克隆人类生存蛋白（Survivin）核心启动子,研究Survivin启动子在人类淋巴瘤细胞Ramos和健康人肝脏细胞Chang Liver中的转录活性。方法　以人类肠基因组DNA为模板,PCR扩增Survivin启动子987 bp片段,将其通过酶切位点连入pGL3-Basic载体构建pGL3-Survivin荧光素酶报告基因载体,通过脂质体转染法转染Ramos和Chang Liver 细胞,通过检测荧光素酶表达水平,比较Survivin启动子在这两种细胞中的转录活性。结果　成功克隆出987 bp的Survivin启动子;双酶切、PCR检测和DNA测序证实pGL3-Survivin载体构建成功;荧光素酶活性检查显示：Survivin启动子在Ramos细胞中的转录活性为阳性对照CMV启动子活性的4.5 %,明显高于在Chang Liver细胞中的0.19 %,在淋巴瘤细胞中具有较高特异性,且在淋巴瘤细胞中的活性明显高于阴性对照pGL3-Basic的0.086 %。结论　Survivin启动子在淋巴瘤细胞中具有较高的特异性,可以作为淋巴瘤细胞基因转染的肿瘤特异性启动子使用。     

肿瘤端粒酶靶向腺病毒载体的表达活性

目的　构建针对端粒酶阳性肿瘤的特异性腺病毒载体 ,研究其介导目的基因在肿瘤细胞内的定向表达能力。方法　将端粒酶逆转录酶 (hTERT )启动子克隆入质粒 pDC3 12的多克隆位点构成外源基因表达盒 ,在基因表达盒上下游分别插入 1个绝缘子序列 ,构建针对端粒酶阳性肿瘤的特异性腺病毒载体pSG TPE ;采用Luciferase报告基因进行hTERT启动子的活性分析 ;以pSG TPE携带绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因 ,重组腺病毒AdTPE EGFP ,观察其介导EGFP在肿瘤细胞内的定向表达能力 ,并与CMV启动子控制的腺病毒AdCMV EGFP作对照。结果　hTERT启动子在正常细胞内几乎没有活性 ,而在肿瘤细胞内的活性与SV 40启动子相近。腺病毒AdTPE EGFP能介导EGFP在肿瘤细胞内定向而稳定表达 ,在正常细胞内不表达 ,而对照腺病毒AdCMV EGFP在肿瘤和正常细胞内均表达EGFP。结论　靶向端粒酶阳性肿瘤的腺病毒载体 pSG TPE ,不但提高了对基因表达调控的特异性 ,而且降低了对正常细胞毒性作用。绝缘子的应用隔断了外源基因表达盒和病毒基因表达调控序列之间的互相干扰 ,进一步提高目的基因的表达效率。该载体对肿瘤的靶向基因治疗具有重要的应用价值。     

小鼠TERT启动子的克隆及在肿瘤细胞中的转录活性研究

目的：克隆不同长度的小鼠端粒酶逆转录酶（mouse telomerase reverse transeriptase,mTERT）启动子,研究其在小鼠肝癌细胞Hepal-6、结肠癌细胞CT26、恶性黑色素瘤细胞B16和小鼠成纤维细胞NIH3T3中的转录活性。方法：以Hepal-6细胞的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增不同长度的mTERT启动子片段,分别命名为mTERT1至7;然后分别克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3～Basic构建真核表达载体;采用脂质体Lipofectamine2000将重组质粒分别和pRL—CMV共转染Hepal-6、CT26、B16和NIH3T3细胞,采用双荧光素酶法检测不同长度的mTERT启动子片断在细胞中的转录活性。结果：双酶切和测序鉴定均显示不同长度的mTERT启动子克隆成功及其表达载体构建成功;荧光素酶活性检测显示mTERT1至5在3种肿瘤细胞中有较高的转录活性,而在NIH313细胞中的活性较低,mTERT6和mTERT7在所有细胞中均很低;同一片断在不同肿瘤细胞株中活性不同。结论：mTERT核心启动子区位于ATG上游333bp内,且具有肿瘤特异性。     

增强子对基因表达调控的研究进展

增强子是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列,生物信息学的诞生为其研究带来了极大的便利.利用增强子修饰的肿瘤特异性启动子使治疗或效应基因在特定的组织、细胞或器官中表达,实现对肿瘤靶向性治疗,是一种非常有意义的基因治疗途径.     

人脂肪酸合成酶FAS启动子的克隆及其在几种肿瘤细胞中的转录活性分析

目的:克隆人脂肪酸合成酶基因FAS启动子的序列,构建重组荧光素酶表达载体pGL3-FAS,并分析其在几种肿瘤细胞中的转录活性,为其作为肿瘤靶向基因治疗的工具提供依据。方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增FAS启动子区680bp活性序列,经测序鉴定正确后,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-enhancer中,构建成重组荧光素酶表达载体pGL3-FAS。将pGL3-FAS通过脂质体转染胃癌细胞系SGC-7901、人宫颈癌细胞系Hela、人乳腺癌细胞系SKBR3、人肝癌细胞系HepG2以及NIH3T3成纤维细胞系中,应用荧光素酶检测系统测定荧光素酶活性,通过内参校正得到相对转录活性。结果:成功扩增出大小约为680bp的FAS启动子序列,经测序鉴定与Genebank报道的一致。经酶切鉴定,成功构建重组荧光素酶表达载体pGL3-FAS。瞬时转染pGL3-FAS,发现其在SGC-7901、Hela、SKBR3、HepG2细胞中均具有较强的荧光素酶活性,且荧光素酶活性高于强启动子SV40驱动的pGL3-control载体;而在正常成纤维细胞中,转录活性较低。结论:FAS启动子在肿瘤细胞中具有强转录活性,而在正常细胞中转录活性很低,具有良好的肿瘤靶向性,为肿瘤靶向基因治疗提供理论依据。     

细胞色素P450 2E1和1A1多态性与肺癌关系的病例对照研究

目的 :探讨细胞色素P45 0 2E1和P45 0 1A1的多态性与肺癌的关系。方法 :采用聚合酶链式反应和限制性片段长度多态性技术检测新发肺癌患者91例及非肺部疾患同性别的患者 91例的细胞色素CYP 2E1和CYP 1A1的基因多态性 ,并分析比较。结果 :在 2组间平衡吸烟的因素后 ,CYP 2E1和CYP 1A1基因多态性分别单独分析时 ,与肺癌关系较弱 ,其OR值分别为 1 46和 1 5 1,与对照组相比差异无统计学意义 ,P >0 0 5 ;而两者联合分析时 ,CYP2E1C1C1型和CYP 1A1突变型的OR值为 3 0 0 ,95 %CI为 1 0 3～ 8 78,差异有统计学意义 ,χ2 =4 0 2 ,P <0 0 5。结论 :CYP 2E1和CYP 1A1单一基因的多态性不能增加患肺癌的危险 ,而两者联合作用时则可增强患肺癌的风险。     

环氧化物水解酶Tyr113His多态性与中国北方人群食管鳞状细胞癌易感性的研究

目的 :研究微粒体环氧化物水解酶Tyr113His多态性与中国北方人群食管鳞状细胞癌 (esophagealsquamouscellcarcinoma ,ESCC)易感性的关系。方法 :采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应 (polymerasechainreaction re strictionfragmentlengthpolymorphism ,PCR RFLP)方法分析 2 5 7例食管癌患者和 2 5 2名健康对照组人群mEHTyr113His基因型分布。结果 :Tyr和His等位基因频率在食管癌患者和健康对照组中分别为 44 2 %、5 5 8%和 44 0 %、5 6 0 %。等位基因分布在两组之间差异无统计学意义 ,χ2 =0 0 0 8,P =0 92 9;基因型分布在病例组与对照组之间差异也无统计学意义 ,χ2=2 116,P =0 3 47。相对于Tyr/Tyr基因型 ,His/His基因型或His/His与Tyr/His基因型相加均未增加ESCC的发病风险。它们的危险度分别为 1 0 76( 95 %可信区间 =0 85 0～ 1 3 61)和 0 75 6( 95 %可信区间 =0 493～ 1 15 7)。如按性别、年龄、吸烟状态及是否具有上消化道肿瘤家族史进行分类 ,His/His基因型或His/His与Tyr/His基因型相加也未对ESCC的发病风险造成明显影响。结论 :mEH的Tyr113His多态性不能作为筛查ESCC患病风险的独立因素。     

中国人散发性大肠癌APEX基因氧化还原功能区中常见的单核苷酸多态性

目的 :了解散发性大肠癌中脱嘌呤 /脱嘧啶核酸内切酶 (apurinic/apyrimidinicendonuclease ,APEX ,Ape/Ref 1,HAP1)基因氧化还原功能区遗传变异状况。方法 :收集散发性大肠癌及相应癌周正常肠黏膜各 15 0例 ,抽提基因组DNA ;采用PCR扩增、变性梯度凝胶泳电泳 (denaturinggradientgelelec trophoresis ,DGGE)筛选、DNA测序的方法检测散发性大肠癌中APEX基因exon1、exon2和exon3的基因变异。结果 :4例exon1扩增片段DGGE图谱出现异常条带 ,经测序证实肿瘤及相应正常组织存在 4 5 3G→T巅换 ,基因型均为GT ;exon2未发现异常泳动条带 ;16例exon3扩增片段的DGGE图谱出现异常条带 ,测序发现exon3存在 12 4 7A→G转换 ,该变异导致APEX基因第 6 4位密码子由ATC变为GTC ,相应的氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸 ,肿瘤及癌周正常黏膜具有相同基因型。结论 :APEX基因氧化还原功能区 12 4 7A→G多态性在中国人散发性大肠癌中的频率远高于国外报道正常人群中的频率 ,可作为遗传流行病学研究的候选位点     

DNA拷贝数变化与肿瘤

 DNA拷贝数变化（CNV）是一种介于1 kb至3 Mb的DNA片段的变异, 在人类基因组中广泛分布,极大地丰富了基因组遗传变异的多样性。研究发现,大部分CNV都与复杂疾病密切相关。CNV如果发生在肿瘤相关基因序列内部或周围可能引起癌基因激活、抑癌基因失活,最终导致肿瘤的发生。CNV通过改变基因剂量、调节基因活性影响基因表达、表型差异和表型适应,从而引起肿瘤以及其他遗传疾病。研究CNV对于探索染色体重组、基因组进化、基因表达以及多种复杂疾病尤其是肿瘤的发病机制有很大帮助。     

Vitamin D receptor polymorphisms and risk of colorectal adenomas (United States)

Objective: The purpose of this study was to determine whether vitamin D receptor (VDR) gene polymorphisms influence risk of colorectal adenoma. Methods: Polymorphisms in the 5 and 3 ends of the VDR gene were genotyped for 373 colorectal adenoma cases and 394 controls. Results: Overall, there was no significant association between the 5 (FokI) or the 3 (BsmI) polymorphisms and adenoma risk. However, risk of large (>1 cm) adenomas decreased with increasing copies of the FokI f allele (p = 0.04). Compared to the FF genotype, odds ratios for the Ff and ff genotypes were 0.79 (95% CI 0.44–1.41) and 0.32 (95% CI 0.11–0.91), respectively. FokI genotype was more strongly related to large adenoma risk among subjects with low dietary calcium intake (OR_Ff = 0.48; 95% CI 0.17–1.3; OR_ff = 0.21; 95% CI 0.04–1.3), low dietary vitamin D intake (OR_Ff = 0.25; 95% CI 0.09–0.69; OR_ff = 0.22; 95% CI 0.04–1.2), or dark skin color (OR_Ff = 0.66; 95% CI 0.27–1.6; OR_ff = 0.10; 95% CI 0.01–1.0). Conclusion: These results suggest that VDR FokI genotype influences development of colorectal adenomas, and that the effect may be modified by calcium and vitamin D status.     

EB病毒编码小RNA多态性与鼻咽癌的关系

目的 探讨EB病毒编码小RNA（EBERs)多态性与鼻咽癌发病趋势的联系。方法 巢式PCR扩增EBER－1和EBER－2序列，直接测序，比较鼻咽癌高发区广东地区鼻咽癌组织、正常人鼻咽黏膜组织和鼻咽癌低发区哈尔滨地区正常人漱口液感染的EB病毒EBERs序列差异。结果 广东地区鼻咽癌组织感染的EBERs具备1型病毒的特征。与原型株B95．8相比，广东地区鼻咽癌组织来源的EBER－2基因存在8处碱基替换和2处碱基缺失。但是，广东正常人鼻咽黏膜组织和哈尔滨地区正常人漱口液来源的EBERs也有相同的碱基替换和缺失。结论 鼻咽癌高发区和低发区流行的EB病毒EBERs序列呈现高度一致性。     

胃癌患者白细胞介素-1B 基因多态性及序列测定的初步研究

目的 :检查国人胃癌中IL 1B基因启动子区域 -3 1C/T多态性 ,初步分析其基因型与胃癌的相关性。方法 :应用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)分析技术 ,对收集的 5 0例胃癌癌旁正常组织和 5 0例正常健康人外周血标本 ,提取DNA进行PCR扩增 ,然后用AluI限制性内切酶对PCR产物进行消化 ,经琼脂糖凝胶电泳对IL 1B基因多态性进行分析 ,并对C/C和T/T进行序列测定。结果 :IL 1B基因-3 1C等位基因频率在正常人和胃癌患者中分别为 75 %和 5 3 % ,-3 1T等位基因频率则分别为2 5 %和 47%。正常人和胃癌患者中 3种基因型频率分别为 -3 1C/-3 1C :5 6% ( 2 8/5 0 )和 3 0 %( 15 /5 0 ) ;-3 1C/-3 1T :3 8% ( 19/5 0 )和 46%( 2 3 /5 0 ) ;-3 1T/-3 1T :6% ( 3 /5 0 )和 2 4%( 12 /5 0 )。携带 -3 1T等位基因增加罹患胃癌的危险性 ,-3 1C/-3 1T杂合子和 -3 1T/-3 1T纯合子分别增加 2 3和 7 5倍。并经DNA序列测定证实在IL 1B基因启动子区域有一TATA框多态 ,即 -3 1碱基发生C→T转换。结论 :IL 1B基因启动子区域 -3 1C/T多态性与国人胃癌易患性相关     

肺癌组织细胞中CHFR基因表达水平及其启动子甲基化状态

目的：探讨CHFR（checkpoint with FHA and ring finger）基因表达水平及其启动子CpG岛甲基化状态与肺癌发生发展的关系。方法：实时定量PCR法检测CHFRmRNA在45例肺癌组织、23例癌旁组织与去甲基化剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷处理前后A549细胞株中的表达，同时用甲基化特异性PCR检测CHFR启动子CpG岛甲基化状态。结果：CHFRmRNA在癌旁组织中全部表达，在肺癌组织中表达缺失率为15．56％（7／45），且表达量低于正常肺组织，F=9．156，P〈0．01；但在不同年龄、性别、肿瘤大小、恶性程度和肿瘤分类中的差异无统计学意义，P〉0．05。CHFR基因启动子在肺癌组织中发生甲基化的频率为22．22％（10／45），在癌旁组织未发生甲基化，χ^2=5．992，P〈0．05。10例启动子区甲基化的肺癌标本中，7例同时伴有mRNA表达缺失。结论：CHFR启动子甲基化可在肺癌发生和发展中起一定作用。     

鼻咽癌细胞株14-3-3σ启动子去甲基化与基因表达研究

目的 研究鼻咽癌细胞株14-3-3σ基因启动子甲基化状况及去甲基化处理对其表达的影响.方法 用甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)和逆转录PCR方法检测鼻咽癌细胞株CNEI、CNE2、5-8F、6-10B和非肿瘤人鼻咽上皮细胞NP69细胞14-3-3σ基因启动子甲基化状况和mRNA表达水平.用不同浓度5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2dC)处理鼻咽癌细胞株72 h,检测处理组和对照组14-3-3σ基因启动子甲基化状况和mRNA表达水平,并用Western-blot检测14-3-3σ蛋白表达情况.结果 NP69细胞14-3-3σ启动子未检测到甲基化,CNE1、CNE2、5-8F、6-10B细胞14-3-3σ基因启动子都存在甲基化,4株肿瘤细胞的14-3-3σ mRNA表达水平显著低于NP69细胞.5-aza-2dC处理能剂量依赖性地逆转鼻咽癌细胞14-3-3σ启动子的甲基化状态并上调其mRNA和蛋白质的表达水平,高分化细胞株(CNE1)对药物的敏感性高于低分化细胞株(CNE2、5-8F和6-10B).结论 启动子甲基化是导致鼻咽癌细胞株14-3-3σmRNA和蛋白质表达降低的直接原因,14-3-3σ启动子去甲基化可能成为鼻咽癌治疗的新靶点.