MicroRNA-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响

目的:探讨miR-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响。方法:以小鼠前成骨细胞MC3T3-E1为实验对象,对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导,分别在0、3、5、7 d应用实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测细胞中Runx2、Osx、ALP、miR-103-3p表达水平,Western免疫印迹（Western blotting）检测Runx2、Osx蛋白表达并进行碱性磷酸酶（ALP）染色。通过脂质体lipofectamine2000瞬时转染miR-103-3p模拟物 （miR-103-3p mimics）及模拟物阴性对照进入MC3T3-E1细胞内,Real-time PCR检测2组细胞miR-103-3p的表达水平,CCK-8试剂盒检测细胞增殖。分别对2组细胞进行成骨诱导,在成骨诱导后0、3、7 d,分别使用Real-time PCR和Western免疫印迹检测2组细胞Runx2、Osx等成骨相关基因mRNA和蛋白的表达变化,并对2组细胞进行ALP染色。实验数据采用SPSS19.0软件包进行统计学分析。结果:MC3T3-E1经成骨诱导0、3、5、7 d后,细胞内Runx2、Osx、ALP转录水平持续显著升高;Runx2、Osx蛋白表达升高。ALP染色逐渐加深。在成骨诱导3、5、7 d的MC3T3-E1细胞中,miR-103-3p水平较诱导前受到持续显著抑制(P<0.05)。瞬时转染miR-103-3p mimics后,MC3T3-E1细胞中的miR-103-3p表达水平较对照组显著上调(P<0.05),细胞增殖受到抑制,Runx2、ALP转录水平显著抑制（P<0.05）,Runx2蛋白表达显著抑制。对转染后的细胞进行成骨诱导3、7 d后,miR-103-3p转染组细胞Runx2、Osx、ALP在转录水平的表达较对照组显著降低,Runx2、Osx在蛋白水平的表达较对照组显著降低,且miR-103-3p转染组细胞ALP活性较对照组显著降低。结论:miR-103-3p可能对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化早期起抑制作用。     

miR-199a调控IGF1表达对机械刺激下成骨细胞分化的影响

目的： 探讨微小RNA（miR）-199a在机械牵张力刺激下MC3T3-E1细胞中的表达变化及其对牵张力刺激MC3T3-E1细胞成骨分化的作用机制。方法： 对体外培养的MC3T3-E1细胞加载12%牵张力0、3、6、12和24 h后,利用碱性磷酸酶（ALP）活性检测试剂盒检测ALP活性,实时荧光定量PCR检测骨钙素（OCN）、成骨细胞特异性转录因子Osterix（OSX）、Runt相关转录因子2（Runx2） mRNA和miR-199a的表达。将MC3T3-E1细胞分为对照组、牵张力组、牵张力+miR-NC组和牵张力+miR-199a组,加载12%牵张力和转染miR-199a模拟物后,观察miR-199a和OCN、OSX、Runx2 mRNA及蛋白表达以及ALP活性。茜素红S（ARS）染色观察钙结节形成能力。采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-199a与胰岛素样生长因子1（IGF1）的靶向关系,实时荧光定量PCR法和免疫印迹法检测miR-199a模拟物对IGF1 mRNA和蛋白表达的影响。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果： 与0 h时间点相比,以机械牵张力刺激3、6、12和24 h后,MC3T3-E1细胞ALP活性和OCN、OSX、Runx2 mRNA表达水平均显著升高,而miR-199a表达水平显著降低（P<0.05）,12 h时变化最为显著。与对照组相比,牵张力组细胞中miR-199a表达水平显著降低,而细胞ALP活性、OCN、OSX、Runx2 mRNA及蛋白表达水平、钙结节形成水平均显著升高（P<0.05）;与牵张力组相比,牵张力+miR-NC组细胞中上述各指标差异均无统计学意义（P>0.05）;与牵张力+miR-NC组相比,牵张力+miR-199a组细胞中miR-199a表达水平显著升高,而细胞ALP活性、OCN、OSX、Runx2 mRNA及蛋白表达水平、钙结节形成水平均显著降低（P<0.05）。miR-199a可与IGF1靶向结合,miR-199a模拟物可使MC3T3-E1细胞中IGF1 mRNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。结论： miR-199a可抑制机械牵张力刺激诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化,其作用机制可能与靶向调控IGF1表达有关。     

硫酸软骨素蛋白聚糖对MC3T3-E1细胞株矿化的影响

目的:观察硫酸软骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycan,CSPG)对前成骨细胞株MC3T3-E1矿化过程中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和钙离子沉积量的影响。方法:MC3T3-E1细胞株在含不同浓度CSPG(0、5、10、15 mg/L)诱导液中培养,不加CSPG组为对照组,其余3组为实验组,细胞诱导14 d时行ALP染色和活性检测,21 d时行茜素红染色和钙离子沉积量检测。结果:与对照组比较,各实验组ALP和茜素红染色面积随CSPG浓度增加逐渐减小,颜色变浅;定量分析结果显示,钙离子沉积量整体差异有统计学意义(P<0.05),ALP活性整体差异无统计学意义。结论:在本实验周期内,CSPG以剂量依赖方式抑制MC3T3-E1细胞株钙离子的沉积。     

柚皮苷协同骨形态发生蛋白-2促进小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖和分化的研究

目的 研究柚皮苷（NAR）联合骨形态发生蛋白（BMP）-2对体外培养的成骨前体细胞MC3T3-E1增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨相关基因ALP、骨钙素（OCN）、成骨特异性转录因子（Runx2）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）表达的影响。方法 以成骨细胞株MC3T3-E1为体外药效的试验模型,通过Alamar blue法检测第1、4和7天3种不同浓度NAR（10、100和1 000 μmol·L^-1）单独作用以及分别与50 ng·mL^-1 BMP-2联合诱导对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响。同时在第4天和7天测定成骨细胞内ALP活性,采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测成骨相关基因ALP、OCN、Runx2、ColⅠ的表达。结果 单纯NAR刺激及联合BMP-2刺激能够促进细胞增殖,在NAR浓度为100 μmol·L^-1时达到高峰（P<0.05）,且该浓度NAR与BMP-2联合作用时增殖效果大于两者单独作用（P<0.05）。单纯NAR刺激及联合BMP-2刺激4 d和7 d时均能促进细胞ALP活性,100 μmol·L^-1 NAR与BMP-2联合作用时ALP活性最强（P<0.05）。100~1 000 μmol·L^-1的NAR单独及联合作用在不同程度上能促进ALP、OCN、Runx2、ColⅠ成骨相关基因表达。结论 NAR能有效促进成骨细胞株MC3T3-E1增殖、分化,且适宜浓度的NAR和BMP-2有协同和促进作用。     

牵张力促进BMSCs与VECs共培养体系成骨分化的体外研究

目的：研究牵张力对骨髓基质细胞（BMSCs）与血管内皮细胞（VECs）共培养体系成骨分化的作用及相关机制。方法分离培养大鼠原代BMSCs与VECs。应用Flexcell 5000加力系统,分别对BMSCs与VECs共培养组、BMSCs单独培养组和VECs单独培养组施加6%等轴循环牵张力。加力6、12、24和48 h后,利用实时定量PCR检测Runx2和血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA的表达量,ELISA法检测细胞培养上清液中VEGF的含量,碱性磷酸酶（ALP）半定量检测ALP活性。通过加入VEGF受体抑制剂Tivozanib,观察VEGF的旁分泌作用。采用SAS 8.0软件包对数据进行统计学分析。结果①加力6 h时,共培养体系Runx2 mRNA的表达量上调4.3倍(P<0.05);加力48 h时,ALP活性升高1.5倍(P<0.05)。②加力12 h时,共培养体系VEGF mRNA的表达量上调2倍(P<0.05),上清液中VEGF的含量增加10倍(P<0.05),BMSCs分泌大量VEGF,而VECs分泌极少量VEGF。③加入Tivozanib后,共培养组Runx2的表达量下调90%(P<0.05),ALP活性下调48%(P<0.05);而 BMSCs单独培养组Runx2的表达量和ALP活性分别下降30%和18%。结论牵张力促进BMSCs与VECs共培养体系中BMSCs的成骨分化,这种作用可能通过牵张应力诱导BMSCs分泌的VEGF以旁分泌方式由VECs作用于BMSCs来实现。     

浓缩生长因子提取液对钛片表面MC3T3-E1细胞增殖分化的影响

目的 探讨浓缩生长因子提取液（CGFe）对钛片表面MC3T3-E1细胞增殖分化的影响。方法 实验组使用含CGFe的α-MEM培养液（含10%胎牛血清）培养MC3T3-E1细胞,对照组则使用不含CGFe的α-MEM培养液（含10%胎牛血清）培养细胞。采用MTT法测定培养1、3、5 d时的细胞增殖情况,碱性磷酸酶（ALP）活性测定法检测培养3、5 d时的细胞分化情况;通过扫描电子显微镜（SEM）观察培养12 h时细胞在钛片表面的形态;通过荧光实时定量聚合酶链反应（PCR）测定细胞培养3、7 d时核心结合蛋白因子2（Runx2）和成骨细胞特异性转录因子Osterix（Osx）基因的相对表达量。结果 MTT结果显示：随培养时间延长,细胞数量逐渐增加;各时间点实验组细胞的吸光度值均明显高于对照组（P<0.05）。ALP活性随着培养时间延长而增加,两个时间点实验组的吸光度值均明显高于对照组（P<0.05）。SEM观察：培养12 h时,实验组细胞在钛片表面的形态较对照组更加伸展。PCR结果显示：随着培养时间延长,两组细胞Runx2和Osx基因的表达量逐渐增加,两个时间点实验组的表达量均明显高于对照组（P<0.05）。结论 CGFe能有效地促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化及在钛片表面的伸展。     

Dlx2在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的作用

目的:探讨Dlx2(distal-less homeobox 2)基因过表达对体外培养的小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1 向成骨方向分化的影响.方法:构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序验证.体外病毒转染MC3T3-E1后,以嘌呤霉素行抗性筛选稳定细胞株,以RT-PCR和Western印迹检测转染后细胞中Dlx2的表达.应用实时定量PCR(RT-PCR)检测Dlx2过表达对部分成骨相关基因(ALP、OCN、Runx2、Msx2)表达的影响.以碱性磷酸酶(ALP)活性测定和茜素红染色法检测Dlx2过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响.采用SAS 6.04软件包对数据进行随机设计的方差分析.结果:本实验成功构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序正确.体外转染后筛选出Dlx2稳定高表达细胞株MC3T3-E1-Dlx2,其mRNA和蛋白表达量显著高于对照组.在成骨诱导过程中,MC3T3-E1-Dlx2细胞ALP值在第4、7、14d均高于对照组细胞,茜素红染色显示实验组较对照组和空白组染色深.Dlx2过表达在成骨诱导早期能显著促进ALP和Msx2的表达(P<0.05),晚期则上调OCN表达(P<0.05),而Runx2表达无明显变化(P>0.05).结论:Dlx2过表达上调AIP、OCN等成骨相关基因的表达.促进MC3T3-E1细胞的成骨分化.     

miR-31-5p对牙髓干细胞HIF-1α/BNIP3信号通路及成骨相关因子表达的影响

目的: 探讨微小RNA-31-5p（miR-31-5p）对牙髓干细胞（DPSCs）低氧诱导因子1α（HIF-1α）/Bcl-2/腺病毒E1B 19-kDa相互作用蛋白3（BNIP3）信号通路及成骨相关因子表达的影响。方法: 体外培养人DPSCs,分为对照组（不转染）、mimic NC组（转染negative control-miR-31-5p）、miR-31-5p mimic组（转染hsa-miR-31-5p mimic）、siRNA NC组（转染nonsense siRNA）和miR-31-5p siRNA组（转染miR-31-5p siRNA）。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测各组DPSCs细胞中miR-31-5p、HIF-1α、BNIP3、碱性磷酸酶（ALP）、Runt相关转录子2（Runx2）mRNA的表达情况,MTT法检测各组DPSCs细胞增殖情况,ALP活性测定试剂盒检测各组DPSCs细胞ALP活性,蛋白印迹（WB）法检测各组DPSCs细胞中HIF-1α、BNIP3、Runx2蛋白的表达情况。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 与对照组、mimic NC组相比,miR-31-5p mimic组DPSCs细胞A值、ALP mRNA表达水平及活性、Runx2 mRNA及蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,ALP染色明显减弱,miR-31-5p mRNA、HIF-1α、BNIP3 mRNA及HIF-1α、BNIP3、Beclin1蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。与对照组、siRNA NC组相比,miR-31-5p siRNA组DPSCs细胞A值、ALP mRNA表达水平及活性、Runx2 mRNA及蛋白水平显著升高（P<0.05）,ALP染色明显增强,miR-31-5p mRNA、HIF-1α、BNIP3 mRNA及HIF-1α、BNIP3、Beclin1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。结论: miR-31-5p可以激活HIF-1α/BNIP3信号通路,抑制DPSCs细胞的成骨相关因子表达。     

多孔钛的骨传导性及其孔隙结构对MC3T3-E1细胞早期分化的影响

目的 探讨多孔钛的骨传导性及其孔隙结构对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1早期分化的影响.方法 碳酸氢铵造孔剂结合粉末冶金法制备6组由不同平均孔隙率及不同平均孔径组合的多孔钛试样,即AⅠ（43.1±0.7）％和（154.8±11.9） μm AⅡ：（40.9±1.5）％和（295.6±8.5） μm AⅡ （44.3±1.1）％和（560.4±25.6） μm;BⅠ：（53.3±1.2）％和（191.6±3.7） μm; BⅡ.（51.7±2.7）％和（303.8±8.2） μm; BⅢ：（49.9±3.9）％和（583.1±21.7） μm,Ta2级商业致密纯钛作为对照组;每组3个试样.MC3T3-E1细胞接种于24孔板3h贴壁后置入多孔钛试样,培养3d和5d后激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察经FITC微丝蛋白荧光探针标记的细胞.MC3T3-E1细胞接种于已置入试样的24孔板,培养7d和14d后测定碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,评价细胞的早期分化能力;培养21d后茜素红染色观察细胞晚期矿化结节.结果 MC3T3-E1细胞贴壁后,5d可长人多孔钛孔内及表面.7d和14d多孔钛组ALP活性显著高于对照组（P＜0.05）;其中BⅠ组在14d的ALP活性显著高于其它各组（P＜0.05）.21d多孔钛试样表面及孔隙内均可见钙结节形成.结论 在本实验条件下,多孔钛具有一定的骨传导性;平均孔隙率为53.3％且平均孔径为191.6 μm的多孔钛利于MC3T3-E1细胞的早期分化.     

miR-497-5p在前成骨细胞MC3T3-E1分化和矿化中的作用及机制探讨

目的：研究微小RNA(miR)-497-5p在前成骨细胞MC3T3-E1分化和矿化中的作用，并探讨其相关机制。方法：取第3代MC3T3-E1细胞，分别转染miR-497-5p过表达质粒miR-497-5p mimics、低表达质粒miR-497-5p inhibitor和阴性对照质粒miR-497-5p NC，设为miR-497-5p mimics组、miR-497-5p inhibitor组和miR-497-5p NC组。取不做处理的细胞作为空白组。成骨诱导后14天，检测碱性磷酸酶（ALP）活性；免疫印迹法检测成骨分化相关蛋白骨钙素（OCN）、I型胶原（COL-I）蛋白表达量；茜素红染色法观察矿化情况；免疫印迹法检测Smad泛素化调节因子2(Smurf2)蛋白表达量；双荧光素酶实验验证miR-497-5p与Smurf2的靶向关系。采用SPSS 25.0软件包进行统计学分析。结果：与空白组、miR-497-5p NC组相比，miR-497-5p mimics组ALP活性显著增强，OCN、COL-I蛋白表达量及矿化结节面积构成比显著升高，Smurf2蛋白表达量显著降低（P<0.05...     

小檗碱通过JNK信号通路调控大鼠脂肪干细胞成骨向分化

目的: 探讨小檗碱(C₂₀H₁₈NO₄)对大鼠脂肪干细胞(ADSCs)的成骨分化作用及其相关机制。方法: 以5、10、20 μmol/L浓度小檗碱培养液处理ADSCs,未处理组为对照组,通过MTT法检测细胞增殖活性,应用碱性磷酸酶（ALP）染色及半定量、钙结节染色分析小檗碱对ADSCs成骨分化的影响,采用Western 印迹法检测c-Jun 氨基末端激酶(JNK)的蛋白磷酸化水平及应用JNK通路抑制剂SP600125前、后成骨相关蛋白Runx2和OCN的表达水平。采用SPSS 22.0 软件包对数据进行统计学分析。结果: 5、10、20 μmol/L小檗碱处理大鼠ADSCs 1、3、7天后,细胞增殖活性无显著改变（P>0.05）;实验组ALP染色及茜素红染色均较对照组明显深染,实验组ALP蛋白分泌显著上调（P<0.05）。在10 μmol/L小檗碱培养液作用下,JNK蛋白磷酸化水平升高,实验组成骨相关蛋白Runx2和OCN表达升高;抑制JNK信号通路后,Runx2和OCN表达下调。结论: 小檗碱对ADSCs的增殖无影响,可通过激活JNK信号通路,上调脂肪干细胞的成骨分化效应。     

壳聚糖及其复合物对小鼠成骨细胞增殖及分化的影响

目的：用含壳聚糖(chitosan,CS)、Ⅰ型胶原蛋白和重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)的培养液体外培养成骨细胞MC3T3-E1,评价3种因素对成骨细胞增殖及分化的影响。方法：实验分为4组,实验组A：CSα-MEM培养基;实验组B：CS+Ⅰ型胶原蛋白溶液的α-MEM培养基;实验组C：CS +Ⅰ型胶原蛋白溶液+rhBMP-2溶液的α-MEM培养基。对照组为含1%FBS的α-MEM培养基。采用MTT法检测加入处理因素后1、3、5、7 d的吸光度(OD)值,并绘制细胞生长曲线,观察成骨细胞的增殖情况。采用碱性磷酸酶活性测定、碱性磷酸酶染色和茜素红钙结节染色观察成骨细胞的分化作用：检测加入处理因素后1、3、5、7 d的碱性磷酸酶活性,并在细胞培养的第7天进行碱性磷酸酶染色,第14天进行茜素红钙结节染色。采用SPSS13.0软件包对所得数据进行单因素方差分析,2组之间比较采用Post Hoc检验。结果：MTT检测结果显示,实验组C的OD值高于其他组,实验组C与其他组间的两两比较具有显著差异(P<0.05)。碱性磷酸酶活性测定结果显示,实验组C的活性高于其他组,实验组C与实验组A、对照组间两两比较具有显著差异(P<0.05),与实验组B两两比较无显著差异(P>0.05)。茜素红染色和碱性磷酸酶染色结果显示,实验组C可见更多的钙盐沉积,且蓝染颗粒多于其他组。结论：壳聚糖、Ⅰ型胶原蛋白和rhBMP-2共同作用,更能促进成骨细胞的增殖与分化。     

人脐带间充质干细胞与牙髓细胞体外共培养对细胞生物学的影响

目的: 研究人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs）与经骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）诱导后的人牙髓细胞（human dental pulp cells,hDPCs）共培养对细胞生物学特性的影响。方法: 分别取原代培养的hUCMSCs和hDPCs,分别通过流式细胞术、成骨诱导、成脂诱导以及免疫组织化学染色鉴定细胞;使用BMP2诱导hDPCs,14 d后检查其DSPP、ALP、DMP1的mRNA表达情况;按照1∶1、1∶5、5∶1的比例直接共培养hUCMSCs与经BMP2诱导后的hDPCs,实时定量PCR检测其DSPP、ALP、DMP1、OCN、VEGF、HGF、Nanog的mRNA表达情况。根据实时定量PCR结果选取1∶1组与单独培养hUCMSCs组、hDPCs组比较,分别培养21 d后进行茜素红染色,在酶标仪上于562 nm处检测沉淀物形成情况。采用SPSS21.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 直接共培养14 d后,1∶1细胞组的DSPP、ALP、DMP1、OCN、VEGF、HGF的mRNA表达量比单独培养的hUCMSCs组显著升高（P<0.05）,而Nanog mRNA表达量比单独培养的hUCMSCs组降低（P<0.05）。茜素红染色结果显示,1∶1组的OD值显著高于hUCMSCs组（P<0.05）。结论: 将hUCMSCs与经BMP2诱导后的hDPCs按照1∶1比例共培养,可以诱导细胞向成牙本质细胞方向分化,并促进血管生成因子的表达。