Mef2c真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的构建小鼠Mef2c基因真核表达质粒并转染HEK293T细胞。方法采用RT-PCR方法从小鼠心脏组织的总cDNA中扩增出小鼠的Mef2c的基因,采用基因重组技术将Mef2c的cDNA片段插入真核表达载体peD—NA3．1（＋）,构建小鼠Mef2c真核表达质粒,脂质体转染HEK293T细胞进行表达。结果酶切和测序结果证实Mef2c真核表达质粒构建成功,经脂质体转染293T细胞后,Western blot检测证明Mef2c蛋白在真核细胞中成功表达。结论成功构建真核表达质粒pcDNA3．1（＋）．Mef2c,为进一步研究小鼠Mef2c在心肌分化过程中的作用及其调控机制奠定了实验基础。     

小鼠β防御素1与甲型流感病毒M2e融合基因表达及其免疫特性研究

目的构建mBD1与M2e融合基因的真核表达载体,并检测其在MDCK细胞中的表达情况,初步探讨其免疫特性。方法利用PCR方法分别扩增mBD1与M2e基因片段,再通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)将mBD1与M2e通过一段多肽接头Gly4Ser连接为融合基因mBD1-M2e。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)获得重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD1-M2e,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,用脂质体转染MDCK细胞,通过免疫荧光、RT-PCR产物序列分析检测融合蛋白表达情况,最后采用MTT法检测mBD1-M2e融合蛋白刺激淋巴细胞增殖能力。结果经鉴定后证实构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD1-M2e正确,该重组质粒能在MDCK细胞中稳定表达,该细胞培养上清液能刺激淋巴细胞增殖。结论本研究成功构建mBD1-M2e融合基因的真核表达质粒,并证实其融合蛋白能在MDCK细胞中稳定表达,这一结果为进一步研究新型高效通用的流感病毒核酸疫苗奠定了坚实的基础。     

甲型流感病毒NP基因真核载体的构建及初步表达

目的构建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)NP基因的真核表达载体,转染HEK293细胞,检测其表达情况。方法采用RT-PCR技术克隆甲型流感病毒株NP基因,将克隆的片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切、PCR和测序鉴定后,构建好的pcDNA3.1(+)/NP用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过免疫荧光技术检测其目的蛋白的瞬时表达。结果RT-PCR扩增到NP基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染HEK293后经免疫荧光技术检测到目的蛋白的表达。结论本实验构建的甲型流感病毒NP部分基因序列的真核表达载体,为深入研究流感病毒核衣壳蛋白和有效的核酸疫苗奠定了基础。     

GFP基因真核表达质粒的构建及其在人胚肾293细胞中的表达

目的 克隆绿色荧光蛋白（GFP）基因并构建真核表达载体，观察其在人胚肾293（下称293细胞）细胞中的表达和分布，为制备自行设计的以λ噬菌体为载体的人类免疫缺陷病毒（HIV）核酸疫苗的阳性对照奠定基础。方法 以克隆好的pUC18／GFP为模板，根据Genbank中GFP的核苷酸序列设计引物，并在引物的5′端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点，特异性扩增GFP基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒，再经双酶切、连接构建含GFP编码基因的真核表达载体，酶切鉴定分析后，将该重组质粒通过脂质体介导，转染293细胞。荧光显微镜观察GFP在细胞内的表达和分布。结果重组质粒经Barn HⅠ、XhoⅠ双酶切成5．4kb与0．7kb的片断，表明表达载体pcDNA3．1（＋）中插入了GFP基因片断，测序结果表明编码框正确，并在293细胞中获得了表达，分布均匀。结论 pcDNA3．1（＋）／GFP真核表达载体已成功构建，并可在293细胞中表达。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA2真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA2的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA2引物，运用PCR方法扩增其基因片段，经克隆至pMDl8-T载体后，亚克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（-）而构建重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2。脂质体法将构建的重组质粒转染HFF细胞，RT—PCR法检测转染细胞中GRA2的表达情况。结果PCR扩增GRA2基因序列正确，构建的重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2经PCR、EcoRⅠ／HindⅢ双酶切和测序鉴定正确；转染GRA2基因的细胞，RT—PCR可见目的条带。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3．1-GRA2，为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

pEGFP?N1?HBsAg?ROP2多基因重组表达质粒的构建及表达鉴定

目的 构建pEGFP?N1?HBsAg?ROP2重组质粒,并转染HEK293T细胞进行表达鉴定,为弓形虫病核酸疫苗的研制奠定基础。 方法 根据HBsAg基因序列和pcDNA3?p30?ROP2重组质粒酶切位点设计引物,PCR扩增HBsAg基因,经酶切、连接、转化,利用HBsAg基因替换p30基因,构建pcDNA3?HBsAg?ROP2重组质粒;经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,将HBsAg?ROP2片段与pEGFP?N1真核表达载体相连,构建pEGFP?N1?HBsAg?ROP2重组表达质粒,转染HEK293T细胞,观察其蛋白表达水平。结果 HBsAg片段PCR产物约700 bp,与理论值相符;构建pcDNA3?HBsAg?ROP2重组质粒,双酶切电泳后得到约5.4 kb和1.9 kb的两条带,与预期结果相符。pEGFP?N1?HBsAg?ROP2双酶切后产生约4.7 kb和1.9 kb的条带,经测序鉴定,与GenBank发表的序列同源性为99.84%。目的基因已成功转染入HEK293T细胞中,且正确表达,蛋白浓度为3.08 mg/ml。结论 成功构建pEGFP? N1?HBsAg?ROP2重组表达质粒,转染HEK293T细胞能正确表达。     

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及序列分析

目的 构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体并分析插入的M2基因序列。方法从接种人流感病毒株A／PR／8／34（H1N1）的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA，用特异引物进行RT-PCR，扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段克隆入真核表达质粒载体pcDNA3．1（＋）。经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的M2基因序列进行分析。结果经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。序列分析有4个氨基酸出现变异，提交Genbank进行Blast比对显示同源性97％（Genbank／NCBI AY768951）。结论M2四聚体蛋白具有H^＋通道功能，能够协助病毒与宿主细胞膜融合后释放RNP复合体，还能稳定HA蛋白的结构。M2蛋白的高度保守性和具有交叉保护能力特性使之成为新型的通用流感疫苗的突破口。该结果将为甲型流感病毒基因工程疫苗，通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。     

结核分枝杆菌新抗原Mtb8.4基因的克隆与真核表达

目的克隆结核杆菌新抗原Mtb8．4基因，导入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建成重组质粒pcDNA3．1（＋）-Mtb8．4，并在真核细胞中进行表达。方法提取人结核杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR扩增，获得Mtb8．4目的基因后，与pcDNA3．1（＋）载体进行连接重组，用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定；重组质粒转染COS-7细胞48k后，用RT-PCR方法鉴定Mth8.4在转录水平的表达情况。结果pcDNA3．1（＋）．Mth8．4真核表达载体构建成功；转染COS-7细胞后，Mtb8．4在转录水平成功表达。结论pcDNA3．1（＋）-Mtb8．4真核表达质粒的构建成功以及Mtb8．4在COS-7细胞中的成功表达，为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA3．1（＋）-Mtb8．4DNA疫苗奠定了基础。     

钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的构建钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL21基因片段的真核表达重组质粒．利用脂质体体外转染HeLa细胞，探讨其在体外真核细胞中的表达情况，为寻找新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子提供实验依据。方法应用PCR技术从钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增lipL21基因，纯化回收后克隆入pUCM-T载体，再亚克隆入真核表达载体poD-NA3．1（＋），运用脂质体2000将重组体pcDNA3．1（＋）-lipL21转染入HeLa细胞，细胞免疫组化法观察目的基因的表达。结果双酶切及测序鉴定证明成功构建了lipL21真核表达重组体pcDNA3．1（＋）-lipL21，DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。重组质粒pcDNA3．1（＋）-lipL21体外在HeLa细胞中能有效表达目的蛋白LipL21。结论成功构建了钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-lipL21，且能够在体外真核细胞中表达；为进一步筛选新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子奠定了一定的实验基础。     

带有HA标签的HBc蛋白真核表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的构建带有流感病毒血凝素9钛表位标签（HA标签）的乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（HBc）的表达质粒,为进一步研究HBe蛋白基因的功能奠定实验基础。方法设计并合成扩增HBc蛋白全长的PCR引物,以野生型的HBV质粒pDolTHBV-1为模板,PCR扩增全长的HBc蛋白,大小为563bp;PCR产物经过Eco砒和XholI酶切后,与线性化的pcDNA3／HA载体连接后转化大肠杆菌,扩增、纯化获得所需质粒,以琼脂糖凝胶电泳、酶切鉴定以及基因测序鉴定其分子质量和插入片段的序列;构建的质粒转染HEK293细胞48h后,RIPA裂解细胞,Western blot检测HBc蛋白表达。结果纯化质粒的相对分子质量为5．9kb,酶切鉴定结果符合目的条带（563bp）大小,插入的寡核苷酸序列与野生型HBV基因序列完全相符,表达的融合蛋白大小为28kDa。结论成功构建了带有HA标签的HBc蛋白的真核表达质粒pcDNA3／HA—HBc蛋白,为进一步研究HBe蛋白的功能奠定了良好的实验基础。     

嗜肺军团菌flaA基因DNA疫苗的构建及其免疫保护性研究

目的构建flaA基因的DNA疫苗,观察其对嗜肺军团菌感染的免疫保护作用。方法用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a-flaA上切下flaA基因,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-flaA。将18只BALB/c雌性小鼠随机分为3组,pcDNA3.1-flaA实验组肌肉接种pcDNA3.1-flaA质粒100μg,2w后加强免疫一次,2个对照组分别肌肉注射等体积的生理盐水和100μg空质粒,加强免疫后3w小鼠鼻腔滴注嗜肺军团菌Lp1菌液进行攻击感染,感染4w后,检查小鼠肺组织带菌量,观察肺组织病理形态学改变。结果成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1-flaA,攻击感染实验表明,pcDNA3.1-flaA免疫组肺组织带菌量显著少于生理盐水对照组和空质粒对照组(P<0.05),且肺组织病理变化症状较pcDNA3.1对照组和生理盐水对照组的肺轻微。结论由flaA基因构建的嗜肺军团菌DNA疫苗能诱导小鼠产生保护性免疫。     

甲型H1N1流感病毒HA基因与沙门菌fljB基因的融合表达与鉴定

目的 研发基于鞭毛蛋白的新型甲型H1N1流感疫苗。方法 分别以鼠伤寒沙门菌SL7202基因组和含有甲型H1N1流感病毒HA基因的重组质粒pET-HA为模板, 通过 PCR扩增Ⅱ相鞭毛蛋白fljB和HA1-2基因,再通过overlap PCR将这两基因片段拼接成HA1-2-fljB,将其插入原核表达质粒pET30a(+),构建重组质粒pET-HA1-2-fljB,并转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3) 中,以 IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定融合蛋白HA1-2-fljB的表达。结果 正确构建出重组质粒pET-HA1-2-fljB,SDS-PAGE和Western blotting结果显示,融合蛋白分子量约94 KD,并具有良好的免疫反应性,能强烈诱导HEK293-mTLR5细胞分泌IL-8。结论 成功表达具有TLR5生物学活性的融合蛋白HA1-2-fljB, 为研究甲型H1N1流感疫苗奠定了基础。     

辅助性T细胞表位HBV表面抗原融合基因真核表达质粒的构建

为提高HBVDNA疫苗的免疫效率，将一个通用型辅助性T细胞表位基因引入HBV表面抗原基因的5‘末端，构建成真核表达质粒。PCR方法合成PADRE-HBsAg目的基因，产物与pMDl8T载体连接，经Hind Ⅲ，EcoR Ⅰ双酶切，再克隆入真核表达载体pcDNA3．1( )。酶切及测序鉴定，该真核表达载体构建成功，为进一步观察其特异性细胞和体液免疫反应奠定了基础。