人胰岛素样生长因子1的真核细胞表达及其鉴定

目的 构建人胰岛素样生长因子１（ＩＧＦ－１）的真核细胞表达质粒。方法 用ＰＣＲ方法从人的肝细胞ｃＤＮＡ文库中克隆出ＩＧＦ－１ｃＤＮＡ,然后定向插入真核细胞表达载体ｐｃＤＮＡ３中,并用脂质体方法转染ＣＯＳ７细胞。用ＥＬＩＳＡ法和人胚肺纤维母细胞以及ＮＩＨ３Ｔ３纤维细胞增殖法分别测定转染细胞上清液中ＩＧＦ－１的含量和生物活性。结果 重组的真核细胞表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＩＧＦ－１所含的ＩＧＦ－１ｃＤＮＡ序列和插入方向均正确,其转染的ＣＯＳ７细胞分泌较高浓度的ＩＧＦ－１,并且具有明显促进纤维细胞增殖的能力。结论 本实验所构建的重组真核细胞表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＩＧＦ－１能够高效表达有活性的ＩＧＦ－１,对进一步研究ＩＧＦ－１体内表达的生理和病理作用有一定意义。     

戊型肝炎病毒中国株结构区ORF2 cDNA的克隆及表达

将戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）中国株结构区第二开放读码框架（ＯＲＦ２）８３７ｂｐ ｃＤＮＡ片段插入ｐＧＥＸ１λＴ质粒中进行表达。经免疫吸印法证明，该质粒表达的融合蛋白具有识别抗－ＨＥＶ的抗原表位，可用于制备抗－ＨＥＶ检测试剂。     

一种快速简便的缺失突变方法

为了构建能表达稳定的、不易降解的ＴＭ－ＴＮＦ突变体（ＴＭ－ＴＮＦｍ）的基因，本文用改良的Ｓ－ＰＣＲ和ＯＥ－ＰＣＲ两种定位突变技术，成功地构建了缺失３６个碱基的ｐＢＳＫ－ＴＭ－ＴＮＦ突变重组体。与ＯＥ－ＰＣＲ技术（用两对引物进行两次ＰＣＲ反应）相比较，Ｓ－ＰＣＲ技术（用一对引物做一次ＰＣＲ反应）具有快速、经济、简便等优点，但其突变率较ＯＥ－ＰＣＲ低。     

大肠癌表皮生长因子受体和p53蛋白表达与临床病理特？…

为了研究大肠癌表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）和ｐ５３蛋白表达与病理特征和预后的关系，应用免疫组化检测ＥＧＦＲ和ｐ５３在６１例大肠癌中的表达，结果提示：正常大肠粘膜未发现ＥＧＦＲ和ｐ５３阳性表达，而两者在大肠癌均有较高表达（７７．０４％和５５．７５％）。ＥＧＦＲ表达与大肠癌Ｄｕｋｅｓ分期有关（Ｐ〈０．０５）。ｐ５３表达与大肠癌分化程度及Ｄｕｋｅｓ分期有关（Ｐ〈０．０５）。大肠癌生存率随ＥＧＦＲ和ｐ５３     

TA克隆及双链DNA：测序：介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法

将人酸性纤维母细胞生长因子’（ａＦＧＦ’）ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物以ＴＡ连接方式克隆入ｐＣＲ￣（ＴＭ）ＩＩ质粒，然后采用Ｔ７和Ｓｐ６启动子特异性引物对克隆的片段以双脱氧未端终止法进行双链ＤＮＡ测序。结果表明这项技术是一种快捷而可靠的克隆及分析ＰＣＲ产物的方法     

Heymann肾炎致病原受体相关蛋白在大肠杆菌中的表达

为研究Ｈｅｙｍａｎｎ肾炎致病原的病理表型和免疫复合物形成机理，应用ＤＮＡ重组技术，将Ｈｅｙｍａｎｎ肾炎（ＨＮ）致病原受体相关蛋白（ＲＡＰ）的ｃＤＮＡ克隆到表达质粒ｐＧＥＸ中，构建重组表达质粒ｐＧＥＸ－Ｒ９３，经限制性内切酶图谱分析，ＤＮＡ测序，鉴定插入子ＲＡＰ－ｃＤＮＡ正确克隆到ｐＧＥＸ表达框架后，转化大肠杆菌ＤＨ５α，经ＩＰＴＧ诱导，高效表达了谷胱甘肽巯基转移酶－受体相关蛋白（ＧＳＴ－ＲＡＰ）融合蛋白，蛋白产量占大肠杆菌总蛋白量的３９．４％。经ＧＳＴ－Ｓｅｐｈｏｓｅ４Ｂ亲和层析得到高度纯化的ＧＳＴ－ＲＡＰ。免疫印迹分析证明，针对ＧＳＴ－ＲＡＰ的抗血清能特异地识别肾皮质天然抗原４４０００α蛋白，免疫组化分析显示ＧＳＴ－ＲＡＰ抗血清特异性识别大鼠肾近曲小管刷状缘抗原。     

Heymann肾炎致病原受体相关蛋白羧基端多肽表达的研究

本研究中，用ＰＣＲ方法扩增了受体相关蛋白基因第６３３～９５７碱基ｃＤＮＡ片段。将编码成熟分子量为４４×１０３受体相关蛋白和羧基端１０８氨基酸多肽的ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１内，限制性图谱分析测定了插入子的方向并用ＤＮＡ序列分析加以证实。带有质粒ｐＧＥＸ－Ｒ９３（包含完全ＲＡＰｃＤＮＡ９５７碱基）的重组菌过度表达了分子量为６５×１０３融合蛋白，其含量占总蛋白的３９．４％。带有质粒ｐＧＥＸ－Ｒ３５（包含ＲＡＰｃＤＮＡ３２４碱基）表达了４０×１０３的融合蛋白，蛋白含量３２．２％。通过谷胱甘肽亲和层析柱，从细菌溶解物中纯化了融合蛋白，每升培养物能纯化到１０～２０ｍｇ的蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证明抗Ｒ９３和抗Ｒ３５两种抗血清特异性结合到大鼠肾皮质微绒毛提取物中的４０×１０３的带。间接免疫荧光显示抗Ｒ９３和抗Ｒ３５两种抗体标记肾近曲小管刷状缘抗原。文中对表达的受体相关蛋白的意义和其抗原性进行了讨论。     

大肠癌表皮生长因子受体和p53蛋白表达与临床病理特征和预后的关系

为了研究大肠癌表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）和ｐ５３蛋白表达与病理特征和预后的关系，应用免疫组化检测ＥＧＦＲ和ｐ５３在６１例大肠癌中的表达。结果提示：正常大肠粘膜未发现ＥＧＦＲ和ｐ５３阳性表达，而两者在大肠癌均有较高表达（７７．０４％和５５．７５％）。ＥＧＦＲ表达与大肠癌Ｄｕｋｅｓ分期有关（Ｐ＜０．０５）。ｐ５３表达与大肠癌分化程度及Ｄｕｋｅｓ分期有关（Ｐ＜０．０５）。大肠癌生存率随ＥＧＦＲ和ｐ５３表达增高而降低，其中两者４年生存率＞６５％表达组均明显低于＜２５％组（Ｐ＜０．０５），ＥＧＦＲ－ＬＩ和ｐ５３－ＬＩ与生存期均有明显负相关。结果表明：ＥＧＦＲ和ｐ５３表达与大肠癌的进展程度有关，该两项指标对大肠癌临床诊治和预后的评估有重要价值。     

胶质瘤增殖活性和肿瘤基因蛋白表达及其意义

目的探讨胶质瘤增殖活性和肿瘤基因蛋白表达与分化和预后间的关系。方法应用免疫组化和图像分析技术对１２４例脑胶质瘤增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）和几种肿瘤基因蛋白进行定性、定量研究。结果ＰＣＮＡ反应强度与级别和预后显著相关;ｃ－ｅｒｂＢ－２蛋白表达在分化程度高的胶质瘤强于分化程度低者,存活５年以上的病例阳性强于存活５年以下者。ＥＧＦ（４０．０％）、ＥＧＦＲ（９１．４％）和ｐ２１ｒａｓ（５３．３％）与分级和预后无显著关系。３种ｐ５３蛋白抗体阳性率均以Ⅱ～Ⅳ级胶质瘤为高;ｐ５３与ＰＣＮＡ反应强度平行。结论ｐ２１ｒａｓ、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＥＧＦ和ＥＧＦＲ改变在胶质瘤发生、发展过程中可能是早期事件,恶变后不再随级别增加而加重,而ｐ５３基因突变涉及胶质瘤发展各个阶段;ＰＣＮＡ能较好地反映胶质瘤的恶性程度。     

抗菌肽MagaininⅡ单链抗体基因的构建及其表达

目的 将克隆的抗体轻重链可变区基因拼接成单链抗体基因并将其在大肠杆菌中表达。方法 通过ＲＴ－ＰＣＲ从两株抗ＭａｇａｉｎｉｎⅡ杂交瘤细胞株（２Ｄ１,３Ｆ８）中克隆出ＶＨ和ＶＬ基因,然后利用重组ＰＣＲ技术,将ＶＨ和ＶＬ基因通过柔性肽段（ＧＬＹ４Ｓｅｒ）３的Ｌｉｎｋｅｒ拼接成单链抗体基因（ＳｃＦｖ）,将ＳｃＦｖ克隆到表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ上并将其分别在大肠杆菌Ｅ．ｃｏｋｉ ＨＢ２１５１及ＴＧ１中进行     

以Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统表达人FGF-9

目的：在Ｂａｃｍｉｄ－杆状病毒－昆虫细胞系统中表达人ＦＧＦ－９。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,自新鲜人脑胶质瘤组织获取人ＦＧＦ－９全编码区ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＣＲ＾ＴＭⅡ质粒及ｐＹＥＸ４Ｔ－１真核表达质粒,经ＤＮＡ自动测序仪进行ＤＮＡ序列测定。将人ＦＧＦ－９ｃＤＮＡ定向克隆入ｐＦａｓｔＢａｃ质粒,进一步将其转座入Ｂａｃｍｉｄ中,在昆虫细胞Ｓｆ９中进行表达,采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对表达产物进行分析。     

4型腺病毒载体的构建和β—半乳糖苷酶基因的表达

以４型腺病毒疫苗株感染Ａ５４９细胞，提取病毒ＤＮＡ，将ＥｃｏＲＩ消化的Ｄ片段克隆入ｐＵＣ１８质粒，得ｐＡｄ４质粒，质粒ｐＡｄ４和ｐＡｄ４Ｃ１－２５经酶切、系列亚克隆、加接头等方法得到大部分和部分缺失Ｅ３区的重组质粒。聚合酶链反应（ＰＣＲ）法获得ｐｏｌｙ（Ａ），构建约８００ｂｐ腺病毒晚期表达盒，在所构宾腺病毒重组质粒Ｅ３缺失区或Ｅ４与ＩＴＲ间插入表达盒，得到可同时表达２个或２个以上外源基因和保留了Ｅ     

登革2型病毒NGC株E基因在NIH3T3细胞中的表达？…

目的 构建登革２型病毒Ｅ基因的真核表达载体,实现登革病毒Ｅ蛋白的真核表达。方法 采用逆录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增登革２型病毒（ＮＧＣ株）包膜糖蛋白Ｅ基因全长片段,克隆人真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的Ｐｃｍｖ启动子下游,构建重组真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｅ,用脂质体转染法转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,表达产物以免疫荧光、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹进行分析检测。结果 成功构建了重组真核表达质粒ｐｃＤＮ     

BPI23-Fcγ1重组融合蛋白在E.coli中的表达

目的 构建ｐＢＶ－ＢＰＩ６００－Ｆｃγ１７００重组表达载体,转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１抗菌重组蛋白。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从ＨＬ－６０细胞和正常人白细胞ｍＲＮＡ中扩增编码ＰＢＩ２３和ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｆｃγ１）的基因;通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体;转化感受态Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α细胞,通过温控诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１重组蛋白。结果 （１）ＲＴ－ＰＣＲ     

转化生长因子-α、表皮生长因子受体与胃癌发生的关系及其与增殖细胞核抗原的相关性分析

目的研究在胃癌发生的不同阶段转化生长因子－α（ＴＧＦ－α）、表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）的表达情况及与增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）表达的关系。方法应用免疫组化ＬＳＡＢ法。结果（１）ＴＧＦ－α在癌周正常粘膜、肠化生组织中的表达明显高于非癌正常粘膜及肠化生（Ｐ＜０．０１）。（２）ＥＧＦＲ在肠化生、不典型增生粘膜表达较正常、癌组织明显升高（Ｐ＜０．０１）。（３）ＴＧＦ－α、ＥＧＦＲ共同表达常伴不典型增生。（４）ＴＧＦ－α、ＥＧＦＲ表达与ＰＣＮＡ表达有明显的相关性。（５）ＴＧＦ－α、ＥＧＦＲ、ＰＣＮＡ表达与肿瘤外侵、淋巴结转移无关。结论ＥＧＦＲ／ＴＧＦ－α是胃癌前病变的一项有意义的标志，结合ＰＣ－ＮＡ监测高危人群可能有助于发现早期胃癌。     

HCV5′NCR片段调控荧光素酶表达质粒的构建及其在H …

目的 构建ＨＣＶ５′ＮＣＲ片段调控荧光素酶表达质粒,并在ＨｅｐＧ２细胞中表达。方法 ＰＣＲ扩增,获得中国人ＨＣＶ基因组５′非编码区（ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ,ＮＣＲ）完整序列与Ｃ区部分序列的目的基因片段（５′ＮＣＲ－Ｃ片段）。将此片段插入ｐＧＬ３荧光素酶报告载体蝗荧光素酶基因起始密码上游,构建受５′ＮＣＲ片段调控的荧光素酶表达质粒。应用脂质体介导基因转染技术将８个质粒转染ＨｅｐＧ２肝癌细胞     

甲状腺乳头状腺癌中EGFR、nm23-H1和p53蛋白的表达

目的：探讨 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ、ｎｍ２３ Ｈ１ 及ｐ５３ 蛋白在甲状腺乳头状腺癌中的表达及其与淋巴结转移的关系。方法：应用免疫组化 Ａ Ｂ Ｃ 法检测３６ 例有颈淋巴结转移的甲状腺乳头状腺癌的原发灶与转移灶和４０ 例无转移的甲状腺乳头状腺癌中 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ、ｎｍ２３ Ｈ１ 及ｐ５３ 蛋白的表达。结果：７６ 例甲状腺乳头状腺癌的 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ、ｎｍ２３ Ｈ１ 及ｐ５３ 蛋白的阳性表达率分别为５５３ ％ 、６０５ ％ 和１１８ ％ ;但有转移的甲状腺乳头状腺癌的 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 阳性表达率高于无转移者（ Ｐ＜ ００５） ,且转移灶的 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 阳性率明显高于其原发灶（ Ｐ＜ ００５） ;有转移的甲状腺乳头状腺癌的ｎ ｍ２３ Ｈ１ 阳性率低于无转移癌者（ Ｐ＜ ００１） ;甲状腺乳头状腺癌中 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 的阳性表达与ｎ ｍ２３ Ｈ１ 的表达有负相关（ Ｐ＜ ００１） 。结论：甲状腺乳头状腺癌 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 的过表达,ｎｍ２３ Ｈ１ 的低表达,二者表达的失平衡是其易于淋巴结转移的原因之一, Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ,ｎｍ２３ Ｈ１ 联用可作为甲状腺乳头状腺癌淋巴结转移的评价指标。     

p53、c-erbB-2、PCNA和EGFR在膀胱癌中过表达及其意义

目的：研究癌基因和抑癌基因蛋白产物在膀胱移行细胞癌中异常表达与病理分级、临床分期、复发和预后的关系。方法：应用免疫组化Ｓ－Ｐ法检查１１７例膀胱移行细胞癌组织中ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＰＣＮＡ和ＥＧＦＲ的表达水平。结果：１１７例膀胱移行细胞癌中ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＰＣＮＡ和ＥＧＦＲ阳性表达率分别为４７．０％、２９．９％、５３．８％和４８．７％。ｐ５３和ＰＣＮＡ阳性表达产物定位于肿瘤细胞核内，ｃ－ｅｒｂＢ－２阳性表达产物定位于细胞膜上，ＥＧＦＲ阳性表达产物定位于细胞膜或细胞浆内。结果表明ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＰＣＮＡ和ＥＧＦＲ异常表达与膀胱癌的分级、分期、复发及术后生存率等之间有统计学意义。结论：ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＰＣＮＡ和ＥＧＦＲ异常表达有助于评估膀胱癌预后，多基因异常表达作为预后评价指标更有意义。     

GST-人可溶性成纤维细胞生长因子受体1融合蛋白在酵母细胞中的表达及活性测定

目的：表达重组人可溶性成纤维细胞生长因子受体１（ｓｏｌｕｂｌｅ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１，ｓＦＧＦＲ１），研究其对成纤维细胞生长因子（ＦＧＦ）生物学活性的拮抗作用。方法：采用逆转录－ＰＣＲ（ＰＴ－ＰＣＲ）技术自人肺成纤维细胞获得ｓＦＧＦＲ１　ｃＤＮＡ，测序确证后，将其克隆人酵母细胞表达载体ｐＹＥＸ４Ｔ－１；重组质粒转化入酵母细胞（ＤＹ１５０）中进行诱导表达，表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及 Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ鉴定。利用 ＮＩＨ３Ｔ３细胞增殖抑制实验检测重组人 ｓＦＧＦＲ１的生物学活性。结果：经 ＣｕＳＯ４诱导，酵母细胞表达出重组谷胱苷肽转移酶（ＧＳＴ）－ｓＦＧＦＲ１融合蛋白，此蛋白在凝胶上表现为 １条约 ６０ｋＤ的阳性区带，在 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验中可被ＧＳＴ特异性抗体识别。重组ＧＳＴ－ｓＦＧＦＲ１融合蛋白的粗提物在体外能够桔抗ＦＧＦ介导的促ＮＩＨ３Ｔ３细胞增殖的活性。结论：重组ＧＳＴ－ｓＦＧＦＲ１融合蛋白在酵母表达系统中得到有效表达，并具有很好的生物活性。     

Epstein-Barr病毒载体介导的白细胞介素12在肝癌细胞中的靶向表达

目的研究白细胞介素－１２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２，ＩＬ－１２）在肝癌细胞靶向性表达，探索肝癌基因治疗新方法。方法将白介素－１２分别克隆到带有人甲胎蛋白启动子和增强子的Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ（ＥＢ）病毒载体中，得到重组表达载体ｐＥＢＡＦ／Ｐ３５和ｐＥＢＡＦ／Ｐ４０，分别在４种细胞系中作共转染，用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测各细胞系中ＩＬ－１２的表达情况。结果用ｐＥＢＡＦ／Ｐ３５和ｐＥＢＡＦ／Ｐ４０共转染４种细胞后ＩＬ－１２基因只在产生甲胎蛋白的肝癌细胞（ＨｅｐＧ２）中表达，活性检测证明，表达的ＩＬ－１２有诱使ＩＦＮ－γ产生的生物学活性。结论本研究在肝癌细胞中靶向性和组织特异性的表达了有活性的ＩＬ－１２，为既能杀死肝癌细胞，又不影响正常肝细胞功能的新型基因治疗方案做了有益的探索。