核仁素在血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化中的作用

目的:探讨核仁素在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化中的作用。方法:以AngⅡ诱导大鼠VSMCs表型转化为模型,观察AngⅡ对VSMCs表型转化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、钙调理蛋白(calponin)、平滑肌蛋白22α(SM22α)和骨桥蛋白(OPN)mRNA和蛋白表达的影响,并观察VSMCs表型转化时核仁素mRNA和蛋白的时空表达模式;进一步采用核仁素基因转染及RNA干扰技术观察核仁素对上述VSMCs表型转化标志物mRNA和蛋白表达的影响。结果:不同浓度的AngⅡ刺激VSMCs不同时间后,VSMCs收缩表型标志物α-SMA、calponin和SM22α的mRNA和蛋白表达逐渐减少,而合成表型标志物OPN的mRNA和蛋白表达逐渐增加(P0.05);不同浓度AngⅡ刺激VSMCs不同时间后,随着时间和剂量增加,核仁素的mRNA和蛋白表达在一定程度上逐渐升高;AngⅡ可诱导核仁素从细胞核向细胞浆移位;核仁素过表达可促进Ang II诱导的VSMCs表型转化,核仁素表达下调后,其促进表型转化作用被解除。结论:核仁素具有促进Ang II诱导的VSMCs表型转化的作用,核仁素的表达上调和移位参与Ang II诱导的VSMCs表型转化。     

大豆异黄酮对大鼠血管平滑肌细胞增殖和表型转化的影响

目的:观察大豆异黄酮对大鼠血管平滑肌细胞增殖和表型转化的影响。方法:采用酶消化法原代培养大鼠血管平滑肌细胞,传至第3～6代,加入含不同浓度(0、0.1、0.2、0.4、0.8μmol/L)大豆异黄酮的DMEM培养基作用24 h,采用MTT法检测大鼠血管平滑肌细胞增殖率,采用RT-PCR法检测平滑肌22α(SM22α)mRNA、骨桥蛋白mRNA的表达,采用Western blot法检测SM22α、骨桥蛋白的表达。结果:0.1～0.8μmol/L的大豆异黄酮随浓度增加其抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用增强(P<0.05);SM22αmRNA及SM22α蛋白表达增加,骨桥蛋白mRNA及骨桥蛋白表达降低,各组间有明显差异(P<0.05)。结论:大豆异黄酮抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖,同时使大鼠血管平滑肌细胞从合成表型向收缩表型转化。     

降钙素基因相关肽对血管平滑肌表型转化和增殖的影响

目的 探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化和增殖的影响以及它们之间的关系.方法 取大鼠主动脉先体外培养8d后再贴块培养(VSMCs);对照组直接用贴块法培养细胞.实验分为CGRP作用组和无CGRP作用组.用5-BrdU标记平滑肌细胞增殖变化;RT-PCR检测HRG-1和SM22α表达变化.结果 血管经体外培养8d后再贴壁培养的平滑肌细胞可见大量棕黄色标记增殖的细胞核,HRG-1和SM22α mRNA表达明显减少;而CGRP作用组标记的血管平滑肌增殖细胞明显减少,HRG-1和SM22α mRNA表达明显上调.结论 CGRP对VSMCs增殖有抑制作用并同时可使VSMCs从合成型向收缩型转化.     

27nt-miRNA对血管平滑肌细胞SM22α表达的调节及其对细胞活力、迁移和表型改变的影响

目的:探讨27nt-微小RNA(27nt-miRNA)对血管平滑肌细胞(VSMCs)中平滑肌22α蛋白(SM22α表达的调节及其对细胞活力、迁移和表型改变的影响。方法:构建27nt-miRNA高表达、反义序列(anti-27nt-miRNA)以及阴性对照的表达质粒,经慢病毒包装后分别转染大鼠原代VSMCs,加入血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)诱导VSMCs表型转换。MTT实验检测细胞活力,划痕实验检测细胞迁移能力,RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学染色法检测细胞中SM22α的mRNA和蛋白表达情况。结果:与正常组相比,PDGF-BB组的细胞活力上升(P 0.05)、迁移能力上升(P 0.05),SM22α的mRNA及蛋白表达量下降(P 0.05);与阴性对照慢病毒组相比,27nt-miRNA高表达组的细胞活力下降(P 0.05),迁移能力下降(P 0.05),SM22α的mRNA及蛋白表达量明显升高(P 0.05);而anti-27nt-miRNA组细胞的细胞活力上升(P 0.05),迁移能力上升(P 0.05),SM22α的mRNA及蛋白表达量下降(P 0.05)。结论:27nt-miRNA促进SM22α表达,同时抑制VSMCs的活力及迁移,并有可能抑制VSMCs从收缩型转变为合成型。     

去甲肾上腺素对大鼠血管平滑肌细胞表型转化和骨架蛋白表达的影响

目的研究去甲肾上腺素(NE)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化与骨架蛋白表达之间的关系,探讨神经因素对VSMC调控作用。方法体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,分为血清对照组(control)、NE+血清培养组、血清饥饿组、NE+血清饥饿组。RT-PCR检测表型基因SM22 α mRNA的表达,免疫荧光方法检测细胞骨架蛋白F-actin的表达。结果与血清培养相比,血清饥饿上调SM22 α表达水平,使F-actin的荧光强度明显增强;NE可降低SM22 α表达水平和使F-actin的荧光强度明显减低,细胞由长梭形转变为多角形或短梭形,细胞板状突起增多,可见细胞分裂。结论 NE对VSMCs表型转化和骨架蛋白形态和数量表达改变有重要作用,为研究神经因素在心血管疾病发生发展中的作用提供理论依据。     

大鼠血管平滑肌增殖器官模型的建立及其机制探讨

为更好地研究血管平滑肌细胞增生性疾病的机理及防治,建立一种体外VSMC增殖器官模型,并对其机制作初步探讨.HE染色和免疫组化染色显示,大鼠主动脉段在体外拉伤内皮并经20%血清培养后,会出现中膜VSMCs的增殖.体外培养5 d后血管壁VSMC就出现不同程度增生,其中13 d的血管有明显斑块形成;免疫组织化学染色见有标记的增生VSMCs; RT-PCR检测显示,Hrg-1和SM22αmRNA的表达随培养天数增多而减少,至13 d检测不出.而在同样体外培养10 d情况下,与对照组相比,内皮损伤组培养上清中ET-1明显增多,Hrg-1、SM22a mRNA表达下调,Brdu标记增殖细胞增多,当加入内皮素受体阻断剂BQ123后标记细胞明显减少,其中血清培养组与无血清培养组相比,以上检测变化有显著性差异.结果表明,大鼠主动脉经体外培养能诱导平滑肌细胞异常增生并且表型从收缩型向合成型转化, ET-1和血清作用是该模型平滑肌增殖的主要因素.本模型为研究血管平滑肌增殖性疾病的机理和防治提供了一个较好的实验平台.     

胆固醇诱导人血管平滑肌细胞表型转化

目的观察胆固醇对人血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化的影响。方法体外培养人血管平滑肌细胞株,分别用(12.5、25.0、50.0)mg/L浓度的胆固醇作用细胞48 h;50.0 mg/L的胆固醇分别作用细胞24、48、72 h。采用实时定量PCR检测VSMC中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及平滑肌22α(SM22α)mRNA的表达;采用Western blot法检测胆固醇对VSMC中α-SMA、SM22α及单核细胞趋化蛋白-1诱导蛋白(MCPIP)表达的影响;CCK-8法检测VSMC增殖。结果 (12.5、25.0、50.0)mg/L胆固醇作用VSMC 48 h较对照组相比,α-SMA及SM22αmRNA水平及蛋白水平表达均降低(P0.05),50.0 mg/L胆固醇作用后表达水平最低,存在剂量依赖效应;用50.0 mg/L胆固醇分别作用VSMC 48、72 h后,α-SMA及SM22αmRNA及蛋白表达与对照组相比均降低(P0.05)。与对照组相比,胆固醇作用均明显促进VSMC增殖(P0.05)。50.0 mg/L胆固醇作用VSMC48 h可诱导MCPIP蛋白表达增加。结论胆固醇作用VSMC后可降低收缩型标志蛋白α-SMA及SM22α的表达、促进VSMC增殖,提示胆固醇可诱导VSMC表型转化。     

去甲肾上腺素促进血管平滑肌增殖和细胞表型转化

目的:研究去甲肾上腺素(NE)对血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化和增殖的影响及作用机制.方法:用NE分别作用体外培养和血清饥饿的血管平滑肌细胞,用5-BrdU标记VSMC的增殖、RT-PCR检测VSMC表型标志基因SM22a和增殖负性调控基因高血压相关基因-1(HRG-1)的表达.结果:NE和OX-LDL分别作用血清培养的VSMC后,SM22α和HRG-1表达下凋,5-BrdU标记的阳性增殖细胞增多;NE分别与α1-肾上腺素受体拮抗剂(α1-R-)和β1-肾上腺素受体拮抗剂(β1-R)共作用时,SM22α和HRG-1的表达明显上调.而当NE作用血清饥饿VSMC时,NE上调SM22α和HRG-1的表达.结论:NE对VSMC有促表型转化和增殖作用,且这种作用呈现像神经样的可逆性调节作用.其作用机制主要通过肾上腺索受体α1和β1来实现的.     

降钙素基因相关肽对大鼠血管平滑肌细胞增殖及表型转化的影响

目的:探讨降钙基因相关肽(CGRP)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及表型转化的影响,并对VSMC增殖模型的应用价值作出评估。方法:取大鼠主动脉,分成CGRP作用和无CGRP作用2个实验组,体外培养8d,收集血管前24h用BrdU标记。H-E染色和5-BrdU免疫细胞化学染色观察增殖变化;RT-PCR检测高血压相关基因1(HRG-1)和SM22α基因表达。结果:血管中膜可见大量棕黄色标记增殖的细胞核,VSMC明显增生,HRG-1和SM22α mRNA表达明显减少;而加入CGRP共培养组标记的增殖细胞大大减少,也未见有斑块增生,HRG-1和SM22α mRNA表达明显上调。结论:CGRP对VSMC增殖有抑制作用并可使VSMC从合成型向收缩型转化。     

内皮素-1对大鼠血管平滑肌表型转化和增殖的影响

目的:通过内皮素-1作用于大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)及对内皮素-1受体信号的阻断,探讨内皮素-1对VSMC表型转化和增殖的影响及机制.方法:取大鼠主动脉贴块培养VSMC,用内皮素-1及其受体阻断剂BQ123分别作用于一般培养的VSMC和血清饥饿培养的VSMC.用BrdU标记细胞增殖;RT-PCR检测高血压相关基因-1(HRG-1)和SM22α表达变化.结果:内皮素-1作用后VSMC增殖显著增多,HRG-1和SM22α mRNA在一般培养和饥饿培养的VSMC中表达均明显减少;而加入阻断剂BQ123后增殖细胞大大减少,HRG-1和SM22α mRNA表达明显上调.结论:内皮素-1有促进VSMC增殖作用并可使VSMC从收缩型向合成型转化,并且内皮素-1对VSMC的作用是不可逆的;受体信号途径是内皮素-1对VSMC表型转化和增殖作用的机制之一.     

不同体外条件培养对大鼠血管平滑肌细胞表型、增殖和细胞骨架的影响

目的 探讨不同体外培养条件与血管平滑肌细胞(VSMCs)表型、增殖和细胞骨架蛋白表达之间的差异及生物学意义。 方法 体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,实验分为6组：2代对照组、2代血清饥饿组、4代对照组、4代血清饥饿组、6代对照组和6代血清饥饿组;用5-Brdu标记增殖细胞;RT-PCR检测表型基因SM22ɑ mRNA的表达;免疫细胞化学检测细胞骨架蛋白SMɑ-actin、β-Tubulin和Desmin的表达。 结果 体外培养的VSMCs,随培养代数的增多,细胞骨架蛋白表达减少,电镜超微结构可见胞质中内质网、高尔基体等细胞器增多,有大量的分泌小泡;血清饥饿胞中线粒体增多并电子密度增高。 血清培养条件下SMɑ-actin随培养代数的增加其表达减少,血清饥饿培养可使SMɑ-actin表达可逆性上调;β-Tubulin和Desmin随培养代数的增加表达减少更明显,而血清饥饿上调作用也不明显,至第6代基本不表达。 结论 血清培养和血清饥饿培养在不同代中对VSMCs表型转化、增殖和细胞骨架有着不同的影响,它们之间存在着内在的联系,在维持细胞形态、收缩功能和血管重构方面起了重要作用。β-Tubulin和Desmin表达消失可能具有重要生物学意义。     

miR-145对血管平滑肌细胞生物活性及SM22α mRNA表达的作用*

目的：探究miR-145 对血管平滑肌细胞（VSMC）的生物活性及对SM22α mRNA 表达的作用。方法： VSMC分为3 组,增殖VSMC组（ 增殖组）、增殖VSMC + 转染miR-145-NC 组（ 空载体组）、增殖VSMC+转染 miR-145 组（ 增殖转染组）。采用RT-PCR 检测VSMC中SM22α mRNA、miR-145 的表达;免疫印迹检测cyclin E、p27 蛋白水平;Transwell 小室检测VSMC侵袭能力;MTT检测VSMC活力;流式细胞术检测VSMC凋亡率。 结果：增殖组VSMC中SM22α mRNA、miR-145 水平与空载体组相比数值较为接近;与增殖组及空载体组相比, 增殖转染组VSMC中miR-145、SM22α mRNA 表达升高。增殖组VSMC中cyclin E、p27 蛋白水平与空载体组相 比无差异;增殖转染组cyclin E 蛋白水平低于空载体组、增殖组,p27 蛋白水平高于空载体组、增殖组。增殖组 VSMC迁移数量与空载体组相比无差异;增殖转染组VSMC迁移数量明显低于空载体组、增殖组。增殖组与空载 体组VSMC在不同时间点的OD 值均较为接近;增殖转染组OD 值在不同时间点均低于空载体组、增殖组。增殖 组VSMC凋亡率与空载体组数值接近,组间比较差距较小;增殖转染组VSMC凋亡率较空载体组和增殖组升高。 结论：过表达miR-145 通过促进SM22α 水平增加,抑制血管平滑肌细胞的增殖,并促进其凋亡。     

收缩蛋白在血管新生内膜形成过程中的表达变化及其对血管收缩力的影响

目的：为了探讨两种收缩蛋白SM α-actin和SM22α在新生内膜形成过程中的表达变化及与血管收缩反应性之间的关系。方法： 在建立大鼠颈总-胸腹主动脉血管内皮剥脱后内皮增生模型的基础上，用Western blot和免疫组化检测两种收缩蛋白的动态变化，用透射电镜观察VSMC肌丝和用生物法测定血管收缩反应性。结果： 血管内皮剥脱后，中膜SM α-actin和SM22α的表达下降，以术后7-14 d最低，VSMC内肌丝由致密变为稀疏，由束状变为网状，但是血管的收缩反应性显著高于对照组（P<0.05）。结论： 内皮剥脱后，VSMC的增生及新生内膜的增厚可引起受损血管收缩反应性的升高，这是内皮损伤促发动脉硬化的重要原因。     

干扰素诱导蛋白p204表达变化对大鼠血管平滑肌细胞增殖及p21表达的影响

目的: 观察干扰素诱导蛋白p204对鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及p21表达的影响,探讨p204在VSMCs增殖调控中的作用及可能机制。方法: 应用干扰素 α(IFN-α)处理和p204基因( Ifi204 )的小干扰RNA(siRNA)瞬时干预体外培养的VSMCs,用MTT法测定细胞活力反映细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期,用半定量RT-PCR 法和Western blotting 分别检测p204和p21的mRNA和蛋白表达。结果: IFN-α可诱导鼠VSMCs p204 mRNA和蛋白表达上调,降低VSMCs细胞活力和细胞周期G₁/S转换,伴p21 mRNA和蛋白表达上调。转染 Ifi204 siRNA可抑制p204和p21表达,提高VSMCs细胞活力和促进细胞周期G₁/S转换。结论: p204表达可抑制鼠VSMCs的增殖,该效应可能与激活p21表达有关。     

干扰素诱导蛋白p204对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制

目的: 研究干扰素诱导蛋白p204对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响并探讨其可能的机制。方法: 应用干扰素α(IFN-α)和p204基因(Ifi204)的小干扰RNA(siRNA)瞬时干预体外培养的VSMCs,用MTT法测定细胞活力反映细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,用实时 qRT-PCR法和Western blotting 分别检测mRNA和蛋白表达。结果: IFN-α可诱导大鼠VSMCs p204 mRNA和蛋白表达上调,抑制VSMCs细胞活力和细胞周期G₁/S转换,伴Ras蛋白表达减少,Raf和ERK磷酸化水平下降。转染Ifi204 siRNA可抑制p204表达,提高VSMCs细胞活力和促进细胞周期G₁/S转换,伴Ras蛋白表达增多,Raf和ERK磷酸化水平升高。结论: p204表达可抑制鼠VSMCs的增殖,该效应可能与p204抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的激活有关。     

同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞组织因子表达增强

目的: 研究同型半胱氨酸（Hcy）诱导人血管平滑肌细胞（VSMCs）组织因子（TF）表达的作用，及其对核转录因子（NF-κB）活性和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。 方法: 培养人脐动脉VSMCs，将不同浓度的Hcy和/或NF-κB抑制剂PDTC与VSMCs孵育不同时间，用RT-PCR方法检测TF mRNA表达，用Western blotting检测核NF-κB水平，用流式细胞术（FCM）检测细胞表面TF蛋白水平和iNOS水平。 结果: 10 μmol/L Hcy作用4 h，TF表达开始升高，500 μmol/L达峰值，Hcy能显著诱导VSMCs表达TF mRNA；对照组VSMCs细胞膜表面有低水平的TF蛋白表达，10 μmol/L Hcy作用4 h即可诱导VSMCs表达TF蛋白，500 μmol/L 达高峰，Hcy能显著诱导VSMCs表达TF；500 μmol/L Hcy作用1 h，细胞核NF-κB水平明显升高，Hcy可诱导VSMCs NF-κB活化;NF-κB抑制剂PDTC可明显抑制Hcy对TF mRNA和细胞TF表达的诱导作用；单独Hcy作用不能诱导VSMCs表达iNOS。 结论: Hcy能显著诱导VSMCs表达TF，增强VSMCs的NF-κB活化，从而介导TF基因表达和蛋白合成，通过NF-κB介导VSMCs表达TF可能是Hcy导致AS、血栓形成的重要机制。     

IQGAP1 promotes the phenotypic switch of vascular smooth muscle by myocardin pathway: a potential target for varicose vein

Recently, the architectural remodeling of venous vessel wall ranks as the basis of varicose veins development based on the phenotypic state of vascular smooth muscle cells (VSMCs). In this study, we firstly demonstrated an obvious up-regulation of IQ-domain GTPase-activating protein 1 (IQGAP1) in patients with varicose veins. Importantly, following stimulation with PDGF-BB for 4 h, a common inducer of phenotypic switch in VSMCs, a dramatically time-dependent increase in IQGAP1 expression was observed in human venous smooth muscle cells (HUVSMCs), concomitant with the down-regulation of SMC markers [including α-smooth muscle actin (SMA), smooth muscle calponin (CNN), SM22α (SM22)], suggesting a critical function of IQGAP1 during the switch of synthetic VSMC phenotype. Further analysis ascertained that IQGAP1 overexpression significantly inhibited the expression of SMA, SM and CNN, while its silencing dramatically promoted their expression levels. Moreover, the elevated IQGAP1 enhanced cell proliferation, migration and rearrangement. Mechanism assay confirmed that IQGAP1 overexpression notably blocked myocardin levels. Importantly, after transfection with myocardin siRNA, IQGAP1 down-regulation-induced decrease in cell proliferation, migration and cell rearrangement was remarkably attenuated. Together, these results demonstrated that IQGAP1 may regulate the phenotypic switch of VSMCs by myocardin pathway, which is critical for the pathological progression of varicose vein. Therefore, this study supports a prominent insight into how IQGAP1 possesses its benefit function in varicose veins development by regulating vascular remodeling.