Vaspin通过Nrf2/ARE信号通路对高糖高脂诱导的INS-1细胞氧化应激的影响

目的：探讨Vaspin对高糖高脂诱导的INS-1细胞氧化应激的影响。方法：培养INS-1细胞,分为正常对照组（NC组）、高糖高脂组（HG+PA组）、高糖高脂+80ng/mLVaspin组（HG+PA+V1组）、高糖高脂+160ng/mLVaspin组（HG+PA+V2组）、高糖高脂+320ng/mLVaspin组（HG+PA+V3组）、高糖高脂+640ng/mLVaspin组（HG+PA+V4组）。通过DCFH-DA荧光探针染色法检测细胞内活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）水平;比色法、酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）检测氧化应激相关指标;葡萄糖（3.3mmol/L和16.7mmol/L）刺激胰岛素分泌实验检测各组胰岛素分泌水平;流式细胞仪检测细胞凋亡水平;Westernblot检测核因子E2相关因子2（nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2,Nrf2）蛋白表达水平。结果：①与HG+PA组相比,HG+PA+V4组中低糖和高糖刺激后的胰岛素分泌水平均有明显升高（均P<0.05）;②与HG+PA组相比,HG+PA+V4组中高糖高脂诱导INS-1细胞中ROS、丙二醛、8-羟基脱氧鸟苷水平明显降低,总抗氧化能力、超氧化物歧化酶水平、谷胱甘肽过氧化物酶水平明显升高（均P<0.05）;③流式细胞实验发现,与HG+PA组相比,随着Vaspin浓度增加,高糖高脂干预后INS-1细胞的凋亡水平明显下降（均P<0.05）;④Westernblot结果表明,胞浆中Nrf2表达水平随着Vaspin浓度的增加呈上升趋势,胞核Nrf2表达水平仅在HG+PA+V4组较HG+PA组升高（0.798±0.080vs.0.579±0.065,P=0.039）。结论：Vaspin可以通过激活Nrf2/抗氧化反应原件（antioxidantresponseelement,ARE）信号通路,改善高糖高脂诱导的INS-1细胞氧化应激损伤,减少细胞凋亡,增加胰岛素分泌水平。     

鸢尾素通过自噬对棕榈酸诱导的INS-1细胞功能和凋亡的影响

目的:探讨鸢尾素对棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导的胰岛β细胞功能和凋亡的影响.方法:培养INS-1细胞,用不同浓度梯度的鸢尾素干预INS-1细胞,根据蛋白结果筛选出最佳鸢尾素干预浓度为1500 ng/mL.然后将INS-1细胞分为正常组、PA组、PA+1500 ng/mL鸢尾素组、PA+1500 ng/mL鸢尾素+雷帕霉素组、PA+1500 ng/mL鸢尾素+3-MA组.用3.3 mmol/L和16.7 mmol/L的葡萄糖浓度刺激检测干预后胰岛素的分泌水平,Western blot检测自噬相关蛋白p-mTOR、mTOR、p62、LC3Ⅱ、LC3 Ⅰ的蛋白水平,用mGFP-GFP-LC3腺病毒转染观察自噬流水平,流式细胞仪检测细胞凋亡水平.结果 采用SPSS 20.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差((x)±s)表示,多组间差异比较采用单因素方差分析及Turkey HSD检验.结果 :①PA组LC3Ⅱ/Ⅰ的比值较正常组增高(0.745±0.035 vs.1.015±0.012,P=0.000),随着鸢尾素干预浓度增加,LC3Ⅱ/Ⅰ的水平较PA组逐渐升高且有统计学意义(Ⅰ1组1.465±0.028,Ⅰ2组2.269±0.063,I3组1.858±0.074,I4组2.355±0.074,均P=0.000),鸢尾素浓度为1500 ng/mL时LC3Ⅱ/Ⅰ的水平最高.②PA组INS-1细胞上清液中胰岛素水平在3.3 mmol/L和16.7 mmol/L葡萄糖刺激下较正常组均下降[(0.447±0.067) ng/mL vs.(0.138±0.012) ng/mL,P-0.000;(0.625±0.041) ng/mL vs.(0.245±0.043) ng/mL,P=0.000],鸢尾素干预后胰岛素水平较PA组均升高[(0.138±0.012) ng/mL vs.(0.322±0.041) ng/mL,P-0.001;(0.245±0.043) ng/mL vs.(0.414±0.036) ng/mL,P=0.005].③与正常组相比,PA干预细胞后,自噬体数量增加(2.33±1.53 vs.10.33±1.53,P=0.000),而自噬溶酶体数量无明显变化(2.33±1.53 vs.3.33±1.53,P=0.939),鸢尾素干预后,自噬体数量和自噬溶酶体数量较PA组均升高(10.33±1.53 vs.15.67±1.53,P=0.007;3.33±1.53 vs.12.00±2.00,P=0.001).④与正常组相比,PA干预后细胞凋亡率增加[(11.417±1.297)％ vs.(46.507±0.525)％,P=0.000],鸢尾素干预后凋亡率降低[(46.507±0.525)％ vs.(33.767±1.083)％,P=-0.000].结论:鸢尾素通过自噬改善PA诱导的INS-1细胞分泌功能和凋亡.     

姜黄素通过提高Rab家族蛋白的表达增强N2a/APP695swe细胞的自噬作用

目的：研究姜黄素（curcumin）对N2a/APP695swe细胞中自噬和Rab家族蛋白的影响,并且探讨姜黄素调节N2a/APP695swe细胞自噬的可能机制。方法：采用N2a/WT和N2a/APP695swe细胞,并将其分为4个组：N2a/WT组（WT组）、N2a/APP695swe组（APP组）、DMSO溶剂对照组（DMSO组,5 μmol/L,24 h）、curcumin处理组（curcumin组,5 μmol/L,24 h）。Western blot分别检测各组自噬标志性蛋白LC3BⅡ和底物蛋白SQSTM1的表达,以及Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7、Rab9、Rab24和Rab33B的表达;共聚焦显微镜观察免疫荧光进一步验证各组LC3BⅡ与SQSTM1蛋白的表达情况。结果：Western blot结果表示,curcumin组LC3BⅡ蛋白表达量明显高于APP组和DMSO组（0.54±0.02 vs. 0.29±0.09,0.54±0.02 vs. 0.29±0.09,P=0.000）;同时,curcumin组SQSTM1蛋白表达量则明显低于APP组（0.67±0.01 vs. 1.02±0.02,P=0.000）。共聚焦显微镜观察免疫荧光实验再次验证了LC3B和SQSTM1蛋白的这种表达趋势。Western blot进一步检测发现,与APP组相比,curcumin组Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7和Rab33B的蛋白表达量均明显增加（1.00±0.02 vs. 0.63±0.02,P=0.000;0.94±0.03 vs. 0.79±0.03,P=0.000;0.75±0.00 vs. 0.56±0.01,P=0.000;0.88±0.04 vs. 0.59±0.03,P=0.000）,而Rab9和Rab24的改变差异无统计学意义（1.04±0.02 vs. 1.06±0.02,P=0.578;0.79±0.00 vs. 0.80±0.00,P=0.067）。结论：姜黄素提高N2a/APP695swe细胞的自噬水平,其机制可能与增强Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7和Rab33B的表达有关。     

自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的：探讨自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞株（HK-2）凋亡中的作用。方法：培养HK-2细胞,根据培养环境氧浓度不同分为对照组（21%O2）和低氧组（1%O2）;根据低氧培养时间不同,低氧处理细胞进一步分为：低氧6 h亚组、低氧12 h亚组、低氧18 h亚组和低氧24 h亚组。Western blot检测HK-2细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和凋亡相关蛋白活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cleaved-caspase3）表达水平,流式细胞仪检测HK-2细胞凋亡情况;采用低氧诱导稳定表达GFP-LC3的HK-2细胞18 h,在荧光显微镜下观察GFP-LC3自噬小体的变化;进一步采用低氧联合自噬诱导剂雷帕霉素（ra－pamycin,RP）或自噬抑制剂巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1,BAfA1）处理HK-2细胞,细胞分为常氧对照组、常氧+雷帕霉素/或巴弗洛霉素组、低氧对照组、低氧+雷帕霉素/或巴弗洛霉素组。Western blot检测Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和cleaved-caspase3表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：与对照组（0.161±0.043）相比较,低氧12 h[（0.315±0.060）,P=0.019]、18 h[（0.586±0.063）,P=0.000]、24 h[（0.698±0.085）,P=0.000]亚组HK-2细胞cleaved-caspase3蛋白表达明显增多;低氧12 h、18 h、24 h亚组HK-2细胞凋亡率分别为（23.633±5.346）%、（25.200±4.782）%、（38.567±8.046）%,较对照组（11.800±3.966）%明显增多（P=0.036,P=0.021,P=0.000）。同时,低氧18 h、24 h亚组HK-2细胞表达Beclin1蛋白[（0.557±0.071）,（0.897±0.074）[较对照组（0.249±0.040）明显上调（P=0.001,P=0.000）;低氧6 h、12 h、18 h、24 h亚组细胞表达LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白[（1.795±0.143）,（2.873±0.078）,（3.029±0.089）,（3.735±0.059）]较对照组（1.322±0.191）明显上调（P=0.036,P=0.000,P=0.000,P=0.000）;细胞表达自噬底物P62蛋白[（0.776±0.061）,（0.602±0.119）,（0.419±0.117）,（0.384±0.068）]较对照组（0.957±0.035）明显下调（P=0.028,P=0.001,P=0.000,P=0.000）;低氧组细胞GFP-LC3斑点计数相对值为（40.667±6.028）,较对照组（18.667±5.508）明显增加（P=0.010）。雷帕霉素增加自噬后,低氧诱导的HK-2细胞凋亡（26.433±3.402）及cleaved-caspase3蛋白表达（0.265±0.066）较低氧对照组[（36.133±5.856）,（0.358±0.060）]明显减少（P=0.012,P=0.000）;巴弗洛霉素A1抑制自噬后,低氧诱导的HK-2细胞凋亡增多（49.233±3.412）及cleaved-caspase3蛋白表达（1.242±0.110）较低氧对照组[（25.933±3.650）,（0.659 ± 0.060）]明显增加（P=0.000,P=0.000）。结论：自噬在低氧诱导的HK-2细胞凋亡中起保护作用。     

Beclin-1、P62、LC3B在肺炎链球菌感染小鼠肺部中的表达变化

目的：探讨自噬相关蛋白Beclin-1、P62及微管相关蛋白轻链3B（microtubule-associated protein light chain 3B,LC3B）在肺炎链球菌感染小鼠肺部中的表达及意义。方法：生长至对数生长期的肺炎链球菌标准株D39用无菌PBS调节浓度为1.5×109 CFU/mL,采用鼻滴的方法对50只SPF级雌性Balb/c鼠（6~8 周,16~20 g）进行处理,分别在感染后0、6、12、24、48 h收集Balb/c小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）及肺组织,瑞氏-吉姆萨染色进行BALF细胞计数,HE染色观察肺组织病理学改变,Western blot 检测自噬相关蛋白Beclin-1、P62、LC3B在肺组织中的表达水平,免疫荧光观察LC3B在肺组织中的表达情况。结果：HE染色显示,小鼠鼻饲肺炎链球菌后12 h及24 h后肺组织内出现大量炎症细胞浸润。BALF中总细胞数量及中性粒细胞数量于感染后6 h开始增高[（1.280±0.506） vs. （6.272±1.312）,P=0.000;（0.000±0.000） vs. （3.456±1.308）,P=0.000],在12 h时达到高峰[（1.280±0.506） vs. （19.456±0.997）,P=0.000;（0.000±0.000） vs. （15.040±1.012）,P=0.000],48 h后基本恢复正常水平[（1.280±0.506） vs. （3.520±0.933）,P=0.005;（0.000±0.000） vs. （0.128±0.175）,P=0.835]。Western blot结果显示：自噬相关蛋白Beclin-1于感染后6 h开始增加[（0.626±0.078） vs. （0.921±0.093）,P=0.002],48 h时达到最高水平[（0.626±0.078） vs. （1.884±0.158）,P=0.000];自噬相关蛋白P62于感染后6 h开始减少[（2.915±0.094） vs. （2.275±0.269）,P=0.000],48 h时降低至最低水平[（2.915±0.094） vs. （1.178±0.142）,P=0.000];自噬相关蛋白LC3B于感染后12 h开始升高[（0.747±0.197） vs. （1.429±0.318）,P=0.006],24 h时达到高峰[（0.747±0.197） vs. （2.002±0.451）,P=0.000],48 h后降低[（0.747±0.197） vs. （1.563±0.501）,P=0.002]。免疫荧光显示：小鼠感染后12 h与24 h,肺组织中LC3B蛋白表达水平增加。结论：肺炎链球菌感染小鼠肺部后激活自噬的发生,且自噬在免疫调节过程中发挥着重要作用。     

全腔镜下手术对早期分化型甲状腺癌患者T细胞亚群及其细胞因子的影响

目的 探讨全腔镜下手术对早期分化型甲状腺癌患者T细胞亚群及其细胞因子的影响。 方法 自2013年1月—2015年1月,前瞻性收集收治的早期分化型甲状腺癌患者50例作为研究组,同期随机选取健康体检成人50例作为对照组。研究组给予全腔镜下甲状腺癌切除术。主要观察指标为2组研究对象外周血T细胞亚群及其细胞因子。 结果 与对照组比较,研究组CD4+T细胞比例显著降低[(20.48±6.43)% vs.(27.53±7.38)%,P=0.000];CD4+/CD8+T细胞比例显著降低(0.63±0.12 vs.0.80±0.15,P=0.015);IL-6水平显著降低[(20.73±5.39) ng/ml vs.(28.94±7.39) ng/ml,P=0.000];IL-10水平显著升高[(45.39±15.62) ng/ml vs.(23.94±5.39) ng/ml,P=0.000];TNF-α水平显著降低[(8.48±2.14) ng/ml vs.(13.58±3.49) ng/ml,P=0.000]。2组研究对象CD8+T细胞水平差异无统计学意义[(32.48±7.49)% vs.(34.58±8.12)%,P=0.463]。与术前比较,研究组术后CD4+T细胞显著增加[(24.82±3.32)% vs.(20.48±6.43)%,P=0.012];IL-6显著增加[(20.48±6.43) ng/L vs.(20.73±5.39) ng/L,P=0.000];IL-10显著降低[(38.59±9.83) ng/L vs.(45.39±15.62) ng/L,P=0.002];TNF-α显著升高[(11.75±3.29) ng/L vs.(8.48±2.14) ng/L,P=0.000]。 结论 早期分化型甲状腺癌患者可呈免疫抑制状态,全腔镜下手术有助于改善早期分化型甲状腺癌患者免疫功能。      

PBEF对HPMEC和A549细胞的影响及对ARDS发病机制的研究

目的：探讨前B细胞克隆增强因子（pre-B cell colony enhancing factor,PBEF）在急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）发病机制中的作用。方法：体外培养人肺微血管内皮细胞株（HPMEC）和人肺泡Ⅱ型上皮细胞株（A549）,采用不同浓度（0、50、100、500、1 000、2 000 ng/mL）重组人PBEF（rPBEF）分别作用于细胞,采用四甲基偶氮唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测细胞活性。选用100和1 000 ng/mL rPBEF刺激细胞,并设置空白对照组,采用流式细胞术法检测细胞周期和细胞凋亡率;采用透射电子显微镜观察细胞凋亡的形态学变化;采用蛋白印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cas－pase-3）、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（B-cell lymphoma/leukemia-2 gene,Bcl-2）的蛋白表达水平;采用实时荧光定量PCR法和蛋白印迹法检测水通道蛋白-1（aquaporin 1,AQP1）、白细胞介素-8（interleukin-8,IL-8）、白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）的mRNA和蛋白表达情况。结果：100、500、1 000、2 000 ng/mL rPBEF组相比空白对照组明显抑制了细胞活性（P<0.05）。流式细胞仪检测可见,与对照组[HPMEC：（19.347±2.052）%;A549：（17.297±0.800）%]比较,100和1 000 ng/mL rPBEF组细胞S期百分比[HPMEC：（43.847±1.272）%、（63.300±2.102）%;A549：（36.247±2.045）%、（46.400±1.346）%]明显增多（P=0.000）;与对照组[HPMEC：（8.433±0.600）%;A549：（3.877±0.666）%]相比,100和1 000 ng/mL rPBEF组细胞凋亡率[HPMEC：（11.317±0.533）%、（15.227±0.637）%;A549：（6.120±0.439）%、（8.633±0.497）%]明显升高（PHPMEC=0.001,PHPMEC=0.000;PA549=0.002,PA549=0.000）。1 000 ng/mL rPBEF处理细胞后透射电子显微镜下可见典型凋亡细胞和凋亡小体。同时,与对照组[HPMEC：（1.279±0.077）;A549：（2.824±0.129）]相比,100和1 000 ng/mL rPBEF组Bcl-2蛋白表达水平[HPMEC：（0.418±0.043）、（0.190±0.012）;A549：（1.276±0.212）、（0.601±0.164）]明显下调（均P=0.000）,而caspase-3蛋白表达水平[HPMEC：（0.763±0.030）、（1.170±0.056）;A549：（0.217±0.010）、（0.375±0.032）]较对照组[HPMEC：（0.459±0.032）;A549：（0.114±0.007）]明显升高（PHPMEC=0.000,PHPMEC=0.000;PA549=0.001,PA549=0.000）;AQP1 mRNA和蛋白表达水平明显下降[mRNA：HPMEC（0.543±0.113）、（0.287±0.093） vs. （1.050±0.155）（P=0.002,P=0.000）;A549（0.823±0.104）、（0.463±0.184） vs. （1.317±0.215） （P=0.013,P=0.001）;蛋白：HPMEC（0.494±0.038）、（0.233±0.030） vs. （0.824±0.067）（均P=0.000）;A549（0.850±0.157）、（0.484±0.118） vs. （1.344±0.136）（P=0.005,P=0.000）],而IL-8、IL-1β基因和蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。结论：PBEF可能通过下调Bcl-2基因表达,使caspase-3表达水平增加,从而诱导HPMEC和A549细胞凋亡,并通过下调AQP1表达参与急性呼吸窘迫综合征的发生发展。     

ROS介导棕榈酸诱导的肾小球足细胞骨架及裂孔隔膜损伤

目的：探讨棕榈酸（palmitic acid,PA）对足细胞肌动蛋白纤维骨架及裂孔隔膜蛋白损伤的影响。方法：应用PA刺激体外培养的条件永生性小鼠肾小球足细胞株,分为对照组（1% BSA）和PA（150 ?滋mol/L）组。采用Alexa 549-phalloidin染色观察足细胞肌动蛋白纤维骨架的变化;免疫荧光染色法观察检测足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达;油红“O”、透射电镜以及BODIPY染色检测PA刺激下足细胞内脂质积聚情况。应用不同浓度PA刺激足细胞,分为对照组（1% BSA）、50 ?滋mol/L PA组、150 ?滋mol/L PA组、300 ?滋mol/L PA组。采用Western blot检测足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达。进一步应用氧自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine,NAC）预处理足细胞,分为对照组（1% BSA）、PA（150 ?滋mol/L）组、NAC组、PA（150 ?滋mol/L）+ NAC组。采用DCFH-DA染色检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生;Alexa 549-phalloidin染色观察足细胞肌动蛋白纤维骨架的变化;Western blot检测足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达。结果：Western blot结果示300 ?滋mol/L PA组足细胞内Nephrin和Podocin 的表达（0.360±0.030,0.900±0.040）分别与对照（Ctr）组（1.000±0.030,1.000±0.030）和50 ?滋mol/L PA组（0.912±0.020,0.900±0.040）相比都明显减少（P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.003）。免疫荧光显示与Ctr组相比,PA组足细胞Nephrin（t=6.014,P=0.010）和Podocin（t=6.171,P=0.010）蛋白的表达减少。使用NAC预处理足细胞清除ROS,与PA组（1.21±0.04,1.30±0.03）相比,PA+NAC组Nephrin（2.87±0.05）和Podocin（2.69±0.06）的表达减少（P=0.000,P=0.000）。结论：ROS介导了棕榈酸诱导的足细胞骨架及裂孔隔膜损伤。     

棕榈酸通过cGAS-STING-IRF3通路降低心肌细胞的自噬功能

目的 探究棕榈酸（PA）对心肌细胞自噬功能的影响及潜在机制。方法 提取大鼠乳鼠心肌细胞（NRCMs）并体外培养24 h,分别加入 10%BSA 以及不同浓度的 PA（0、0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L）共培养 24 h。Western blotting 检测 NRCMs 中自噬指标（PINK1、Parkin、p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）以及cGAS、STING、p-IRF3/IRF3的蛋白表达水平。CCK8法检测细胞活性,筛选0.7 mmol/LPA用于后续实验。进一步将cGAS siRNA转染入NRCMs中以敲降cGAS的表达,将NRCMs细胞分为：空白对照组（Control组,无特殊处理）、阴性对照组（NC组,转染NC序列）、cGAS siRNA组（转染cGAS-siRNA敲降cGAS）、PA组（0.7 mmol/L PA处理24 h）、cGAS siRNA+PA组（转染cGAS-siRNA后予以0.7 mmol/L PA处理24 h）。Western blot检测NRCMs自噬相关蛋白指标表达变化,CCK8法检测细胞活性,免疫荧光检测p62和LC3阳性着色情况。结果 经不同浓度PA作用24 h后,NRCMs中PINK1、Parkin,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ+Ⅱ蛋白表达量明显降低（P<0.05）,p62蛋白表达量明显增高（P<0.05）,且心肌细胞活性明显下降（P<0.05）。将cGAS敲降后,可明显逆转PA诱导的NRCMs自噬功能降低,并改善心肌细胞活性（P<0.05）。结论 PA通过介导cGAS-STING-IRF3通路激活,抑制心肌细胞的自噬功能,导致细胞活性降低。