结核分枝杆菌免疫相关蛋白PPE68的表达及免疫原性的研究

目的：克隆、表达结核分枝杆菌PPE家族蛋白PPE68的编码基因Rv3873．并初步探索PPE68诱导Balb／c小鼠脾淋巴细胞的增殖活性,为进一步研究PPE68的免疫功能提供实验依据。方法：以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv3873基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pET32a（＋）,获得重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达,纯化表达产物,通过XTT比色法检测重组蛋白PPE68诱导脾淋巴细胞的增殖活性。结果：重组质粒pETRv3873构建成功．57kDa的His—PPE68融合蛋白在大肠杆菌中稳定表达,并具有刺激Balb／c小鼠脾淋巴细胞增殖的功能。结论：PPE68蛋白具有较强的免疫原性,其免疫学功能具有进一步研究的价值。     

人FL在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化和生物学活性测定

建立了人FL(human flt3 ligand，hFL）在大肠杆菌中的高效表达系统，分离纯化重组hFL为其功能和应用研究打下基础。根据大肠杆菌偏爱密码子人工合成hFL基因膜外DNA片段，由PCR方法获得的hFL基因膜外区DNA片段，经测序证明序列正确。构建表达载体pET30a-Trx-hFL并转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，hFL融合蛋白的表达占菌体总蛋白的60％以上，并以包涵体形式存在。融合蛋白经离子交换层析、分子筛层析纯化，并用FXa切割，切割效率＞80％。切割产物经亲和层析纯化。纯化产物进行Western blot鉴定。纯化的rhFL（recombinant hFL）与GM－CSF及TNFα联合作用，具有良好的刺激DC增殖活性，其增殖能力是GM－CSF＋TNFα的2．5倍左右。本文以大肠杆菌为宿主，成功地表达了融合蛋白Trx-hFL。经纯化的rhFL在体外与GM－CSF及TNFα联合使用能有效地刺激人DC的增殖。     

小鼠IL-33的原核表达、纯化及鉴定

目的: 在大肠杆菌中表达具有生物学活性的白细胞介素-33(mIL-33).方法: 用PCR技术扩增小鼠IL-33成熟蛋白的编码区, 与原核表达载体pET-44连接, 构建pET-44-mIL-33表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达, 镍柱亲和层析法纯化目的蛋白, SDS-PAGE分析表达产物, MTT法测定纯化IL-33的生物学活性.结果: 成功构建了pET-44-mIL-33原核表达载体, 并在大肠杆菌中表达出可溶性mIL-33, SDS-PAGE分析纯化产物纯度为95%, 表达产量为95 mg/L.细胞增殖实验表明IL-33有抑制P815细胞增殖的活性.结论: 获得了有活性的重组IL-33蛋白纯品, 为后续功能研究奠定了基础.     

抗体-白细胞介素2融合蛋白18382scFv-Interleukin2的表达及活性检测

目的在哺乳动物细胞内表达抗体细胞因子融合蛋白18382scFv-Interleukin2，为卵巢癌提供一种新的治疗方法。方法通过基因工程的方法将两段基因IL-2和18382scFv开放读框的编码序列克隆在一起，在CHO-K1细胞内人巨细胞病毒启动子的作用下表达可溶性融合蛋白，并检测其对肿瘤细胞的靶向性。结果采用哺乳动物细胞表达，系统表达的这种小分子融合蛋白，既保留了与卵巢癌OC18382抗原结合的特性，又保持了IL-2的生物学活性。融合蛋白在细胞培养上清中保持稳定，更重要的是融合蛋白将IL-2靶向表达OC18382抗原的卵巢癌细胞表面化的同时，又能刺激IL-2依赖细胞株的增殖，从而诱发局部有效的抗肿瘤反应。既提高了融合蛋白的穿透组织能力和肿瘤组织部位的浓聚，又避免了大剂量全身应用细胞因子引起的副作用。结论真核表达系统表达的融合蛋白具有很好的生物学活性。     

人PDGF-A基因的克隆、表达及表达产物的纯化

目的 克隆血小板衍生的生长因子A链（PDGF-A）的基因，并在大肠杆菌中表达。方法 利用RT-PCR法，从人肝癌细胞系（HHCC）的总RNA中，扩增PDGF-A的全长cDNA，再用PCR法扩增PDGF-A成熟蛋白的全长编码序列，编码序列经测序验证后，克隆入表达载体pGEX-4T-1中，构建PDGF-A的原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白，并进行谷胱甘肽（GST）亲和层析纯化。结果 以RT-PCR扩增的PDGF-A基因的全长为1255bp，以PCR扩增得到其成熟蛋白的编码序列为531bp，构建了PDGF-A基因的原核高效表达载体pGEX-PDGF-A。表达产物主要位于包涵体内，对包涵体蛋白进行变性和复性处理后，利用亲和层析法获得纯化的目的蛋白，结论 成功地扩增到PDGF-A成熟蛋白的编码序列，并在大肠杆菌高效表达，为进一步对PDGF-A功能的研究提供了有利的工具。     

小鼠白细胞介素17A的原核表达及对RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响

目的 在大肠杆菌中高效表达与纯化小鼠白细胞介素17A(mIL-17A),并研究其对巨噬细胞分泌炎症因子的影响.方法 以活化的脾细胞为模板,通过RT-PCR法扩增小鼠IL-17a基因的编码序列,构建重组表达质粒pET28a/mIL-17a,并在大肠杆菌(E.coli)中诱导表达,经亲和层析获得纯化的mIL-17A蛋白.以mIL-17A蛋白刺激体外培养的鼠巨噬细胞RAW264.7,72 h后应用realtime PCR法分析IL-6、巨噬细胞炎症蛋白1(Ccl3)、巨噬细胞炎症蛋白2(Cxcl3)、β防御素2(defensinβ2)的mRNA表达量,并用ELISA法检测培养上清中Ccl3、Cxcl3、IFN-γ、IL-4及IL-6的蛋白质表达水平.结果 在E.coli中成功高效表达了有生物活性的IL-17A蛋白,可促进体外培养的RAW264.7细胞IL-6、Cxcl3、defensin β2 mRNA的表达,并能促进Ccl3、Cxcl3、IFN-γ、IL-4以及IL-6蛋白的表达.结论 成功表达并制备了具备生物学活性的mIL-17A,该蛋白具有刺激巨噬细胞表达趋化因子、防御素及细胞因子的能力.     

SUMO表达系统高效、可溶性表达重组鼠源IL-1β

目的:从LPS刺激过的小鼠胸腺细胞中克隆IL-1β基因,通过原核表达,获得具有生物活性的可溶性鼠源IL-1β蛋白,为深入研究和利用IL-1β基因奠定基础。方法:提取LPS刺激的小鼠胸腺细胞总RNA,反转录成cDNA,以此为模板,根据GenBank报道的mIL-1β序列设计引物,进行巢式PCR,得到成熟mIL-1β的编码序列基因,并插入到原核表达载体pHisSUMO ex-press中SUMO标签的下游,构建重组表达载体pHisSUMO express-mIL-1β。将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达mIL-1β/SUMO融合蛋白,Ni-NTA Agarose纯化后,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,用SUMO protease-1切去SUMO标签,经纯化并切去融合标签后获得成熟mIL-1β蛋白。用MTT方法检测目的蛋白对L929细胞的生物学活性。结果:DNA测序证明所克隆基因序列与GenBank报道的完全一致,SDS-PAGE分析表明融合蛋白的相对分子质量为37kD,切割后的成熟蛋白为17kD,与理论值相符。且蛋白表达量高,主要以可溶形式存在。Western blot证实该蛋白为mIL-1β。成熟蛋白纯化产物纯度超过95%以上,通过MTT的方法检测证明其具有使L929细胞增殖的作用,从而说明其具有生物学活性。结论:利用大肠杆菌表达系统可高效可溶性表达高纯度的具有生物活性的mIL-1β蛋白。     

一种新型重组人源性白细胞介素-8活性检测方法的建立

目的通过蛋白质片段互补检测（proteinfragmentcomplementationassay，PCA）技术检测重组人源性IL-8的生物学活性。方法利用PCA方法构建了Split—TEVGPCR激活检测系统，为了验证其有效性，在不同的宿主系统中表达和纯化了各种亚型的人源性IL-8重组蛋白用于进行活性检测。蛋白样品包括：①IL-8亚型I（残基21-99），通过在哺乳动物细胞HEK293中分泌表达前体IL-8基因获得，其N端信号肽（残基1—20）被切除；②IL-8亚型Ⅱ（残基23—99）和亚型Ⅲ（残基28—99），通过在大肠杆菌BL21（DE3）中表达获得。结果Split—TEVGPCR激活检测系统证明纯化后的重组人源性IL．8样品对天然受体IL8RB都具有明显的激活活性，其EC50值分别为：12．32±0．89ng／mL（亚型I）、15．14±1．84ng／mL（亚型Ⅱ）和2．854-0．50ng／mL（亚型Ⅲ）。结论成功建立了-种新型的重组人IL-8活性检测方法，为进一步的理论研究和IL-8中和抗体的高通量筛选奠定了基础。     

土拨鼠α干扰素新亚型基因的克隆及生物学活性分析

目的 克隆土拨鼠α干扰素（IFN-α）新亚型基因，用于土拨鼠HBV模型探索IFN-α治疗慢性乙型肝炎策略；调查慢性土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus，WHY）感染的土拨鼠外周血单个核细胞（PBMC）干扰素功能状况。方法 poly（I-C）体外刺激正常和慢性WHV感染的土拨鼠PBMC，分析其表达的干扰素生物学活性。利用分子克隆技术对土拨鼠IFN-α家族基因进行克隆，并对所克隆的系列基因进行测序、分型并进行真核表达后检测表达产物生物学活性。结果 poly（I-C）刺激体外培养的土拨鼠PBMC后，慢性感染土拨鼠PBMC分泌的干扰素的活性显著差异低于正常土拨鼠（P〈0．01）。获得36个土拨鼠IFN-α基因序列克隆，测序分析后，发现有10个克隆是新亚型基因，其中8个为功能基因亚型，2个为假基因亚型，病毒保护试验证明只有功能基因亚型具有生物学活性。结论 慢性WHV感染的土拨鼠细胞免疫功能受损。新的土拨鼠IFN-α亚型基因的克隆为在土拨鼠HBV动物模型上进行干扰素基因治疗和研究干扰素治疗策略提供了新的材料。     

可诱导共刺激分子和小鼠免疫球蛋白融合基因的分泌表达及生物学活性

目的：为获得重组可诱导共刺激分子胞外段与小鼠免疫球蛋白的融合蛋白（ICOS-Ig）并研究其生物学活性，以探讨它作为免疫拮抗剂阻断ICOS／B7RP-1共刺激通路的作用。方法：克隆编码人可诱导共刺激分子（ICOS）胞外片段，与编码小鼠免疫球蛋白IgG恒定片段（Ig）的基因融合，构建ICOS-Ig融合基因及其分泌型真核表达载体pSecTag2／Hygro A-ICOS-Ig；构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株，用Western blot和ELISA法检测其表达、流式细胞仪（FACS）检测其配体结合活性、混合淋巴细胞反应（MLR）及细胞因子检测测定其生物学活性。结果：核苷酸序列测定显示克隆基因的核苷酸与Genebank序列一致：ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达，其含量可达5～25μg／ml；该重组蛋白有配体结合活性，可体外抑制淋巴细胞增殖、减少IL-2、IFN-γ的分泌。结论：重组ICOS-Ig融合基因及其真核表达载体的构建完成并获得高效表达，该重组蛋白具有配体结合活性，可在体外通过抑制ICOS／B7RP-1共刺激通路抑制淋巴细胞增殖及细胞因子分泌。     

Construction of a plasmid for expression of foreign epitopes as fusion proteins with subunit B of Escherichia coli heat-labile enterotoxin.

A novel vector (pFS2.2) for high-level expression of fusion polypeptides with the nontoxic subunit B (LT-B) of Escherichia coli heat-labile enterotoxin in Escherichia coli and salmonellae is presented. It carries the complete coding sequence of LT-B under lac promoter control and a universal polylinker site for the in-frame insertion of foreign genes at the LT-B gene 3' end. By using this vector, fusion proteins comprising parts of the human or woodchuck hepatitis B virus surface and nucleocapsid antigens are expressed in E. coli and salmonella.     

A method for rapid screening of recombinant proteins for recognition by T lymphocytes.

A simple, cost-effective method is described that allows rapid screening of recombinant protein sequences for their ability to stimulate T cells. Individual microcultures of E. coli each expressing a gene product or peptide sequence fused to protein A are grown in 96-well plates. Following lysis of the bacteria, the fusion peptide is readily captured with immobilized immunoglobulin in tissue culture wells. No further purification is required. T lymphocytes plus appropriate antigen-presenting cells are added directly to the wells and assayed for proliferation. The DNA in bacteria from wells stimulating T cell proliferation is then sequenced. The technique allows rapid mapping of T cell epitopes by facilitating screening of truncation mutants without extensive purification. Described here is a further application of the technique to study monosubstituted analogues of a known T cell epitope.     

hClock-(35-47)_Bax-(55-77)的表达和纯化

目的:构建hClock-(35-47)_Bax-(55-77)的表达质粒,进行诱导表达,纯化和鉴定。方法:合成hClock-(35-47)_Bax-(55-77)全长DNA序列,重组入pET-32a表达载体中,测序鉴定后转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株,构建好重组体的表达菌株。IPTG诱导并优化表达后,以NTA-Ni亲合层析进行分离纯化,及SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果:成功构建了hClock-(35-47)_Bax-(55-77)的表达载体,插入片断为128bp,表达产物相对分子质量约为23kD,经Western blotting鉴定,与抗His-Tag抗体有特异性反应。结论:hClock-(35-47)_Bax-(55-77)融合蛋白可以用原核表达的方法大量获得,并通过亲和层析纯化达到较好的纯度,为下一步的研究提供基础。     

A three-step purification method of large quantities of human recombinant alpha endothelial cellular growth factor for clinical use

The endothelial cellular growth factor alpha-ECGF is a candidate drug for the induction of therapeutic neoangiogenesis. Its use in extensive experimental and clinical trials is hampered by the fact that currently published purification procedures allow only small yields, and the absence of pyrogenic impurities is not demonstrated. The rh alpha-ECGF was expressed in E. coli. Isolation of rh alpha-ECGF from E. coli lysates to apparent homogenicity was achieved by a three step purification procedure involving ionic exchange, heparin-sepharose and polymyxin B chromatography. By this method, 200 mg of rh alpha-ECGF was purified from 15 g wet weight E. coli bacteria. The isolated protein of 18 kDa appeared as a single band after SDS gel electrophoresis and subsequent silver-staining. The biological activity was expressed in the chorion-allantois-membrane assay and in the 3H-thymidine proliferation in baby hamster kidney cells. Drug trials with rabbits revealed no increase in body temperature after intravenous injections with 1 mg rh-ECGF.     

中国莱姆病螺旋体FP1外膜蛋白A的克隆表达及其抗原性的初步研究

目的　克隆并表达中国莱姆病螺旋体阿弗西尼疏螺旋体基因种参照菌株FP1的外膜蛋白A(OspA) ,并对其抗原性进行初步研究和基因序列分析 ,为研制中国莱姆病疫苗提供资料。方法设计引物 ,用聚合酶链反应 (PCR)从莱姆病螺旋体FP1全基因组DNA中扩增出OspA编码基因 ,经酶切、连接 ,插入原核表达载体pET 11d ,构成重组质粒pET 11d ospA ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达 ,表达产物用SDS PAGE、Westernblot分析 ,并进行基因序列测定。结果　rOspA在宿主菌内获得高效、稳定表达 ;相对分子质量 (Mr)约为 31× 10 3,Westernblot显示其与抗OspA的多抗有良好的免疫反应性 ;经测序显示该rOspA的基因片段长度为 783bp ,编码 2 6 1个氨基酸 ,与欧洲标准菌株Pko和瑞士标准菌株VS4 6 1的OspA的DNA碱基序列比较 ,同源性均为 94 %。结论　在国内首次成功地对中国莱姆病螺旋体阿弗西尼疏旋体基因种的代表菌株FP1的OspA基因进行了克隆和表达。并且证实rOspA有良好的抗原性 ,可进一步对其免疫保护性进行研究 ,以便为研制有效的莱姆病疫苗提供数据。     

中国莱姆病螺旋体PD91外膜蛋白A的克隆表达及免疫保护性的初步研究

目的：克隆并表达中国莱姆病螺旋体Borrelia garinii基因型代表菌株PD91的外膜蛋白A(OspA)，并对其免疫保护性进行 初步研究，为进一步研制莱姆病疫苗提供基础。方法：用聚合酶链反应（PCR）从莱姆病螺旋体PD91全基因组DNA中将OspA基因调出，插入原核表达载体P42，在大肠杆菌BI21(DE3)中表达，表达产物用SDS-PAGE、Western blot分析，并进行基因序列测定。用重组OspA（rOspA）免疫新西兰家兔，用间接免疫荧光（IFA）检测其血清特异性抗体（IgG），并进行体外中和试验，从而对其免疫保护性有初步的了解。结果：rOspA在宿主菌内表达高效、稳定；Western blot 显示其与抗OspA的多抗有较好的免疫反应性；用rOspA免疫新西兰家兔后，其血清抗体（IgG）效价显著升高（32倍），体外中和试验表明，每毫升兔抗rOspA血清可杀来源10^5个莱姆病螺旋体。结论：在国内首次成功地对中国莱妈病螺旋体Borrelia garinii基因型的OspA基因进行了克隆和表达。ROspA有较好的免疫保护性，可作为多价莱姆病疫苗的一种成分。     

Isolation, expression, and nucleotide sequence of the sod gene from Porphyromonas gingivalis.

The sod gene coding for the Mn/Fe-dependent superoxide dismutase (SOD) enzyme has been isolated on a 5.9-kb DNA fragment from Porphyromonas gingivalis ATCC 53977. SOD activity can be expressed from the P. gingivalis fragment and from a subcloned fragment in Escherichia coli. However, the enzyme does not appear to be expressed from its own promoter in E. coli cells. The nucleotide sequence of the gene has been determined, and the deduced amino acid sequence of the enzyme is nearly identical to that of the enzyme purified from P. gingivalis 381 and shares extensive sequence similarity with comparable enzymes from E. coli.     

人神经营养因子3基因的分子克隆、表达及其产物的生物活性鉴定

以正常中国人血淋巴细胞染色体DNA为模板,PCR扩增出神经营养因子3（NT3）编码基因。将所得基因片段重组于M13噬菌体载体,筛选得到含中国人NT3基因的克隆。采用单链末端终止法测出其全部的核苷酸序列,该序列与国外文献所报道的完全一臻。将NT3编码基因亚克隆于杆状病毒表达载体,以在大肠杆菌内转座后的重组Bacmid大分子DNA转染悬浮培养的昆虫细胞后,在培养上清中检测到大量成熟型的NT3,后者对人神经母细胞瘤SH－SY5Y－T3具有较强的促进神经突起生长的作用,其生物学效应可被抗人NT3多克隆抗体所阻断。     

人PD-L1 cDNA的克隆及其胞外区蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人PD-L1基因的cDNA并构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR法从活化的人淋巴细胞总RNA中，扩增并克隆PD-L1的cDNA，构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体，在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达并鉴定。结果：克隆到PD-L1 cDNA编码区的全长序列，经DNA测序证明其与已报道的序列一致。同时构建了在羧基端带有His6标签的PD-LI胞外区基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达。免疫印迹分析表明，在IPTG诱导后表达的PD-L1胞外区蛋白，相对分子质量(Mr)为25000，与理论值的大小相符。该重组蛋白能与抗His6标签的单抗(mAb)特异性反应。结论：成功地克隆PD-L1基因，其胞外区蛋白在大肠杆菌中获得表达，为利用PD-L1转基因修饰移植物或以PD-L1重组蛋白抑制移植排斥反应等研究提供了条件。     

人肝再生磷酸酯酶2(PRL-2)的原核表达及其鸡卵黄抗体的制备

目的 :原核表达人肝再生磷酸酯酶 2 (PRL 2 )与谷胱甘肽S转移酶 (GST)和 6个串联组氨酸 (6×His)的融合蛋白 ,并制备GST PRL 2特异性鸡卵黄抗体。方法 :将人PRL 2cDNA的全长蛋白编码序列 ,克隆入两种原核表达载体pGEX 4T 2和pET2 1a中 ,在大肠杆菌BL2 1中诱导表达融合蛋白。用Glu tathioneSepharose 4B和Ni NTAagarose亲和柱分别纯化目的蛋白。以纯化的GST PRL 2融合蛋白免疫产蛋母鸡制备多克隆抗体 ,应用 6×His PRL 2对抗体进行亲和层析纯化 ,纯化产物用Westernblot进行分析。结果 :得到高表达量的融合蛋白 ,经亲和层析柱纯化后获得较高纯度的GST PRL 2和 6×HisPRL 2融合蛋白。以GST PRL 2融合蛋白免疫鸡得到抗PRL 2的多克隆抗体 ,Westernblot证实 ,经 6×HisPRL 2亲和层析纯化的抗体 ,能够识别 6×His PRL 2和GST PRL 2融合蛋白 ,但不同GST蛋白起反应 ,表明具有较高的特异性。结论 :利用原核表达的人PRL 2融合蛋白制备的抗PRL 2多克隆抗体具有较好的特异性 ,为研究PRL 2蛋白在细胞信号转导过程中的作用提供了重要的技术和材料保障