用PCR-HRM方法快速区分白纹伊蚊和埃及伊蚊

目的建立快速区分白纹伊蚊和埃及伊蚊的PCR结合高分辨率熔解曲线(PCR-HRM)方法。方法设计针对白纹伊蚊和埃及伊蚊线粒体ATP6和Cytb基因的2对通用引物,用PCR-HRM方法区分白纹伊蚊和埃及伊蚊。结果白纹伊蚊和埃及伊蚊ATP6和Cytb基因均扩增出不同形状的曲线,蚊种区分结果与形态学鉴定结果一致。结论采用基于ATP6和Cytb基因的PCR-HRM能准确快速区分白纹伊蚊和埃及伊蚊,可作为白纹伊蚊和埃及伊蚊不完整样本的鉴定方法。     

三种伊蚊细胞系基因组多态性DNA的研究

目的：探讨3种伊蚊细胞系基因组多态性DNA。方法：应用3个引物，通过随机引物扩增多态性DNA聚合酶链反应技术（RAPD-PCR），对东乡伊蚊、埃及伊蚊和白纹伊蚊的细胞系基因组DNA进行扩增。结果：分别扩增出不同数量和分子大小的多态DNA图谱；3种伊蚊细胞的基因组DNA扩增产物除了有部分相同分子大小的DNA条带外，还有各自独特的DNA条带。结论：此方法简便、快速、精确，可用于蚊虫的分子分类研究。     

甲基化特异性PCR技术优化试验

目的建立一种高特异性的甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)法。方法以p15基因为目的基因,以经亚硫酸氢盐转化的全甲基化人类基因组DNA及亚硫酸氢盐转化的全非甲基化人类基因组DNA为模版,采用Methprimer软件预测p15启动子甲基化岛并设计甲基化及非甲基化引物,对甲基化及非甲基化DNA模板进行聚合酶链式反应(PCR)。根据MSP的PCR阶段的退火温度分为普通温度组(甲基化引物及非甲基化引物退火温度分别为58、55℃)及提高温度组(甲基化引物及非甲基化引物退火温度分别为60、57℃)。在普通温度组的基础上,通过增加镁离子(Mg~(2+))浓度、添加PCR反应体系中二甲基亚砜(DMSO)以优化PCR反应体系。结果 MSP的PCR反应阶段,普通温度组出现了非特异性扩增产物,即假阳性及假阴性;提高温度组非特异性扩增减弱,特异性扩增同等降低。普通温度的优化PCR体系组非特异性扩增消失,可以完全消除假阴性及假阳性。结论设置普通退火温度同时适当地增加Mg~(2+)浓度及DMSO有利于保证MSP结果的特异性。     

海南省海口地区伊蚊黄病毒的发现与鉴定

目的了解海南省海口地区白纹伊蚊携带伊蚊黄病毒情况。方法 2019年6-10月,用人诱法在海口采集白纹伊蚊,设计特异性引物扩增伊蚊黄病毒部分基因片段并测序;用Mega7.0软件对所得病毒核酸序列和GenBank中已知伊蚊黄病毒参考序列进行遗传进化关系分析。结果共采集165只白纹伊蚊。用优化确定1对特异性引物从1只白纹伊蚊中扩增到伊蚊黄病毒HK1,白纹伊蚊带毒率为0.6%。系统发育分析发现伊蚊黄病毒HK1序列与分离自日本东京的病毒株(NC012932.1)遗传关系最近,相似度为72.51%,但小于84.0%。根据黄病毒属定义新种的标准,这株伊蚊黄病毒(HK1)为黄病毒属的新种。结论在海口地区首次发现白纹伊蚊携带伊蚊黄病毒,应增加样本量持续开展蚊虫携带病原体监测。     

三种品系白纹伊蚊转铁蛋白基因表达量的比较分析

目的 进行不同品系白纹伊蚊转铁蛋白基因表达量的分析.方法 据二维电泳获得肽段序列设计引物扩增基因片段,荧光定量PCR检测在白纹伊蚊抗性品系、敏感品系、现场采集品系蚊体内的表达水平差异.结果 成功扩增白纹伊蚊转铁蛋白基因片段,荧光定量PCR表明转铁蛋白基因在抗性品系蚊体内的表达量是敏感品系的10.51倍,现场品系是敏感品...     

3种食源性致病菌共增菌及三重PCR检测

目的 建立沙门菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌三重PCR检测方法。方法 3株菌在本实验室自行研制的共增菌培养基(SSV培养基)混合培养16 h,分别对沙门菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、副溶血性弧菌collagenase基因设计特异性引物,建立三重PCR体系,通过对引物浓度、退火温度及循环次数进行优化,从而建立最优体系,并从特异性、重复性、灵敏性3个方面对体系进行评价。结果 三重PCR体系中,invA、nuc、collagenase引物浓度分别为10、12.5和12.5 nmol/L;最佳退火温度为55.6℃;目标菌的引物特异性好,且体系的检测灵敏度高,3株菌在三重PCR体系中的灵敏度都在10² CFU/mL以上。结论 建立的三重PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好。     

多重PCR快速检测金黄色葡萄球菌四型肠毒素基因的研究

[目的]建立一种快速、高效地检测金黄色葡萄球菌SEA、SEB、SEC和SED基因的多重PCR法并进行优化. [方法]试剂盒提取产肠毒素金黄色葡萄球菌基因组DNA作为模板,根据SEA、SEB、SEC和SED肠毒素基因片段保守区序列设计引物,多重PCR扩增产肠毒素金黄色葡萄球菌基因组中特异靶序列.对反应体系Mg2+浓度、引物浓度和退火温度进行优化,并初步检测方法特异性. [结果]在PCR反应体系中加入设计的4对引物可同时扩增出金黄色葡萄球菌四型肠毒素基因中的特异序列;在总体积为25 μl的反应体系中,最优Mg2+浓度为2.0 mmol/L,引物浓度分别为0.2 μmol/L,退火温度为49℃;以大肠杆菌O157:H7和肠炎沙门菌510041基因组DNA为模板扩增不出特异片段. [结论]成功建立金黄色葡萄球菌四型肠毒素基因多重PCR法,该法能快速、高效地同时检测SEA、SEB、SEC和SED基因,比传统PCR方法省时省力,可以弥补传统PCR法的不足.     

国境口岸10种重要蚊类分子鉴定及系统发育研究

目的建立国境口岸重要蚊类分子鉴定方法。方法针对口岸10种重要蚊类,包括淡色库蚊(Culex pipiens pallens)、致倦库蚊(Culex pipiens quinquefasciatus)、凶小库蚊(Culex modestus)、三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)、背点伊蚊(Aedes dorsalis)、刺扰伊蚊(Aedes vexans)、中华按蚊(Anopheles sinensis)和骚扰阿蚊(Armigeres subalbatus)设计特异性引物或通用引物进行核酸扩增,测序后与Gen Bank中的序列比对分析。结果测定的10种重要蚊类均确认为相应蚊种;利用CO I基因的系统发育分析的结果显示与传统的形态鉴定结果一致。结论分子鉴定能准确进行蚊类鉴定,CO I基因在蚊类鉴定中可以作为有效的分子遗传标记。     

随机引物扩增多态性DNA聚合酶链反应技术用于蚊细胞的鉴定

本文应用随机引物扩增多态性DNA聚合酶链反应技术筛选出引物Pm,用此引物对淡色库蚊细胞系(CPP-512)、中华按蚊卵巢细胞系(Anso-242)、嗜人按蚊细胞系(Ana-104)、白纹伊蚊细胞株(C6/36)4种蚊细胞基因组DNA进行扩增,得出4个相异的多态性DNA扩增产物图谱,各自的DNA扩增条带的分子量(kb)为CPP-512:0.5、0.7、0.8、0.88、1.02、1.22;Anso-242: 0.5、0.88、1.02、1.13、1.22、1.5、2.1、2.4、2.5;Ana-104:0.64、0.98、1.2、1.28、1.4、1.53、1.8、2.3、2.6、3.3;C6/36:0.66、0.8、0.94、1.4、1.42、1.5、1.52、2.9。实验结果表明,随机引物扩增多态性DNA聚合酶链反应技术是一种简便易行、结果重复性好的先进生物学分类技术,引物Pm能满足同时鉴别3属蚊虫的4种蚊细胞的需要。     

4种DNA条形码在黄毛鼠种类鉴定中的比较

目的 比较CO Ⅰ、Cytb、16S rRNA、D-loop四个DNA条形码对黄毛鼠鼠种的鉴定效果.方法 将大榭港区捕获的1只黄毛鼠样本HX41,提取基因组DNA,使用特异性引物对线粒体CO Ⅰ、Cytb、16S rRNA、D-loop基因进行扩增并对扩增产物进行测序.将测序结果与GenBank中的相似鼠种DNA构建分子进化树进行同源性分析.结果 以CO Ⅰ、Cytb、D-loop基因所构建分子进化树中,黄毛鼠均能独立形成分支,且HX41均处于黄毛鼠分支上.HX41的CO Ⅰ基因序列与黄毛鼠HN158株遗传距离最为接近,值为0.0034;Cytb基因序列与黄胸鼠HN99株遗传距离最为接近,值为0.0355,但HN99鼠种数据存在错误;D-loop基因序列与黄毛鼠HN105株遗传距离最为接近,值为0.0439.由于现有GenBank中缺少黄毛鼠16S rRNA基因序列,无法构建进化树.结论 对鼠种进行分子鉴定时,有必要根据GenBank数据库的完整性和准确性选择合适的DNA条形码.     

环介导等温基因扩增技术快速检测不耐热型肠毒素大肠杆菌反应条件的优化

[目的]建立环介导等温基因扩增技术快速检测食源性致病菌不耐热型肠毒素大肠杆菌的方法。[方法]基于产肠毒素大肠杆菌的LT基因序列设计1套(共4条)能识别6个区域的特异性LAMP引物,优化引物加入量、反应温度以及反应时间等反应条件,最终评估该方法的特异性和灵敏性。[结果]引物加入量对扩增影响较大;在扩增温度为63℃时扩增最明显;扩增反应进行到45min后即有扩增产物产生。[结论]该方法检测不耐热型肠毒素大肠杆菌具有耗时短、操作简捷、特异性较好、灵敏性高等优点。     

基于Cytb基因序列对入境集装箱中截获的疑似鼠样本的种类鉴定

目的根据线粒体Cytb基因部分序列,对从入境集装箱中截获的疑似鼠样本进行鉴定种类。方法提取样本中的DNA,采用PCR方法进行线粒体Cytb基因扩增,对目的片段测序,通过blast比对进行同源性比对。从Genbank获取宁波口岸常见8个鼠种24个样本的Cytb基因序列作为参照,利用生物信息学软件Mega5.0进行系统进化分析。结果样本DXR1110与小家鼠同源性最高,DXR1203与褐家鼠同源性最高,系统进化树显示不同鼠种间形成独立分支。结论Cytb基因分析是进行鼠种鉴定的有效手段。     

基于Cytb基因序列对入境集装箱中截获的疑似鼠样本的种类鉴定简

目的根据线粒体Cytb基因部分序列,对从入境集装箱中截获的疑似鼠样本进行鉴定种类。方法提取样本中的DNA,采用PCR方法进行线粒体Cytb基因扩增,对目的片段测序,通过blast比对进行同源性比对。从Genbank获取宁波口岸常见8个鼠种24个样本的Cytb基因序列作为参照,利用生物信息学软件Mega5.0进行系统进化分析。结果样本DXR1110与小家鼠同源性最高,DXR1203与褐家鼠同源性最高,系统进化树显示不同鼠种间形成独立分支。结论Cytb基因分析是进行鼠种鉴定的有效手段。     

16SrRNA基因检测在自发性腹膜炎快速诊断中的应用价值

目的探讨运用16S rRNA基因检测技术在快速诊断自发性腹膜炎的临床价值。方法针对16S rRNA区域的恒定区,设计一条通用引物,对已知病原菌、人类基因组DNA、巨细胞病毒和白色假丝酵母菌进行PCR扩增,检验方法的特异性,用倍比稀释法检测方法的灵敏性。然后用此方法检测自发性腹膜炎患者的腹水样本,并与培养法进行比较分析。结果已知病原菌均扩增出了特异产物,人类基因组DNA、巨细胞病毒和白色假丝酵母菌无相对应产物,PCR敏感性可达1 pg大肠杆菌DNA。69例腹水样本PCR方法检测阳性率为33.3%,培养法阳性率为14.5%,PCR法阳性率显著高于培养法(P0.05)。结论 16S rRNA基因检测技术具有检测时间短、敏感性高、结果准确可靠等优点,具有重要的临床应用价值。     

新型冠状病毒N亚基因组荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立一种快速检测新型冠状病毒N亚基因组(SgN)的方法, 探讨其在新型冠状病毒肺炎病例及环境样本中的应用价值。方法根据全球共享流感数据库(GISAID)公布的新型冠状病毒全基因组序列设计SgN特异性引物和探针, 优化退火温度、引物与探针浓度等反应条件, 建立新型冠状病毒SgN荧光定量PCR检测方法, 绘制标准曲线, 评价该方法的灵敏性、重复性和特异性。采用建立的病毒SgN荧光定量PCR检测方法检测21份环境和351份临床样本, 并选取25份SgN阳性样本进行病毒分离以评估该检测方法的应用效果。结果 SgN的引物和探针对新型冠状病毒具有良好特异性。初步建立的病毒SgN荧光定量PCR检测方法最低检测限为1.5×102copies/ml, 变异系数小于1%。372份样本的gRNA阳性率为97.04%(361/372), gRNA阳性样本中阳性环境样本和阳性临床样本的SgN阳性率分别为36.84%(7/19)和49.42%(169/342)。其中野生型毒株样本的SgN阳性率及拷贝数均比德尔塔(Delta)毒株低。在25份SgN阳性样本中, 采样时间在5 d内的12份样本均分离到病毒;13份...     

甘肃省新记录鼠种-索氏仓鼠的分子鉴定

目的通过扩增线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)和细胞色素b(Cytb)基因,鉴定在兰州中川国际机场鼠类调查中新发现的鼠类。方法将新发现的6只鼠类,采集肝脏组织,提取DNA,用PCR方法扩增COⅠ和Cytb基因并测序;通过遗传距离和系统进化分析鉴定鼠种。结果 6个样本成功扩增出COⅠ和Cytb基因序列分析显示,样本序列与索氏仓鼠同源性最高,均大于99%;在系统进化树中与索氏仓鼠聚在同一分支,从而确定该样本为索氏仓鼠。结论兰州中川国际机场口岸鼠类调查中新发现的鼠种为索氏仓鼠(Cricetulus sokolovi),是甘肃省首次发现。     

广东国境口岸五种蚊种核糖体基因第2内转录间隔区分子鉴定方法研究

[目的]建立国境口岸不同蚊种的核糖体基因第2内转录间隔区（rDNA-ITS2）分子鉴定方法及其系统进化关系。[方法]针对蚊虫的rDNA核酸序列保守性，设计扩增rDNA-ITS2编码区的PCR引物，对广州机场、江门和湛江等国境口岸采集的致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊等成蚊和实验室喂养的蚊幼虫进行PCR扩增和序列测定，并与GenBank中已知蚊虫的rDNA-ITS2进行同源性比较和系统进化分析。[结果]不同蚊虫的rDNA-ITS2扩增片断长度不同，M2引物对致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊和中华按蚊的扩增片断分别为447bp-520bp、432bp-438bp、527bp-586bp、439bp-448bp和644bp。序列分析和系统进化关系显示，尖音库蚊组和三带喙库蚊聚类为库蚊属，再与白纹伊蚊和骚扰阿蚊聚类为库蚊亚科，库蚊亚科再与中华按蚊进行聚类，分子进化与蚊虫形态学鉴定的亲缘关系保持一致。[结论]建立的rDNA-ITS2分子鉴别技术可成功地应用于国境口岸范围内成蚊和幼蚊的亚科、属和种的区分和确定系统发育关系。这可以弥补蚊虫形态特征信息量的不足等传统分类系统的缺点，对国境口岸范围外来的或新发现的蚊种的鉴别提供了分子水平的技术依据。     

DNA条形码技术在鉴定蛆症异蚤蝇中的应用

目的:建立应用DNA条形码技术鉴定蛆症异蚤蝇的方法。方法:分别提取在口岸检疫中截获的双翅目幼虫和成虫的基因组DNA,利用节肢动物线粒体细胞色素氧化酶I(COI)的通用引物进行DNA扩增。PCR产物直接测序,测序引物同扩增引物,得到清晰可读的665 bp COI的DNA片段碱基序列。与GenBank中相近的序列进行比较,并用ClustalW2在线建立NJ系统发育树。结果:成虫和幼虫COI的DNA序列100%相同,与GenBank中公布的长度为559 bp的蛆症异蚤蝇的COI相应片段相似性高达98.9%,与同属其他种类的可比片段的DNA序列相似性则低于90%。结论:根据结果可以判断所截获的双翅目昆虫为蛆症异蚤蝇。本文的研究再一次证明了DNA条形码技术可以直接应用于昆虫种类的鉴定。     

国境口岸常见11种蚊虫DNA条形码分子鉴定研究

目的通过研究国境口岸常见11种蚊虫的细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因序列差异性,并分析其系统进化关系,建立口岸常见蚊种的分子鉴定方法。方法设计l对扩增COI部分编码区的PCR引物,对广东、海南和云南等国境口岸采集的致倦库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊等常见11种成蚊进行PCR扩增和序列测定,依据COI核苷酸序列进行系统进化分析。结果 11种蚊虫的COI基因扩增片断长度均为650 bp左右,A+T含量为66.51%~69.97%。同源性比较表明,同一蚊种间核苷酸序列同源性为94.8%~100.0%;不同蚊种间核苷酸序列同源性为77.7%~91.8%。系统进化关系显示,从种的水平上看,白纹伊蚊、致倦库蚊、中华按蚊等上述所有蚊种均聚集成簇,即同种之间呈明显的聚集,与形态学鉴定结果相一致。在属的水平上,库蚊属、阿蚊属、伊蚊属等均聚集成簇,形成各自的单独一支;各属间,阿蚊属与伊蚊属先聚类,再分别与库蚊属、曼蚊属聚类为库蚊亚科,按蚊属与上述蚊种亲缘关系较远。结论本次研究中的COI基因差异可作为国境口岸常见11种蚊虫分类鉴定的分子标记,为口岸常见蚊种的分子鉴定提供帮助,也可为口岸外来的或新发现的蚊种的鉴别提供分子水平的技术依据。     

重组酶介导扩增方法快速检测黄热病毒

目的本研究采用重组酶介导的等温核酸扩增方法(RAA),通过使用逆转录酶,建立黄热病毒的一步法等温核酸扩增(RT-RAA)方法。方法根据黄热病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析RT-RAA的重复性、特异性、灵敏度;以所建立方法对黄热病毒样本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果黄热病毒RT-RAA扩增,体系中加入40 U的逆转录酶扩增效果最佳。该方法检测时间短(20 min),并且灵敏度高,检测下限可达100 copy,与登革病毒、西尼罗病毒、日本乙型脑炎病毒、基孔肯雅热病毒等蚊媒病毒无交叉反应,具有良好的特异性。结论构建的黄热病毒RT-RAA方法具有快速、特异以及灵敏的特点,适应于黄热病毒的口岸快速检测。