红芪多糖3作用小鼠胸腺组织蛋白双向电泳技术的建立

目的建立和优化红芪多糖3(HPS-3)作用后小鼠胸腺组织蛋白质组双向电泳技术方法。方法采用标准裂解法提取HPS-3 100 mg/(kg.d)灌胃14 d小鼠的胸腺组织总蛋白,后续进行三氯乙酸(TCA)-丙酮沉淀法和去脂蛋白纯化法获取胸腺组织蛋白,以固相pH梯度胶条进行双向凝胶电泳,并对等电聚焦程序进行改良和优化,同时将去脂蛋白纯化法运用于A549细胞蛋白的纯化并进行双向电泳,银染色后进行凝胶图像比较。结果去脂蛋白纯化法不仅能减少蛋白降解,而且增加蛋白的溶解性,因此去脂蛋白纯化法所得蛋白的双向电泳图谱显示更好的溶解性和重复性,此外在双向凝胶电泳(2-DE)时,聚焦电压在传统聚焦条件上进行优化,使横向和纵向拖尾有明显改善,成功建立了背景清晰,蛋白分离良好、分辨率较高的胸腺组织蛋白的双向电泳体系。去脂蛋白纯化法同样适用于A549细胞蛋白提取纯化。结论建立了HPS-3作用后小鼠胸腺组织蛋白质组提取纯化的方法,采用去脂蛋白纯化法可以更有效地提取胸腺组织蛋白。利用优化后的实验方法,获得了HPS-3作用后小鼠胸腺组织蛋白2-DE图谱,为后续研究打下基础。     

鹿尾腺总蛋白双向电泳体系的建立

目的:建立一套适用于鹿尾腺总蛋白分析的双向电泳体系,为实现通过蛋白质组学研究手段探究鹿尾腺的组织发育及其发挥药理作用的机制奠定基础.方法:使用三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法、饱和酚抽提法和Trizol法3种方法提取鹿尾腺中总蛋白,采用固相pH梯度胶条进行双向电泳,并对蛋白上样量和等电聚焦参数进行选择和优化,凝胶考马斯亮蓝染色后用PDQuest 8.0软件进行图谱分析.结果:Trizol法得到的总蛋白质纯度最高,能满足双向电泳分析对样品的要求,蛋白质样品在7 cm pH 3 ～ 10 IPG胶条上,上样量为300 μg,按优化的程序Ⅱ进行双向电泳,可以得到较满意的双向电泳图谱,此时清晰可见蛋白点数多达209个.结论:通过优化双向电泳条件,建立了适合鹿尾腺蛋白质组学研究的双向电泳体系.同时该体系可以为其他类似的动物组织样品制备和双向电泳提供借鉴.     

舌苔蛋白质双向电泳技术的建立

目的：建立针对舌苔蛋白质组学研究的双向电泳及其相关技术体系。方法：采用超声裂解法提取舌苔蛋白，利用固相pH梯度等电聚焦对舌苔总蛋白进行双向电泳，银染后获得的双向电泳图谱进行ImageMaster 2D Platinum软件分析，并对实验条件进行调整优化。结果：成功构建了高重复性的舌苔蛋白质双向电泳图谱，共获得（1082±105）个蛋白质斑点，pI值主要集中在4～8之间。结论：通过相关条件的调整优化提高了双向电泳的分辨率，为后续舌苔蛋白质组学研究奠定了基础。     

墓头回提取物作用白血病K562细胞蛋白双向电泳方法的建立

目的建立适用于体外培养的K562细胞总蛋白的双向电泳图谱,提高电泳分辨率和重复性,以进一步了解中药墓头回作用于白血病细胞的新机制。方法采用标准裂解法提取K562细胞总蛋白,后续进行丙酮沉淀和三氯乙酸/丙酮沉淀,分别比较一步裂解法所得蛋白和丙酮沉淀法、三氯乙酸/丙酮沉淀法所得蛋白的双向电泳图谱,优选最佳的样品制备方法。此外在等电聚焦时,聚焦电压在传统聚焦条件上进行优化。结果 丙酮沉淀法不仅能减少蛋白降解,而且增加蛋白的溶解性,因此丙酮沉淀法所得蛋白的双向电泳图谱显示出更好的溶解性和重复性,在聚焦条件上对传统聚焦条件的优化使横向和纵向拖尾有明显改善,所得图谱蛋白点更清晰,分离更完全,能获得分辨率较高的双向电泳图谱。结论 在标准裂解液提取蛋白基础上结合丙酮沉淀法更适于制备K562细胞的双向电泳样品,等电聚焦(IEF)电泳时适当延长除盐时间能更有效的分离K562细胞全蛋白,而且后续实验证明此方法同样成功建立了墓头回作用白血病K562细胞蛋白和肿瘤组织蛋白2-DE图谱。     

三斑海马蛋白质组学双向电泳技术的建立与优化

目的:建立适于三斑海马干药材蛋白质组研究的双向电泳技术,为后期进行深入的中药材海马蛋白组学研究奠定基础。方法:对影响蛋白质双向电泳的几个关键环节——提取方法、裂解液、纯化方法、上样量进行优化,筛选最佳方法流程。结果:优化出的海马蛋白质提取方法为液氮研磨法,最佳蛋白质提取裂解液为7 mol·L~(-1)尿素,2 mol·L~(-1)硫脲,含4%Chaps,1 mmol·L~(-1)PMSF,65 mmol·L~(-1)DTT和0.2%Bio-Lyte,最佳蛋白质纯化方法为超滤+TCA丙酮沉淀两步纯化法,双向电泳最佳上样量为300μg。Image master 7.0软件对电泳图谱分析共检测出三斑海马蛋白质斑点236个,相对分子质量在14.4~97.4 k Da均有分布,分布差异不明显;蛋白质等电点主要分布在p H 4~9,其中以碱性蛋白质最为丰富。结论:利用上述方法所得的双向电泳图谱斑点清晰、分离均匀,图谱质量佳,该方法流程适合三斑海马药材蛋白质组学分析。该研究能为后期进行深入的海马蛋白质组学研究,筛选特征性蛋白质奠定基础。     

雪莲组织中蛋白质提取方法比较

目的:比较雪莲组织中蛋白质的提取方法.方法:采用酚法、TCA/丙酮法、尿素法提取雪莲组织中蛋白质,所得蛋白质进行一维SDS-PAGE和双向电泳检测,通过比较电泳图谱确定雪莲组织中蛋白质的最佳提取方法.结果:酚法提取的雪莲组织蛋白质杂质量最少、纯度最高,一维SDS-PAGE和双向电泳图谱显示其具有较多的蛋白质点,且蛋白质种类较多.结论:3种提取方法均有一定的蛋白质损失,建议采用酚法从雪莲组织中提取蛋白质,为雪莲蛋白质组学研究提供参考.     

人参皂甙Rbl作用后大鼠神经细胞蛋白质组双向电泳技术的建立

目的:建立人参皂甙Rbl作用后大鼠神经细胞蛋白质组双向电泳分离体系,提高其分辨率和重复性。方法:人参皂甙Rbl 50mg/L作用于大鼠神经细胞,提取全蛋白,按标准条件对蛋白质进行双向电泳分离,并对各个关键因素进行了优化。结果:最终选择的裂解液配方是1%TBP,4%CHAPS,0.2%Bio-Lyte,40mmol/L Tris,8mol/L尿素,2mol/L硫脲;使用pH 4～7的IPG胶条进行被动水化上样,等电聚焦采用缓慢升压模式,电泳参数根据Bio-Rad公司的预设方案进行调整;改良硝酸银法进行蛋白质斑点染色。从而获得了满意的蛋白质组双向电泳图谱。结论:成功建立了人参皂甙Rbl作用后大鼠神经细胞蛋白质组双向电泳分离体系,具有较高的分辨率和重复性。     

瓜蒌种子蛋白质6种提取方法比较

目的:建立适合于瓜蒌种子的蛋白质提取方法。方法:比较水溶液直接提取法(3种)、三氯乙酸(TCA)-丙酮法、三羟甲基氨基甲烷(Tris)-丙酮法、蛋白质提取液提取法等6种蛋白质提取方法所获瓜蒌种子总蛋白含量、聚丙烯酰胺凝胶电泳的谱带等方面的差异。结果:蛋白质提取液提取法、TCA-丙酮法提取蛋白含量较高,但杂质多,电泳谱带严重展宽而且明显拖尾;Tris-丙酮法提出的蛋白质种类缺失严重;直接提取法提取蛋白含量少,但杂质少,电泳谱带清晰,离心2次谱带更加清晰。结论:水溶液直接提取法最适合用于聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质提取液提取法提出蛋白质含量最多。     

均匀设计优选驱虫斑鸠菊的半仿生提取工艺研究

目的 优选驱虫斑鸠菊的半仿生提取的最佳工艺条件.方法 以指纹图谱共有峰HPLC总面积、总黄酮、干浸膏得率等为综合评定指标,采用均匀设计及指纹图谱优选驱虫斑鸠菊半仿生提取法的条件.结果 优化条件结合工业生产实际,确定其半仿生提取法工艺条件为:3次煎煮用80%乙醇的pH值依次6.0、6.5、8.0;煎煮时间依次为I、0.5、0.5 h.结论 驱虫斑鸠菊的提取工艺采用半仿生提取,均匀设计优选相关参数效果较好.     

怀地黄和怀山药多糖同步提取工艺研究

目的 对怀地黄[Rehmannia glutinosa f.Yhueichingensis (Chan et Schih)Hsiao,简称RG]多糖和怀山药(Dioscorea opposite Thumb f.Yhueichingensis Hsiao,简称DT)多糖同步提取方法的工艺参数进行了研究.方法 选取提取温度、提取液pH、固液比3个因素,以多糖含量作为指标,通过L9(33) 正交实验确定最佳工艺参数.结果 怀山药与怀地黄多糖同步提取的最佳工艺参数为:浸提温度65℃,浸提液pH 5.5,固液比为1:30;浸提液浓缩比为4:1,沉降剂乙醇添加量5倍于浸提液体积;采用Sevage法去除蛋白质,提取得到的怀山药与怀地黄同步多糖含量及得率可分别为73.68%和12.67%.结论 用同步提取法得到的多糖含量及得率优于分步提取.     

连作对怀地黄块根生长和品质的影响

通过大田试验,研究了连作对怀地黄块根生长和品质的影响。结果表明:连作可以明显抑制地黄植株的生长,降低地黄块根鲜干重和梓醇、多糖含量。     

土壤含水量对地黄产量及质量的影响

目的：评价土壤含水量对地黄产量及质量的影响。方法：在地黄生长期的不同阶段调整土壤的含水量,收获后测定不同含水量土壤所产地黄药材的产量、浸出物和梓醇、毛蕊花糖苷及多糖的含量,使用灰色模式识别法对实验数据进行分析。结果：土壤含水量影响为中水分（M2>高水分（M3）>低水分（M1）>空白（M4）。结论：地黄栽培过程中,土壤含水量在苗期应保持在40%-50%,块根形成期和块根膨大期应为50%-60%,收获期应为20%-30%,合理调节土壤含水量能够显著提高地黄的产量及质量。     

半夏总蛋白提取及其动态变化研究

目的优选出半夏总蛋白提取的最适方法并研究不同生长时期总蛋白量及成分的变化,为半夏药用成分的监控及合理采收提供科学依据。方法采用丙酮沉淀法、95%(NH4)2SO4盐析法、TCA-丙酮法和Tris-饱和酚法提取半夏总蛋白,筛选半夏总蛋白提取的最佳方法。分别于半夏出芽期、全苗期、珠芽期、佛焰苞期及倒苗期采集样品,分为新鲜组和干燥处理组,提取样品总蛋白,进行SDS-PAGE电泳检测及Bradford浓度测定。结果丙酮沉淀法、95%(NH4)2SO4盐析法、TCA-丙酮法和Tris-饱和酚法提取的半夏总蛋白量分别为0.369、0.678、1.082、0.493 mg/mL;新鲜半夏5个不同生长时期总蛋白量占块茎的质量分数分别为出芽期4.53 mg/g、全苗期2.28 mg/g、珠芽期2.79 mg/g、佛焰苞期7.61 mg/g、倒苗期10.21 mg/g;干燥半夏5个不同生长时期总蛋白量占块茎的质量分数分别为出芽期31.85 mg/g、全苗期18.52 mg/g、珠芽期42.08 mg/g、佛焰苞期28.56 mg/g、倒苗期56.84 mg/g;新鲜半夏块茎中蛋白含有15条蛋白带,干燥处理半夏块茎中蛋白含有5条蛋白带。结论 TCA-丙酮法是半夏总蛋白提取的最佳方法,不同生长时期的半夏块茎中蛋白成分各异,倒苗期总蛋白量最高。     

地黄饮片HPCE指纹图谱研究

目的:建立地黄饮片HPCE指纹图谱分析方法,并对地黄及其炮制品的指纹谱进行比较。方法:采用高效毛细管电泳法进行色谱分离,以60 mmol/L硼砂(5%甲醇,pH 9.5)为运行缓冲液,分离电压为20 kV,波长为210 nm,以梓醇为参照物,测定其指纹图谱,并作模糊聚类法分析和相似度评价。结果:初步建立了以7个共有峰为特征指纹信息的地黄饮片HPCE指纹图谱;发现少数地黄饮片的指纹图谱有一定差异,生品与其炮制品的指纹谱中共有峰相对峰面积差异显著。结论:方法准确可靠,重现性好,可作为地黄饮片内在质量评价的依据。     

丹参、生地黄中miRNA在人体血液中分离、鉴定及表达分析

目的:通过Northern印迹杂交(Northern blot)验证丹参、生地黄中微小核糖核酸(miRNA)的存在,及水煎服用后通过消化道可进人人体血液中.方法:根据已知丹参、生地黄miRNA序列设计合成10条(丹参4条,地黄6条)特异的LNA反义寡核苷酸探针,并用地高辛标记.在室温25℃条件下,用通用植物miRNA提取试剂盒和血液(液体样本)miRNA提取试剂盒,并按照试剂盒提供的操作步骤提取新鲜丹参、地黄以及服用丹参、生地黄水煎剂后人体血液的Total RNA,在变性条件下(15％的尿素变性)PAGE电泳分离小RNA,转膜、交联、杂交和检测.结果:Northern blot表明,丹参只有2种miRNA即miR156和miR157表达,生地黄miR5140,miR5139,miR 5138,miR 5137,miR 5142,miR 5141等6种miRNA均有表达.丹参处理组无miRNA表达,生地黄处理组中有miR5140,miR5137,miR5141等3种miRNA表达.结论:验证了丹参、生地黄中miRNA的存在,初步证明了生地黄经水煎后部分miRNA可通过消化道进入人体血液中,为研究miRNA在中药疗效的作用机制提供了新的思路和策略.     

西南中山地区玄参生长发育规律的研究

通过田间试验,对西南中山地区玄参不同生长期进行动态采样调查。根据玄参各器官生长变化及干物质积累特点,将玄参的个体发育分为4个时期,即苗期、茎叶生长期、块根膨大期和块根充实期。玄参一生共形成叶片约370片(主茎叶50片左右)。茎叶生长期的叶面积增长速度最快,平均日增量为225 cm2,8月中旬叶面积达到16 270 cm2/株。整个生育期内叶面积系数随着茎叶的生长直线上升,茎叶生长期和块根膨大期维持在8以上,块根充实期迅速降低至0。叶面积比率总体呈降低的趋势。净同化率的变化幅度较窄,一般为1~3 g·m-2·d-1,分别在苗期和块根充实期出现了2个小高峰。比叶面积值苗期较高,生长中期有所下降。相对生长率值变化幅度较大,苗期最高,茎叶生长期迅速降低,块根膨大期有所升高,块根充实期下降,甚至出现负值。作物生长率茎叶生长期至块根充实期前期相对较高,苗期和块根膨大期后期较低。干物质积累规律为苗期慢,茎叶生长期和块根膨大期快,块根充实期减慢,略微降低,整个过程呈S曲线。生长中心由茎叶逐渐转移至块根。准确掌握玄参生长发育时期、干物质积累特点及其生长参数的变化规律,可为生产中制定合理的栽培管理技术措施提供依据。     

地黄化感自毒作用消减技术研究

目的:探讨不同消减技术措施对地黄化感自毒作用的影响.方法:以连作障碍消减率为指标,研究添加石灰氮、微生物菌剂及清水淋洗等土壤处理方法,牛膝轮作及绿肥施用,以及育苗移栽等方法对地黄化感自毒作用的消减程度.结果:以育苗移栽法效果最好,在出苗后20 d带土移栽和裸根移栽的连作障碍消减率分别达到了76.80%,71.70%;其次为添加微生物菌剂法,在添加剂量为中等剂量25 g时,连作障碍消减率能达到54.25%;以清水淋洗法和牛膝轮作及绿肥施用法的效果最差,尤其是不经牛膝轮作仅施用牛膝绿肥时,连作障碍消减率为负值,即加重了地黄的化感自毒作用.结论:除仅施用牛膝绿肥外,以上技术措施均能在一定程度上消减地黄的化感自毒作用.     

鲜地黄中α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的提取与初步纯化

目的:从鲜地黄中提取并初步纯化α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。方法:以总酶活为考察指标,通过正交试验确定两种酶的最佳提取条件。以酶活力和蛋白质含量为考察指标,确定两步盐析法的硫酸铵饱和度。结果:提取温度和溶剂量对α-Gal的提取具有显著性影响,而提取溶剂对-βG lu的提取具有显著性影响,因此确定以3倍量(v/w)磷酸盐缓冲液,4℃提取4 h为两种酶的最佳提取条件。以30%和60%为两步盐析的最佳硫酸铵饱和点。结论:鲜地黄中存在α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶,两步盐析法可以使二者得到初步纯化。     

野生地黄种内遗传多样性的RAPD，ISSR分析

目的：分析野生地黄群落之间的遗传差异类型，比较RAPD和ISSR分子标记在分析地黄野生种质遗传多样性中的应用。方法：应用RAPD和ISSR分子标记技术，对55份地黄材料进行了遗传差异分析。结果：平均每条RAPD引物扩增出1600条带，平均每条ISSR引物扩增出1908条带，多态性位点百分率分别为8958%和9432%；聚类分析表明，55份地黄分成7大类群。结论：野生地黄具有丰富的遗传多样性；不同地理居群的相似性为063～098；ISSR标记比RAPD标记能检测到地黄种内更高的遗传差异性。