1121例慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区的耐药突变分析

目的 分析大样本慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶基因上的多位点核苷(酸)类似物的耐药相关突变情况及其临床意义.方法 提取1 121例患者血清HBV DNA,采用巢式PCR方法 扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,对12个位点上的耐药相关突变进行检测,并结合临床资料进行分析.结果 检出拉米夫定(LAM)耐药突变228例,阿德福韦(ADV)耐药突变32例,恩替卡韦(ETV)耐药突变13例,替比夫定(L-dT)耐药突变4例.多药耐药5例.LAM耐药突变中以M204V和M2041最常见,前者通常伴随U80M突变,后者常单独出现;ADV耐药突变中以N236T±A181位碱基替换为主;ETV耐药突变发生在LAM耐药基础上,以T184位碱基替换为主;L-dT的耐药突变为M2041.结论 用基因序列测定法检测HBV RT基因多位点耐药相关突变,有助于临床及时发现乙肝患者是否存在HBV基因耐药,合理进行抗病毒治疗.     

慢性HBV感染患者恩替卡韦基因型耐药突变特征分析

目的分析经核苷(酸)类似物治疗的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者反转录酶(RT)区恩替卡韦(ETV)基因型耐药突变特征及其临床意义。方法提取3800例慢性HBV感染患者血清中的HBV DNA,采用巢式PCR法扩增HBVRT基因,PCR产物直接测序检测RT突变,分析与ETV耐药相关突变的形式及其临床意义。结果 3800例慢性HBV感染患者中,128例(3.4%)检出38种ETV基因型耐药突变,以rtT184位点替换突变最常见(79/128,61.7%),包括7例rtT184/rtS202G位点同时突变。共有5种替代突变形式rtT184L/I/A/S/F,其中rtT184L(29/30)、rtT184A(7/7)和rtT184S(10/12)均伴随rtL180M+rtM204V突变,而rtT184I多伴随rtM204I突变(7/8)。rtS202位点突变33例(25.8%),全部为rtS202G,包括7例rtT184/rtS202G位点同时突变,多伴随rtL180M+rtM204V突变。rtM250位点突变23例(18.0%),其中rtM250L(15/17)常伴随rtM204I突变,而rtM250V均伴随rtL180M+rtM204V突变(5/5)。仅6例(4.7%)检出rtI169T突变并均伴有rtT184位点的突变。还检出同时含有ETV及阿德福韦(ADV)耐药位点的多药耐药突变3例。ETV耐药突变多出现在拉米夫定(LAM)和ETV经治的患者(96/128,75.0%),其中以LAM→ADV→ETV(42例)和LAM→ETV(28例)为主;还出现在LAM经治而未用过ETV治疗的患者(27/128,21.1%),其中以LAM单一治疗(10例)和LAM→ADV(9例)为主。结论慢性HBV感染患者抗病毒治疗中出现的ETV耐药突变多见于单药序贯治疗,突变形式以rtL180M+rtM204V+rtT184L或rtS202G为主,而rtI169T突变在ETV耐药中不起重要作用。     

DNA序列测定法与实时荧光PCR法检测YMDD突变结果的比较

目的比较DNA序列测定法与实时荧光法检测YMDD突变的结果,并对除YMDD突变之外的耐药相关基因突变及其意义进行讨论。方法收集89例慢性乙肝患者的92份血清样本,均用实时荧光PCR法做YMDD突变检测。采用巢式PCR法扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,采用NTI软件比对结果,并对RT基因上其他11个已知耐药相关突变位点进行分析。结果在37份YMDD突变阴性的样本中,DNA测序法检测结果为33份M204M(未突变)、1份M204I、3份M204V;4份YMDD突变阳性样本均为突变/未突变序列共存;另检出7份样本存在ADV耐药相关突变,占18.9%(7/37)。在55份YMDD突变阳性样本中,DNA测序法检测到52份,阳性结果符合率为94.5%(52/55);另检出5例存在ADV或ETV耐药相关突变,占9.1%(5/55)。结论DNA序列测定法检测HBVRT基因耐药相关突变敏感性高,重复性好,与实时荧光PCR方法的检测结果有较高的符合率,可同时检出YMDD突变以外的各种耐药相关突变,有助于临床全面了解患者对核苷(酸)类似物的耐药情况,合理地制订抗HBV治疗方案。     

拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者HBV聚合酶基因的突变模式分析

目的 分析慢性乙型肝炎患者在拉米夫定(LAM)治疗过程中出现LAM耐药后,HBV聚合酶基因的突变模式及临床特征.方法 对2005年12月-2007年12月于第二军医大学长海医院住院或感染科门诊诊治的慢性乙型肝炎LAM耐药患者进行HBV聚合酶基因测序,回顾性分析LAM耐药时HBV聚合酶基因的不同突变模式及患者临床特征.结果 215例患者诊断为LAM耐药,192例患者检测到LAM相关的HBV聚合酶基因突变.患者血清HBV DNA水平为6.25±1.31(log10拷贝/ml),ALT中位水平为75U/L(19～821U/L),72.4%(139/192)的患者出现ALT升高、肝炎发作.99.0%(190/192)的患者存在YMDD基序突变,其中4种主要突变类型是:rtM204I(33.9%),rtL180M rttM204V(26.0%),rtLl80M rtM204I(21.9%)rtV173L rtL180M rtM204V(11.5%).与rtM204I相比,rtM204V多以联合rtL180M突变的形式存在(P<0.05).LAM耐药时,4种突变类型患者的血清HBVDNA、ALT岍差异均无统计学意义(P>0.05).结论 YMDD基序突变是LAM耐药后HBV聚合酶基因突变的主要模式,LAM耐药后患者临床病情轻重可能与HBV聚合酶基因突变类型无关.     

华北地区HBV基因亚型特点及其与核苷(酸)类抗HBV药物耐药突变的关系

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)基因亚型在中国华北地区的分布情况及其对核苷(酸)类药物基因型耐药突变发生率的影响。方法提取2377例慢性乙肝(1942例)和乙肝相关肝硬化(435例)患者血清HBVDNA,采用巢式PCR扩增反转录酶(RT)基因区,对PCR产物直接测序,根据所测RT/S基因序列构建系统进化树确定HBV基因亚型,检测RT区耐药突变,将数据录入HBVdb数据库进行分析。结果感染HBV各基因亚型的例数为B1型10例(0.4%),B2型344例(14.5%),B3型6例(0.3%),B4型8例(0.3%),C1型28例(1.2%),C2型1937例(81.4%),C3型21例(0.9%),C4型6例(0.3%),D型17例(0.7%)。B2和C2亚型患者之间在性别、HBVDNA载量、总胆红素、丙氨酸氨基转移酶/天冬氨酸氨基转移酶(ALT/AST)水平、胆碱酯酶、凝血酶原活动度方面差异无统计学意义(P0.05);慢性乙肝患者中,C2亚型病毒感染的拉米夫定耐药突变V173L、L180M、M204I和阿德福韦酯耐药突变A181V检出率显著高于B2亚型病毒感染(P0.05);乙肝相关肝硬化患者中,B2亚型病毒感染的阿德福韦酯耐药突变N236T检出率显著高于C2亚型病毒感染(P=0.014)。结论我国华北地区流行的HBV以C型和B型为主,其中C2和B2为主要亚型,HBV基因亚型可能会影响临床核苷(酸)类药物的耐药突变发生率。     

慢性乙肝患者HBV反转录酶区新变异rtL180M+A181C+M204V的鉴定及表型耐药特点分析

目的鉴定经核苷(酸)类似物序贯治疗的慢性乙肝患者HBV反转录酶(RT)区的新变异rtA181C,并分析其表型耐药特点。方法 2010年6月解放军302医院确诊的慢性乙肝患者1例,提取血清HBV DNA,巢式PCR扩增HBVRT全基因,采用PCR产物直接双向测序结合克隆测序分析HBV RT区12个耐药相关突变位点。构建代表性克隆重组表达载体pTriEx-HBV1.1,瞬时转染人肝癌细胞系HepG2细胞,转染4h后加入不同浓度拉米夫定(LAM,终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)、阿德福韦(ADV,终浓度为0、0.033、0.1、0.33、1、3.3μmol/L)、恩替卡韦(ETV,终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L)和替诺福韦(TDF,终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L),4d后采用实时荧光定量PCR检测不同药物浓度作用下培养细胞上清中HBV DNA的复制水平并分析其表型耐药特点。结果此例慢性乙肝患者序贯接受LAM治疗36个月→ADV治疗14个月→ETV治疗29个月,而后发生病毒学突破,HBV DNA由阴性升高至1.1×106IU/ml,ALT由正常升高至235U/L。直接测序显示HBV RT基因rtL180M+A181V+M204V变异,克隆测序得到18个克隆,其中9个为rtL180M+A181V+M204V变异株,7个为rtL180M+A181C+M204V变异株,1个为rtV173L+L180M+A181V变异株,1个为野生株。病毒复制力检测结果从高到低依次为:野生株>rtV173L+L180M+A181V>rtL180M+A181C+M204V>rtL180M+A181V+M204V。表型耐药分析显示,与野生株比较,rtL180M+A181V+M204V变异株和rtV173L+L180M+A181V变异株对LAM和ADV不敏感,rtL180M+A181C+M204V变异株对LAM和ETV不敏感。结论长期核苷(酸)类似物序贯治疗可引起多重耐药;rt181位点新的变异rtA181C与ETV长期用药有关,可能是新的ETV耐药变异位点。     

96例急性乙型肝炎患者HBV多聚酶区的耐药变异分析

目的检测未接受过核苷(酸)类似物(NA)治疗的急性乙型肝炎患者感染的HBV是否存在耐药变异。方法收集96例急性乙型肝炎患者住院早期血清,提取HBV DNA,采用巢式PCR方法扩增HBV反转录酶(RT)全基因,对PCR产物进行DNA双向测序,对RT/S基因序列进行分子进化树分析反基因分型,对rt80、rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt236和rt250等位点上的耐药相关变异进行分析,并用克隆测序法进行验证,每个样本测定10～20个克隆。结果用直接测序法检出NA耐药变异8例(8.3%),C型6例,B型2例。其中6例为拉米夫定(LAM)耐药变异,包括4例rtM204I、1例rtL80I+rtM204I和1例rtL180M+rtM204I;另2例检出与阿德福韦酯(ADV)耐药相关的rtA181V变异。变异株多数与野生型病毒株共存。克隆测序法的结果与直接测序法的结果大体相符,部分样本中有2种或多种耐药变异株共存,其中1例患者的样本中除LAM变异株外,还检出了ADV和恩替卡韦(ETV)耐药变异株,变异形式分别为rtA181T+rtN236T和rtL180M+rtS202G+rtM204V。结论未接受过NA治疗的急性乙型肝炎患者可以感染NA耐药株病毒,NA耐药病毒可以在人群中传播引起急性乙型肝炎,变异病毒的传播致病不只局限于LAM耐药株。     

乙型肝炎病毒多聚酶区rt229突变的流行特点及其对病毒复制力的影响

目的评价乙型肝炎病毒(HBV)多聚酶反转录酶(RT)功能域rt229突变对HBV复制力的影响。方法从慢性HBV感染患者血清中提取HBVDNA,使用PCR扩增RT区及前C区基因,采用直接测序法分析耐药相关位点的突变;克隆患者HBV全长基因组,获得S445-3及S869-4克隆并作为定点突变母本,以产生rt229突变的各种模式。使用无载体介导的方法将含有rt229突变的全长HBV基因组转染入HepG2细胞系中,转染3d后采用Real-TimePCR法定量检测HBV复制中间体水平。结果在受检的6000例患者中,394例(6.57%)存在rt229突变,与拉米夫定(LAM)治疗相关的占78.93%,明显高于其他患者[包括接受阿德福韦酯(ADV)治疗、初治和用药不详者]所占的21.07%。其中rtL229V、rtL229W和rtL229M单独突变分别占全部rt229突变的12.44%、1.78%和4.57%,未发现rtL229F单独突变株;rtL229V、rtL229W、rtL229M、rtL229F与LAM耐药突变共存分别占43.65%、9.14%、9.64%和14.97%;rtL229V、rtL229M与ADV耐药突变共存分别占2.54%和1.27%。复制力评价结果显示,相对于前C区G1896A单独突变株(S869-4),rtL229V、rtL229W、rtL229M和rtL229F突变将HBV复制力降低至2.92%、8.79%、26.04%和34.80%;相对于LAM耐药株(S445-3),伴随有rtL229V、rtL229W、rtL229M和rtL229F的LAM耐药株的复制力增加了1.18、2.29、2.49和2.51倍。结论 rt229位点的突变可降低HBV的复制力,增强LAM耐药株的复制力;rt229突变可能为LAM耐药突变的补偿突变。     

乙肝病毒多聚酶区rtL229突变的演变及其表型分析

目的分析乙肝病毒(HBV)多聚酶的反转录酶(RT)功能域rtL229突变的演变规律及其与拉米夫定(LAM)耐药的相关性。方法回顾性分析2010年8月在解放军302医院抗病毒治疗过程中发生rtL229F突变的1例慢性乙肝患者的临床资料,从其动态血清中扩增HBV RT基因并克隆测序(>20个克隆/样本)以观测rtL229F突变的演变过程。同时将含有不同突变形式(rtM204I、rtL229F以及rtM204I+rtL229F)的HBV DNA RT区基因定向克隆至HBV1.1载体中获得可复制的HBV复制子,将复制子转染HepG2细胞,在含或不含核苷(酸)类似物[LAM、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ETV)和替诺福韦酯(TDF)]的培养基中连续培养4d,采用实时荧光定量PCR法检测上清中产生的HBV DNA。结果 LAM治疗过程中,rtL229F突变可继发于rtM204I突变,而停用LAM后可逐渐回复为野生型。表型分析结果显示,单独rtL229F突变不改变病毒的药物敏感性,而与rtM204I突变联合后可以增强突变HBV的LAM耐药性。结论 rtL229F位点突变是LAM耐药突变的补偿突变,与LAM应答不佳相关,且对ADV、ETV及TDF敏感。     

恩替卡韦治疗拉米夫定失效慢性乙型肝炎的临床观察

目的观察恩替卡韦(ETV)治疗拉米夫定失效慢性乙型肝炎(CHB)的病毒学应答和耐药情况。方法对接受口服ETV(1.0mg/d,治疗疗程>12个月,基线HBVDNA≥104拷贝/ml)治疗的拉米夫定失效的41例CHB患者进行临床随访,定期检测其血清HBVDNA定量、乙型肝炎病毒标志物、肝功能及耐药情况。耐药检测采用半巢式PCR,对PCR产物进行直接测序,测序结果与GenBank报道的HBV序列进行同源性比对以检测ETV的耐药变异位点。结果41例患者接受ETV1.0mg/d治疗12个月时,39%(16/41)的患者HBVDNA转阴(<103拷贝/ml),64%基线ALT水平异常的患者ALT水平恢复正常(<40U/L),2名(7.7%)HBeAg阳性患者分别在治疗第10、12个月时获得HBeAg血清学转换。1例患者发生了ETV基因型耐药变异,耐药位点为rtL180M rtM204V rtS202G,该患者的基线血清中可检测到拉米夫定耐药突变(rtL180M rtM204V)。结论ETV(1.0mg/d)治疗拉米夫定失效CHB有效,但应警惕耐药变异的发生。     

乙型肝炎病毒的病毒学特点及其临床意义

乙型肝炎病毒(HBV)为嗜肝双链DNA病毒,病毒基因组特点如下:①病毒的多聚酶/反转录酶(RT)缺乏校对功能,使HBV较其他DNA病毒更易产生变异;②病毒基因组开放读码框架重叠,1个基因位点上的突变有可能同时引起2种病毒蛋白突变;③生命周期中存在稳定的共价闭合环状DNA(cccDNA);④可以整合到宿主细胞染色体DNA中;⑤病毒蛋白对某些宿主细胞基因表达具有反式调节作用.HBV的这些病毒学特点与乙型肝炎的慢性化和疾病进展密切相关.多位点检测HBV RT基因耐药突变对临床监测病毒耐药、合理进行抗病毒治疗十分重要,分析病毒基因组变异和检测cccDNA对深入了解HBV致病机制与疗效评价有积极意义.技术方法 的创新与改进是进行HBV临床病毒学特点研究的基础.     

慢性乙型肝炎患者血清HBV全长序列分析及复制力评价

目的 分析乙型肝炎患者HBV全长基因组序列并对其复制力进行评价.方法 从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV病毒DNA,PCR扩增HBV全长基因组,克隆到pGEM-Teasy载体中,每个样品挑选5～10个克隆测序,分析基因型以及全长基因组耐药相关的突变位点,并对个别位点进行定点突变.将克隆到pGEM-Teasy载体中的全长HBV基因组经BspQ Ⅰ/Sca Ⅰ双酶切后,转染入肝癌细胞系HepG2、Huh7.转染3d后榆测上清HmAg表达量及细胞内HBV复制中间体核心颗粒DNA载量,分析全长HBV基因组的复制力(1.0倍HBV复制模型).结果 从2份慢性乙型肝炎患者血清中成功获得5条HBV全长克隆,来自同一份血清的克隆核苷酸,其一致性为98%～100%,提示HBV存在准种特性.测序结果 表明5条HBV全长基因均为C型.通过定点突变又获得3个全长克隆.经序列分析发现,HBV反转录酶区存在A181V/S、L229M、V84M、M204I氨基酸位点的突变,前C/C区存在T1753C、A1762T、G1764A和G1896A核苷酸位点的突变.复制力分析提示上述位点突变后病毒复制力均有不同程度下降,L229M还可以进一步降低A181V突变株的复制力.结论 自行建立的无载体1.0倍HBV复制模型可在细胞内分泌抗原蛋白以及装配子代病毒,完成生活周期,这为下一步分析HBV的耐药表型打下了基础.此外,还可指导临床制定更加合理的抗病毒策略,筛选针对已出现或将来可能出现的耐药突变的新型抗病毒药物.     

乙型肝炎患者HBV前S/S抗原特异性变异表位亲和力分析

目的 比较慢性乙型肝炎(CHB)和慢性重型肝炎(CSHB)患者HBV前S/S蛋白特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)表位变异发生率差异和亲和力变化,探讨HBV感染的发病机制.方法 对2007年8月-2008年12月解放军302医院收治的385例乙型肝炎患者(CHB109例,CSHB 71例)样本进行型特异性PCR HLA-A2分型;对HBV前S/S基因进行PCR产物直接测序,分析13个HLA-A2限制性前S/S蛋白中的特异性CTL表位序列,并用分子进化树进行HBV基因分型;通过BIMAS程序预测和T2细胞结合实验分析表位变异对CTL亲和力的影响.结果 HLA-A2阳性患者180例(46.8%);HBV C基因型感染138例,其中CHB患者86例、CSHB患者52例.CHB和CSHB患者的S177-185、S204-212、S131-139、S183-191表位变异发生率有显著差异(P<0.01或P<0.05).BIMAS分析显示S204-212、S131-139和S183-191的表位变异形式对CTL结合的亲和力与未变异表位形式相比明显降低.T2细胞结合实验证实S131-139变异表位的亲和力较未变异表位降低了1.83倍.结论 某些HBV前S/S抗原特异性CTL表位的变异发生率在同为C基因型感染的CHB和CSHB患者间有明显差异;表位变异可引起对CTL的亲和力改变从而影响机体对HBV感染的免疫应答.     

HBV表型耐药方法的建立及临床分离株的表型耐药分析

目的建立HBV表型耐药分析方法 ,体外培养慢性乙型肝炎患者血清HBV分离株并系统分析其对拉米夫定(LAM)的敏感性。方法从1例LAM耐药慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA,PCR扩增RT基因,克隆到pGEM-Teasy载体中,随机挑选10个克隆进行DNA序列测定,并分析RT区LAM耐药相关的突变位点。用XhoI和NcoI双酶切pGEM-Teasy-RT及pTriEx-HBV(C),构建1.1倍HBV野生株和LAM耐药突变株的重组载体pTriEx-wRT和pTriEx-mRT,转染人肝癌细胞系HepG2细胞。转染60h后加入不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)的LAM,药物连续作用5d后,抽提病毒核心颗粒HBV DNA,通过实时荧光PCR及Southern blotting检测不同药物浓度作用下HBV DNA的复制水平。结果成功建立体外HBV表型耐药分析方法。野生未突变株重组载体pTriEx-wRT转染HepG2细胞后,随着LAM浓度的升高,HBV DNA水平明显下降,而突变株重组载体pTriEx-mRT转染HepG2细胞后,HBV DNA水平无明显下降,IC50值与野生株相比增加了2500倍。结论建立的HBV表型耐药分析方法对监测HBV耐药性具有可行性。     

血清病毒检出核苷(酸)类似物耐药突变的慢性乙肝患者PBMCs中HBV cccDNA基因突变特点分析

目的分析经核苷(酸)类似物治疗并已在血清病毒中产生耐药基因突变的慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMCs)中HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)反转录酶(RT)区的基因突变特点。方法收集2010年7月-2011年8月于解放军302医院住院的慢性乙肝患者30例,均经6个月以上的核苷(酸)类似物抗病毒治疗并已在血清中检测到耐药相关突变。采集与血清检测同一时间点的全血标本30份并分离PBMCs,提取总DNA,以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)消化+滚环扩增+跨缺口PCR方法扩增HBV cccDNA的RT区,分析9个位点的核苷(酸)类似物耐药相关变异。结果 30份样本中,16例检出HBV cccDNA,检出率为53.3%,PBMCs中HBV cccDNA检出率与HBeAg阳性率、血清ALT水平及血清HBVDNA载量均无显著相关性。在16例HBV cccDNA检出者中,B基因型5例,占31.3%,C基因型11例,占68.8%,与血清HBV基因分型结果一致。但是,与血清HBV均检出耐药突变株不同,16例PBMCs cccDNA中检出的病毒均是无核苷(酸)类似物耐药相关突变的野生株。结论在经核苷(酸)类似物治疗的慢性乙肝患者血清中HBV DNA产生耐药突变的情况下,PBMCs中HBV cccDNA仍以原始野生株为优势种群,推测PBMCs可能是体内HBV野生株的"存储库"。     

阿德福韦酯治疗失败的慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区新变异rtN236V的表型耐药特点分析

目的 鉴定1例阿德福韦酯(ADV)治疗失败的慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶(RT)区的新变异rtN236V,并分析其表型耐药特点.方法 从1例ADV治疗失败患者的血清中提取HBV DNA,采用巢式PCR扩增HBV RT区,将PCR产物克隆到pGEM-Teasy载体,转化JM109细胞.挑选34个阳性克隆进行DNA测序并分析耐药相关突变.构建1.1倍HBV野生株和耐药株重组载体,转染人肝癌细胞系HepG2细胞.转染4h后分别加入不同浓度的拉米夫定(LAM)、ADV、恩替卡韦(ETV)和替诺福韦(TDF),转染后第4天收集细胞培养液,采用实时荧光定量PCR法检测不同药物浓度作用下细胞培养上清中HBV DNA的产量,并分析其表型耐药特点.结果 该例患者在接受ADV治疗15个月后出现病毒学突破和生化学突破,测序结果显示34个克隆中,20个(58.8％)为rtN236V变异株,11个(32.4％)为rtN236T变异株,2个(5.9％)为野生株,1个(2.9％)为rtA181V+N236V变异株.rtN236T、rtN236V和rtA181V+N236V变异株的相对病毒复制力分别为野生株的89.43％、83.60％和75.44％.表型耐药分析显示:rtN236T株、rtN236V株和rtA181V+N236V株对ADV的敏感性分别为野生株的1/4.75、1/3.10和1/5.10,但对LAM、ETV和TDF均敏感.结论 在ADV长期治疗失败的慢性乙型肝炎患者血清病毒池中鉴定了新的变异形式rtN236V,并与rtN236T和rtA181V株伴随存在,该变异降低了病毒的复制力及对ADV的敏感性,可能是一个新的ADV耐药相关变异.     

G1764A/C1766T/T1768A三联突变对HBV核心启动子活性的上调作用研究

目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)荧光素酶表达载体,探讨HBV CP变异对下游基因转录活性的影响.方法 2005年5月至2008年3月于解放军302医院就诊的慢性乙型肝炎(CHB)及慢加急性肝衰竭(ACLF)患者各40例,采集血清提取HBV DNA,采用巢式PCR法扩增HBV CP片段,克隆至pGEM-T Easy载体.挑选含有CP相关变异位点的质粒,经Kpn Ⅰ/Bgl Ⅱ双酶切后,构建pGL3-CP荧光素酶真核报告质粒,并采用定点突变方法获得野生型质粒,将两者同时转染肝癌细胞系HepG2,48h后进行荧光素酶检测.结果 患者临床资料经统计分析后显示,CHB患者HBeAg阳性率和HBV DNA载量均高于ACLF患者(P<0.01),而TBIL含量则低于ACLF患者(P<0.01);对CP区热点突变频率分析后发现:G1764A/C1766T/T1768A三联突变在CHB患者中为0.0%(0/40),在ACLF患者中为12.5%(5/40,P<0.05).细胞转染结果显示:典型CP双联突变A1762T/G1764A病毒株的启动子活性为相应野生株的1.67倍,而G1764A/C1766T/T1768A三联突变病毒株的启动子活性为相应野生株的1.43～1.80倍.结论 HBeAg阳性率、TBIL水平、HBV DNA载量与乙型肝炎重症化相关,HBV CP中存在的A1762T/G1764A、G1764A/C1766T/T1768A突变有顺式激活下游基因转录活性的作用.     

乙型肝炎患者HBV前S/S蛋白特异性CTL表位变异分析

目的 比较慢性重型乙型肝炎(CSHB)与慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV前S/S蛋白特异性细胞毒性T细胞(CTL)表位变异的差异,探讨乙型肝炎重症化和慢性化的机制.方法 对262例乙型肝炎患者的血清样本进行HLA-A2分型;用巢式PCR扩增血清HBV前S/S基因并对PCR产物进行序列测定;根据HBV前S/S基因序列,用VirusBlast软件鉴定患者感染的HBV基因型;用Vector NTI软件对目前已知的13个HLA-A2限制性前S/S蛋白特异性CTL表位进行序列分析.结果 123例(46.9%)患者HLA-A2阳性,其中CSHB 71例,CHB 52例.CTL表位变异分析结果 如下:(1)两组间所有患者进行比较,患者S177-185和S338-347表位变异发生率有显著差异(P<0.05);(2)两组间HBV B基因型患者进行比较,患者S131-139、S183-191和S204-212表位变异发生率有极显著差异(P<0.01);(3)两组间HBV C基因型患者进行比较,CSHB组患者的S131-139表位较CHB组患者有增高(P=0.05).结论 某些HBV前S/S蛋白特异性CTL表位在CSHB与CHB患者间变异有明显差异,受病毒基因型影响,CTL表位变异可能与乙型肝炎的重症化和慢性化机制相关.     

结合基因型耐药突变检测与表型耐药分析探索乙肝病毒耐药的新认识

核苷(酸)类似物是临床上治疗慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染最常用的药物,但长期应用可引发病毒耐药,导致治疗失败。基因变异检测及表型耐药分析是发现和鉴定HBV耐药的基本方法,前者主要是应用基因测序或线性反向探针杂交等方法,检出已知的病毒耐药相关突变,后者则是在体外细胞水平确定携带有变异基因的HBV毒株对病毒复制力及核苷(酸)类药物敏感性的影响,是鉴定复杂与特殊HBV耐药变异的基本手段。我们通过技术创新,建立了敏感、特异、经济、高效的HBV基因型检测方法,进而建立了可靠的HBV复制力和表型耐药分析方法,广泛应用于临床样本分析,实现了对HBV耐药的早期发现及对新的非典型HBV耐药相关突变株的鉴定。我们近期在核苷(酸)类似物耐药和应答不佳的患者中检测到多种特殊和复杂HBV耐药相关突变,并结合临床资料,进一步对代表性变异株进行病毒复制力和表型耐药分析,取得了多项重要发现:①从大样本中检出和鉴定了多种多重耐药HBV变异株,并发现联合用药可协同抑制多重耐药HBV变异株的体外复制;②HBV rtL229替换可作为补偿变异,恢复拉米夫定耐药变异株rtM204I的病毒复制力;③rtM204Q是一种新的拉米夫定耐药相关突变;④rtA181C+rtL180M+rtM204V与恩替卡韦耐药相关;⑤同一耐药患者血清HBV虽检出耐药变异,但外周血单个核淋巴细胞(PBMCs)中的HBV cccDNA仍以原始野生株为优势种群,提示PBMCs为体内HBV野生株的"存储库",参与HBV肝外感染。上述发现对深入揭示HBV耐药变异的临床特点和发生机制,辅助临床合理制定并优化抗病毒治疗方案具有重要作用。     

接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者HBV反转录酶区新变异rtM204Q的表型特点分析

目的分析乙肝病毒(HBV)反转录酶(RT)区YMDD功能域新变异rtM204Q的表型特点。方法从1例接受拉米夫定(LAM)治疗的慢性乙肝患者血清中提取HBV DNA,扩增HBV全长RT区基因,PCR产物直接克隆到pGEM-Teasy载体中,随机挑选40个克隆进行DNA序列测定并分析耐药相关变异。将Xho I/Sph I双酶切后的RT片段与载体连接成含HBV 1.1倍基因组长度的重组载体。采用FuGENE HD试剂盒,将构建的含野生株和变异株的重组载体转染至人肝癌细胞系HepG2细胞。转染4h后加入不同浓度的核苷(酸)类药物[LAM终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L;阿德福韦酯(ADV)终浓度为0、0.033、0.1、0.33、1、3.3μmol/L;恩替卡韦(ETV)终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L;替诺福韦酯(TDF)终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L],隔天换药,连续作用4d后收集细胞上清,采用实时荧光定量PCR技术检测不同药物浓度下HBV DNA的复制水平,以分析变异株的表型特点。结果对从患者血清获得的37个克隆进行测序分析,结果显示13个(35.1%)为野生型,11个(29.7%)为rtM204Q突变型,2个(5.4%)为rtM204I突变型,10个(27.0%)为rtA181T突变型,1个(2.7%)为rtA181T+rtM204Q突变型。后4种变异株的复制力分别是野生株复制力的89.95%、46.28%、55.77%和34.44%(P<0.05)。前2种变异形式的表型耐药分析结果显示,rtM204Q对LAM的敏感性为野生株的1/75.68,而rtM204I对LAM的敏感性不及野生株的1/1000。rtM204Q和rtM204I株对ADV、ETV和TDF均敏感。结论 HBV RT区新的YQDD基序变异在一定程度上抑制病毒复制力,对LAM的敏感性降低,提示这可能是一个新的LAM耐药相关变异。