慢性淋巴细胞白血病患者免疫球蛋白重链片段及其突变状态的研究

目的 探讨我国慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者免疫球蛋白重链可变区基因(IgVH)突变状态、基因偏颇性及其预后价值.方法 应用多重PCR法检测CLL患者表达型IgVH片段使用情况及突变状态,并与患者生存和预后进行相关性分析.结果 ①共检测初诊CLL患者85例,80例(94.1%)成功测序.②IgVH片段的使用存在明显的偏颇性,其中常见的为VH3家族(32例,40.0%)、VH4家族(24例,30.O%),而VH5、VH6和VH7家族少见.VH4-39是最常见的VH基因片段.而J4和D3分别是JH家族和DH家族中使用频率最高的片段.③IgVH突变型56例(70.0%),非突变型24例(30.O%).其中VH3家族突变率为90.7%(29例),VH4家族突变率为62.5%(15例).④突变组与未突变组患者无进展生存时间(82个月和17个月,P=0.000)和总生存时间(90个月和41个月,P=0.009)差异均有统计学意义.⑤CLL患者IgVH CDR3区序列具重现性,2例VH片段为VH1-69的患者其CDR3序列与文献报道序列有很高的同源性.VH片段为VH1-18、VH3-7、VH3-23的患者中分别有2例CDR3序列完全相同.结论 不同地区间CLL患者IgVH基因家族使用情况和突变状态存在一定差异,IgVH CDR3区序列具重现性,推测相对有限的抗原参与了CLL的发病.     

应用多重PCR技术检测慢性淋巴细胞白血病IgVH基因突变

免疫球蛋白重链可变区（IgVH）基因突变是慢性淋巴细胞白血病（CLL）最重要的独立预后因素之一，为探讨CLL患者IgVH基因突变状态，应用多重PCR技术检测9例CLL患者的IgVH基因，纯化PCR扩增产物后直接测序，应用IMGT／V-QUEST工具分析，明确有无IgVH突变及突变位置。结果表明：9例CLL患者皆扩增出395-465bp区域（MIXⅠ）或290-360bp区域（MIXⅡ）单克隆条带，测序结果显示5例患者有突变，IgVH基因分别为IGHV3-11＊03、IGHV3-9＊01、IGHV3-23＊01、IGHV4-59＊01和IGHV4-34＊02；4例无突变．IgVH基因为IGHV3-53＊01、IGHV3-23＊03、IGHV3-33＊05和IGHV3-7＊01。结论：PCR检测IgVH基因突变，简化了繁琐的实验过程，缩短了实验时间，解决传统PCR对IgVH基因突变检测的桎梏，值得在临床和科研中推广使用。     

实时定量逆转录PCR检测慢性淋巴细胞白血病中脂蛋白酯酶mRNA的表达及临床意义

目的 研究慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者脂蛋白酯酶(LPL)表达情况,探讨LPL在CLL预后中的意义.方法 采用基于Taqman探针技术的实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)方法检测62例CLL患者及10名健康对照者外周血标本中LPL的表达水平.对LPL表达水平与免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因突变、ZAP-70蛋白和CD38表达等预后因素进行相关性分析.采用ROC曲线确定LPL表达的最佳分界值,计算其对IgVH突变情况的阳性及阴性预测值.结果 qRT-PCR标准曲线的R2均≥0.990,敏感度可以检测到102拷贝/μg RNA,批内差及批间差变异系数(CV)均小于5%.62例CLL患者LPL表达水平中位数为0.006 0(0～0.737 0).在10名健康对照者中LPL均不表达或低表达,LPL中位表达水平为0(0～0.000 4).在经CD19磁珠分选后的3份CLL患者标本中,LPL相对表达量分别为0.036 0、0.075 0和0.197 0,与分选前表达水平(分别为0.024 0、0.074 0和0.225 0)相似.LPL表达水平与IgVH基因突变情况相关(r=0.45,P<0.05),无突变患者的LPL中位表达水平为0.006 0(0.000 7～0.110 0),明显高于突变患者的LPL中位表达水平[0.002 0(0.000 2～0.027 0)],差异有统计学意义(U=96.5,P<0.05);LPL表达水平与ZAP-70(r=0.38,P<0.05)及CD38(r=0.43,P<0.05)均显著相关.按照IgVH突变情况作为标准对LPL表达水平做ROC曲线分析,确定最佳分界值为0.036 0,敏感度为66.7%,特异度为72.4%,对IgVH突变情况阳性预测值(无突变)为51.8%,阴性预测值(有突变)为83.3%.结论 qRT-PCR方法检测LPL表达敏感可靠.LPL表达水平与CLL重要预后因素IgVH基因突变、ZAP-70、CD38密切相关,并可较准确地预测IgVH突变情况,在CLL的预后中具有重要价值.     

端粒长度在慢性淋巴细胞白血病中预后意义的初步研究

本研究测定慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者端粒相对长度,分析其与年龄、性别、临床分期、ZAP-70蛋白、CD38表达以及免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因突变等临床因素的关系,以初步探讨端粒长度在CLL预后中的意义。选35例外周血或骨髓CLL细胞占80%及以上的CLL患者为研究对象,另选13例正常人作为对照。运用实时荧光定量PCR(qPCR)的方法测定患者及对照者的端粒相对长度,流式细胞术检测患者ZAP-70蛋白及CD38的表达,多重PCR技术测定IgVH基因突变。结果表明:35例患者总平均端粒相对长度为0.384,正常对照为0.443,但两者相比无统计学意义(p0.05)。端粒的长短与CLL分期及IgVH突变状态相关,BinetB、C期患者平均端粒相对长度较BinetA期患者短(p=0.001);IgVH无突变患者较有突变患者平均端粒相对长度短(p=0.015);未发现端粒的长度与患者性别、年龄、ZAP-70蛋白及CD38表达关联(p0.05)。结论:端粒长度可用于CLL的预后判断,结合端粒长度及IgVH突变状态等可以更好地对CLL预后进行分层。     

典型与不典型免疫表型慢性淋巴细胞白血病的预后相关因素分析

目的 探讨典型免疫表型慢性淋巴细胞白血病(CLL)与不典型CLL在临床特征、Binet分期、淋巴细胞绝对计数(ALC)、ZAP-70蛋白表达、CD38表达、IgVH突变和遗传学特性等预后因素上的差异.方法 参照英国CLL临床指南诊断评分系统,77例患者中积分5分的有61例,为典型CLL,积分为4分或3分的有16例,为不典型CLL.采用多参数流式细胞术(FCM)对77例CLL患者的外周血或骨髓标本进行免疫表型检测,包括CD5、CD19、CD23、FMC7、slg(κ和λ)、CD20、CD79b,并检测预后相关因素ZAP-70和CD38的表达水平;采用多重RT-PCR检测IgVH基因突变状态;组合探针荧光原位杂交(FISH)技术检测分子遗传学异常.结果 典型CLL与不典型CLL两组患者在性别、年龄、IgVH基因突变率、ZAP70表达上的差异均无统计学意义(P值分别为0.398、0.189、0.268和0.131);不典型CLL组中ALC≥50×109/L、Binet B+C期和CD38 阳性率≥30%所占比例(分别为43.8%、87.5%、43.8%)明显高于典型CLL组(分别为16.4%、36.1%、16.4%)(P=0.026、P<0.01和P=0.026);典型与不典型CLL组的分子遗传学结果也有显著差异,典型CLL组中单独伴有del(13q14)异常的比例(26.8%)大于不典型组(7.6%),而del(17p13)或del(11q22)异常的比例(12.2%)小于不典型组(46.2%)(P=0.022).结论 典型免疫表型CLL与不典型CLL在Binet分期、ALC、CD38表达和遗传学特性上有显著差异.     

慢性淋巴细胞白血病患者脂蛋白酯酶和血清胸苷激酶水平及其与其他预后因素的相关性研究

目的 探讨慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者脂蛋白酯酶(LPL)和血清胸苷激酶(TK)水平及其与其他CLL预后因素的相关性.方法 采用RT-PCR方法 检测58例CLL患者外周血标本中LPL的表达水平;增强化学发光法(ECL)和TK1单克隆抗体检测39例CLL患者外周血血清标本中TK1浓度;多重PCR及序列测定检测IgVH基因突变;流式细胞术检测ZAP-70蛋白及CD38的表达;组合探针荧光原位杂交(FISH)技术检测分子遗传学异常.结果 CLL患者LPL中位表达水平为0.26(0～6.29),而在正常对照中均未检测到LPL表达.LPL表达水平与IgVH基因突变、Binet分期、CD38表达和遗传学异常具有显著相关性,无IgVH突变患者的LPL表达水平明显高于突变患者(P=0.010);Binet A期患者LPL表达水平低于Binet B期和C期患者(P=0.011);CD38高表达组(≥30%)LPL表达水平高于CD38低表达组(<30%)(P=0.001);分子遗传学预后较好组[仅有del(13q14)]LPL表达水平明显低于预后较差组[del(17p13)或del(11q22)](P=0.002).LPL表达水平与患者性别、年龄及ZAP-70蛋白表达水平均无明显相关性(P>0.05).CLL患者血清TK1浓度明显高于正常对照(P<0.05).在外周血淋巴细胞绝对计数(ALC)明显增高组(≥50×109/L)、血清乳酸脱氢酶(LDH)高水平组、无IgVH基因突变组和ZAP-70蛋白高表达组(≥20%)的患者中,血清TK1浓度分别明显高于ALC无明显增高组(<50×109/L)(P=0.018)、血清LDH水平正常组(P=0.018)、具有IgVH基因突变组(P=0.030)和ZAP-70蛋白低表达组(<20%)(P=0.038)的患者.血清TK1浓度与CLL患者性别、年龄、Binet分期、CD38表达水平和遗传学异常无明显相关性(P>0.05).结论 CLL患者LPL和血清TK1表达水平与CLL其他预后因素相关,两者均对IgVH突变情况有一定预示作用,在CLL的预后中具有重要价值.     

40例慢性淋巴细胞白血病临床分析

本研究旨在分析慢性淋巴细胞白血病(CLL)的临床和实验室特点及其对预后的影响。对2004年1月至2010年12月收住本院的40例CLL患者进行了回顾性分析。结果表明,本病主要发生于老年男性,中位年龄66岁(42-80岁);25例(62.5%)可见典型CLL免疫表型,所有病例均表达CD19和CD5,表达CD38和Zap70的分别有7例(17.5%)和14例(35%);8例检测出IgVH基因突变,其中有4例为VH3家族;FISH检测出P53基因缺失6例,RB1缺失3例,12三体1例,正常核型5例;31例患者接受了含氟达拉滨的化疗,中位无进展生存(PFS)时间为48个月(95%CI:39-57个月),其中有27例(87.1%)获完全缓解(CR)+部分缓解(PR),而接受其他治疗方法的患者有9例,PFS仅为14个月(95%CI:10-18个月,P<0.001),只有3例(33.3%)获CR+PR。诊断时β2微球蛋白水平正常者,36个月的总生存率为78%(95%CI:69%-87%),明显高于β2微球蛋白水平异常者的总生存率47%(95%CI:35%-59%,P=0.004)。Zap70表达阳性的患者中有7例(50%)治疗后获CR+PR,疗效差于表达阴性者,后者中有23例(88.5%,P=0.006)治疗后获CR+PR。IgVH基因突变者,治疗后都获CR,无IgVH基因突变者,治疗后只有4例(66.7%)获CR。结论:CLL具有独特的临床特征和分子遗传学标记,如Zap70、CD38和IgVH基因突变,并与预后相关。氟达拉滨治疗方案能明显提高CLL患者的长期生存率。     

40例慢性淋巴细胞白血病临床分析

本研究旨在分析慢性淋巴细胞白血病(CLL)的临床和实验室特点及其对预后的影响.对2004年1月至2010年12月收住本院的40例CLL患者进行了回顾性分析.结果表明,本病主要发生于老年男性,中位年龄66岁(42 -80岁);25例(62.5％)可见典型CLL免疫表型,所有病例均表达CDI9和CD5,表达CD38和Zap70的分别有7例(17.5％)和14例(35％);8例检测出IgVH基因突变,其中有4例为VH3家族;FISH检测出P53基因缺失6例,RB1缺失3例,12三体1例,正常核型5例;31例患者接受了含氟达拉滨的化疗,中位无进展生存(PFS)时间为48个月(95％ CI:39 -57个月),其中有27例(87.1％)获完全缓解(CR)+部分缓解(PR),而接受其他治疗方法的患者有9例,PFS仅为14个月(95％ CI:10 -18个月,P＜0.001),只有3例(33.3％)获CR+PR.诊断时β2微球蛋白水平正常者,36个月的总生存率为78％(95％ CI:69％ -87％),明显高于β2微球蛋白水平异常者的总生存率47％(95％ CI:35％ -59％,P=0.004).Zap70表达阳性的患者中有7例(50％)治疗后获CR+ PR,疗效差于表达阴性者,后者中有23例(88.5％,P =0.006)治疗后获CR+ PR.IgVH基因突变者,治疗后都获CR,无IgVH基因突变者,治疗后只有4例(66.7％)获CR.结论:CLL具有独特的临床特征和分子遗传学标记,如Zap70、CD38和IgVH基因突变,并与预后相关.氟达拉滨治疗方案能明显提高CLL患者的长期生存率.     

家族性骨髓增殖性肿瘤JAK2基因突变的检测及其临床意义

目的 了解家族性骨髓增殖性肿瘤( MPN)患者及其家系成员中JAK2、c-mpl、EPOR、MPLW515 L/K、TET2基因是否存在异常,为深入探讨MPN发病机制提供依据.方法 对2例先后在我院诊治的同胞MPN患者及其家系成员(共15人)进行血常规检查,对存在异常者进行骨髓相关检查,并应用PCR、DNA测序等方法明确有关基因的表达状况.结果 2例患者中先证者为原发性血小板增多症,其胞弟为真性红细胞增多症,其余成员均无相关临床表现.根据血常规及骨髓检查确诊了第3例(胞妹)MPN患者.PCR及测序结果显示3人存在JAK2V617F突变,其中先证者为纯合型,其胞弟和父亲为杂合型.所检查的家系成员均不存在bcr-abl融合基因及c-mpl、EPOR、MPLW515L/K和TET2基因突变.对该家族JAK2基因cDNA全长测序发现:2人存在G380A杂合型突变(127位甘氨酸变为天冬氨酸),13人存在C489T突变,14人存在G2490A突变,但后两者均为同义突变.结论 JAK2V617F是诊断MPN的重要指标之一,该家族中JAK2V617F突变涉及两代人.对于初发MPN患者,建议筛查其家族成员,从而尽可能对部分家族性MPN患者做到早期诊断.JAK2基因全长测序发现存在除JAK2V617F外的基因突变.     

儿童急性B淋巴细胞白血病免疫球蛋白重链可变区基因的分子特征

目的 探讨儿童急性B淋巴细胞白血病(B—ALL)的起源及其免疫球蛋白重链可变区(IgHV)上可被细胞毒性T淋巴细胞(cTL)识别的表位(epitope)。方法 PCR扩增108例儿童ALL的7个IgHV基因家族；PCR产物直接测序并翻译成氨基酸序列；利用生物信息资源分析B—ALL IgHV基因重排类型、胚系基因片段利用及体细胞突变情况，并预测CTL细胞识别的表位。结果 66％的ALL患儿检测到IgHV基因重排，其中单等位基因重排37例(52．1％)，双等位基因重排26例(36.6％)，寡克隆基因重排8例(11．3％)。40份B-ALL IgHV基因序列中，不含终止密码子的读码框内(in frame)重排8份(20．0％)。重排利用最多的VH家族为VH3、VH4和VH1，占75%；VH4—59和VH4—34是VH4家族中利用频率最高的片段。优先利用的D家族为D3(35．9％)和D2(28.2％),D7—27的利用率(15．4％)明显高于正常外周血淋巴细胞(P=0．02)。JH6是B-ALL利用最多的JH基因片段(47．5％)，JH4(27．5％)次之。20％的B—ALL在DJH连接区缺乏N核苷酸的插入，高于正常外周血淋巴细胞(P=0．02)。17．5％B—ALL IgHV基因发生替代突变，突变碱基散布于IgHV全长，互补决定区替代突变与静寂突变的比例≤1。26例B—ALL IgHV的HIA—I类分子结合肽80％以上位于框架区，同一IgHV家族的B-ALL有相同的1～2条九肽。结论 B—ALL起源于前B祖细胞或前B细胞，恶性转化往往发生于胚胎期，它们的IgHV基因具有胚系特征；生物信息分析B-ALL IgHV的T细胞表位主要位于框架1区和框架3区。     

Lack of extensive mutations in the VH5 genes used in common B cell chronic lymphocytic leukemia

B cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a malignancy of the CD5+ B cells. Prior studies indicated that CLL B cells generally express immunoglobulin (Ig) VH and VL genes with little or no somatic mutations. However, a recent report indicated that VH251, one of three VH genes belonging to the VH5 subgroup (e.g., VH251, VH32, and VH15), not only is frequently rearranged in this disease, but also has extensive and selective mutations when expressed by CLL B cells. The extent and nature of these mutations contrasts markedly from the low level of mutations noted in VH5 genes used by normal B cells or other Ig V genes found expressed in CLL. To determine whether this difference reflects a unique property of VH251 or a previously unrecognized subgroup of CLL, we examined for VH5 Ig gene rearrangements in leukemia cells from 68 patients that satisfied clinical and diagnostic criteria for CD5+ B cell CLL. Southern blot hybridization studies with probes for VH251 and the JH locus revealed that only 7 (10%) of the 68 monoclonal CLL cell populations had undergone Ig gene rearrangement involving VH5 genes. Two (3%) were found to have functionally rearranged VH5 genes that shared > or = 98% sequence homology with 5- 2R1, a VH251 gene isolated from a pre-B cell acute lymphocytic leukemia. The other five CLL (7%) had functionally rearranged VH5 genes that each shared > or = 99% nucleic acid sequence homology with a germline VH32 isolated from human sperm DNA. These data indicate that VH251 or VH32 also may be expressed by CD5+ CLL B cells with little or no somatic mutation. These findings contrast with a recently published study on VH5 gene expression in B CLL and contest the hypothesis that extensive somatic mutation is a common property of the VH5 genes used in this disease. Further work to define the clinical and/or phenotypic characteristics of patients with leukemia cells that express mutated versus nonmutated Ig V genes may reveal subsets of CLL that possibly differ in their cytogenesis, etiopathogenesis, and/or clinical behavior.     

实时定量逆转录PCR检测慢性淋巴细胞白血病MDM4基因mRNA的表达及其临床意义

本研究旨在探讨慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者鼠双微体4(MDM4)基因mRNA的表达情况及其在CLL预后中的意义.采用SYBRGreenⅠ荧光染料行实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)方法检测66例CLL患者白血病细胞MDM4 mRNA的表达,以β-actin为内参照物,以2(-△Ct)方法计算MDM4的相对定量值...     

磷酸二酯酶7B在慢性淋巴细胞白血病患者中的表达及预后意义

目的 为了研究磷酸二酯酶(PDE)7B在慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者中的表达及临床意义.方法 应用实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)技术检测87例未治疗CLL患者和20例正常人中PDE7B的表达水平,并分析其与CLL临床预后指标的关系.结果 87例CLL患者PDE7B表达水平中位数为5.4×10-4(0.2×1...