5-氮杂胞嘧啶诱导人骨髓基质干细胞心肌分化

目的：研究5-氮杂胞嘧啶(5-aza)诱导人骨髓基质干细胞(hMSC)心肌分化过程中心肌特异转录因子和心肌特异基因的表达变化。方法：取传至第8代hMSC,以3μmol/L的5-aza孵育细胞24h，分别在诱导后3d、1周、2周和3周4个时间点提取细胞RNA。以RT-PCR方法检测4细胞心肌特异转录因子Nkx2.5和心肌特异基因(connexin43、ANP等)的表达。结果：hMSC经5-aza诱导后，形成肌节样结构。RT-PCR的结果显示，5-aza可诱导心肌特异基因connexin43和ANP的表达，随诱导时间延长，connexin43和ANP的表达量逐渐增加。5-aza还能诱导hMSC表达心肌特异转录因子Nkx2.5，并持续表达至3周。结论：5-aza在体外可诱导hMSC向心肌细胞分化，5-aza可能通过诱导心肌特异转录因子的表达而启动hMSC心肌化的过程。     

心肌条件培养液对体外骨髓间充质干细胞向心肌细胞诱导分化的影响

目的:观察心肌培养液中可溶性细胞因子对体外骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞诱导分化过程的影响;方法:10 μmol/L 5氮胞苷(5-aza)诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化后,实验分为两组:5-aza诱导组常规培养基培养,5-aza诱导 心肌条件培养组以1∶1混合的心肌条件培养液培养,观察与比较两组细胞形态,免疫细胞化学法和western blot技术分析心肌特异蛋白表达.结果:5-aza组细胞排列紊乱,5-aza诱导 心肌条件培养组细胞呈集落样排列,可见肌管形成,自诱导2周开始两组均见肌钙蛋白I(troponin I)阳性细胞,而troponin I、结蛋白(desmin)、连接蛋白-43(connexin-43)在诱导2周开始表达,3、4周达高峰,各时间点两组蛋白表达没有明显差异;结论:心肌条件培养液对心肌细胞的体外分化过程没有促进作用,但是可以加强体外诱导生成的心肌样细胞之间的有机排列.     

体外培养脂肪干细胞向心肌细胞诱导的实验研究

目的：研究诱导体外培养脂肪干细胞（ADSCs）向心肌细胞分化的方法。方法：培养原代脂肪干细胞经CD34、CD44、CD105抗体标记鉴定后,进行5-aza诱导培养。通过鉴定心肌细胞特异性抗原横纹肌肌动蛋白及心肌特异性肌钙蛋白T检测细胞分化情况。结果：ADSCs高表达间充质干细胞特异抗原CD44、CD105,不表达CD34;表达HLA-I抗原,不表达HLA-抗原。经5-aza诱导后,细胞形态变为类似于心肌样细胞。免疫细胞化学检测横纹肌肌动蛋白及心肌特异性肌钙蛋白T呈阳性,流式细胞仪显示心肌细胞特异性抗原阳性细胞为94%。结论：脂肪干细胞具有向心肌细胞分化的可能,在组织工程学及干细胞移植领域有着良好的应用前景。     

低压脉动电刺激大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化:希望验证电学因素在心肌发育过程中作用

背景:电学微环境是心肌细胞所处微环境的要素之一.在体外干细胞向心肌细胞诱导分化的过程中,模拟心肌微电学环境的脉动性电流刺激是否有助于心肌分化呢?目的:大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞诱导分化过程中,验证课题提出的低压脉动电刺激对心肌分化过程影响的假设,并分析其分子生物学机制.设计、时间及地点:细胞-基因学实验,于2005-09/2007-03在四川大学老年病研究室完成.材料:4周龄SD大鼠5只,购自四川大学华西医学中心动物实验室中心.方法:密度梯度离心+贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代细胞,设立2组,5-氮胞苷诱导组单纯给予10 μmol/L 5-氮胞苷诱导;5-氮胞苷诱导+电刺激组在5-氮胞苷诱导基础上,对骨髓间充质干细胞施加电场刺激,刺激参数选择1.5V/cm电压,2ms方波,频率1 Hz,刺激时间为2 h/d.主要观察指标:分别于诱导第1,2,3,4周收集细胞,western blot技术检测Troponin I,Desmin,Connexin-43蛋白的表达,RT-PCR法分析GATA-4,NKx2.5,MEF2C基因的表达.结果:诱导后细胞停止生长,并倾向集落化.两组均在诱导第2周开始表达Troponin I,Desmin,Connexin-43蛋白,第3,4周表达明显增强.两组均在诱导第1周开始表达GATA-4,NKx2.5,MEF2C基因,并逐渐增强,至第3周达高峰,持续到第4周.在同一时间点,5-氮胞苷诱导+电刺激组蛋白、基因的表达量均显著高于5-氮胞苷诱导组(P<0.01).结论:GATA-4,NKx2.5和MEF2C基因调控心肌细胞的形成,而低压脉动电场刺激通过上调其表达进而促进大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化过程.课题结果验证了电学因素在心肌发育过程中具有重要意义的理论假设.     

骨髓间充质干细胞的生物学特性及其向心肌样细胞的分化

【目的】体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),分析其生物学特性;5-氮胞苷(5-Azacytidine,5-aza)定向诱导其向心肌细胞分化。【方法】采用体外密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓单个核细胞,流式细胞仪检测细胞表面标志;用含有5-aza(10μmol/L)的培养液培养第二代MSCs24h,诱导其向心肌细胞分化;诱导4周后采用免疫荧光技术检测心肌细胞特异性标志物Connexin 43和TroponinⅠ的表达。【结果】体外分离培养的细胞形态主要为纺锤形和长梭形,细胞表面抗原CD29、CD44表达为阳性,CD34、CD45表达为阴性;经5-aza诱导后细胞表达心肌细胞特异蛋白Connexin 43和TroponinⅠ。【结论】MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞,体外经5-aza诱导可以定向分化为心肌样细胞。MSCs为心血管疾病的治疗提供了种子细胞。     

骨髓干细胞向心肌细胞分化的基因芯片分析

目的:观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)在特殊微环境下向心肌细胞分化的过程中基因表达的差异变化.方法:用密度梯度离心法培养BMSCs,原代培养乳鼠心室肌细胞,与BMSCs一起用半透膜共培养.共培养后2周提取细胞总RNA,进行22K Human Genome Array芯片检测.用RT-PCR检测心肌分化相关的基因的时序表达.结果:基因芯片检测BMSCs诱导前后差异基因的表达水平,发现诱导2周后表达明显升高(ratio>5)的基因有572个,表达下调(ratio<0.2)的基因有336个.基因的时序性表达发现HOP,Nkx2.5和GATA4基因在诱导前几乎没有检测到阳性表达,诱导后0.5周表达增强,1～2周表达达到高峰,维持一定水平后到4～8周表达呈下降趋势.心肌特异性基因β-MHC和ANF在0.5周开始出现,表达随时间逐渐增加,2周达到高峰.结论:分化诱导相关基因如IGF、FGF等的表达与心肌发育分化相关,GATA4和Nkx2.5等转录因子在微环境诱导心肌分化过程中起重要作用.然而心肌的分化实际上极为复杂,转录因子间相互作用的机制尚需进一步探讨.     

过表达NKx2.5基因间充质干细胞增强SDF-1/CXCR4轴促归巢改善心梗心功能

目的 探讨过表达NKx2.5基因骨髓间充质干细胞(BMSC)通过增强SDF-1/CXCR4轴促BMSC归巢改善心梗后心功能。方法 采用慢病毒使骨髓间充质干细胞内过表达NKx2.5(BMSC^NKx2.5)，将空载体组及BMSC组作为对照组。采用RT-PCR检测各组细胞SDF-1、CXCR4及NKx2.5的表达及同时采用western-blot检测NKx2.5及SDF-1、CXCR4蛋白的表达。将BMSC^NKx2.5、BMSC、及BMSC空载体经尾静脉注射入小鼠心梗模型，同时设立BMSC^NKx2.5+AMD3100组，将心梗未处理组、假手术组、正常小鼠组作为对照组。采用心脏彩超检测心梗小鼠心功能的变化及采用western blot检测NKx2.5及SDF-1、CXCR4蛋白的表达。结果 体外BMSC^NKx2.5组SDF-1及CXCR4及转录因子NKx2.5的表达最高(P <0.05)。体内实验证实BMSC^NKx2.5组心梗心功能改善最为明显(P <0.05)，但当加入S...     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

目的:目前在5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化领域中,对用于诱导的细胞代次选择不一。实验选择第2,9代骨髓间充质干细胞,观察比较经5-氮胞苷体外诱导后其各自向心肌细胞分化过程中心肌特异性肌钙蛋白cTnT和早期分化基因的表达。方法:实验于2005-07/2007-07在天津中医药大学病理三级实验室完成。①实验方法:清洁级Wistar雄性大鼠,脱颈处死后取双侧股骨、胫骨,采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞进行原代培养。去掉原代细胞瓶内的培养液,D-Hank’s液冲洗去除血清,胰蛋白酶 乙二胺四乙酸消化,制备单细胞悬液,按1∶3传代。用10μmol/L的5-氮胞苷分别诱导第2,9代骨髓间充质干细胞,诱导4周,并设立未加诱导剂的阴性对照。②实验评估:倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化;免疫组织细胞化学法检测心肌特异性肌钙蛋白cTnT的表达,胞浆出现棕黄色颗粒状物质为阳性;嵌合荧光法检测心肌早期基因NKx2.5、GATA-4、Desmin、α-actin的相对表达量。结果:①细胞形态学观察:5-氮胞苷诱导前细胞生长较快,诱导后死亡细胞较多且生长较慢。诱导后2,3,4周,第9代骨髓间充质干细胞无论在形态和细胞活力方面均优于第2代。②心肌特异性肌钙蛋白cTnT的表达:5-氮胞苷诱导4周后,第9代骨髓间充质干细胞心肌特异性肌钙蛋白cTnT阳性表达率明显高于第2代(22.42±9.97),(11.22±5.62)%,P<0.05,阴性对照无阳性表达。③心肌早期基因的表达:反转录-聚合酶链反应结果显示,5-氮胞苷诱导4周后,第9代骨髓间充质干细胞心肌早期基因NKx2.5、GATA-4、Desmin、α-actin的相对表达量均明显高于第2代(P<0.05)。结论:经5-氮胞苷诱导后,骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白cTnT及4种心肌早期基因,证实其能够向心肌细胞分化,且传至第9代时向心肌细胞分化的能力要强于第2代。     

HGF联合5-aza诱导间充质干细胞心肌样分化实验探讨

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)联合5-氮胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)向心肌样细胞分化的机制。方法 1采用全骨髓贴壁法培养BMMSCs,用流式细胞仪对阳性表面标记抗原CD44、CD29和阴性标记抗原CD34进行检测。2取第4代BMMSCs进行分组诱导,空白对照组(普通培养基)、5-aza组(10μmol/L)、HGF组(10 ng/ml)、5-aza+HGF组(10μmol/l+10 ng/ml)。各组BMMSCs诱导4周后,实时荧光定量PCR法检测各组α-actin、GATA-4相对表达量,免疫组化法鉴定肌钙蛋白T(cTnT)表达。结果 1大鼠BMMSCs体外培养形态特征及鉴定:细胞呈长梭形、同心圆状生长,形态逐渐趋向一致。CD44阳性表达率为(86.14)%,CD29阳性表达率为(98.97)%,CD34阳性表达率为(6.86%);2BMMSCs诱导4周后空白对照组细胞死亡,免疫组化显示3组均表达心肌特异性结构蛋白cTnT;实时荧光定量PCR显示3组均表达心肌分化早期基因,其中5-aza+HGF组明显高于其他两组。结论 1骨髓间充质干细胞经5-aza、HGF诱导后可以分化为心肌样细胞。2在骨髓间充质干细胞诱导为心肌样细胞的过程中,5-aza+HGF组优于5-aza及HGF组。     

脐血问充质干细胞体外定向诱导向心肌样细胞的转化

目的：观察脐血间充质干细胞经5一氮杂胞苷诱导在体外定向分化为心肌样细胞的形态学及分子生物学特征。方法：选取2003-05／2005-04在郧阳医学院附属十堰市太和医院妇产科患者12例，脐血来源者家属及本人知情同意。取脐静脉血50mL，分离并培养骨髓间充质干细胞，用5-氮杂胞苷定向诱导向心肌样细胞分化。每日采用相差显微镜、透射电镜观察心肌样细胞形态学变化及超微结构特征，采用RT-PCR检测心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结果：①形态学变化：5-氮杂胞苷诱导后，约1周出现短棒状或珠状结构。2周排列具有方向性，3周有肌管样结构形成。②超微结构：诱导四五周细胞内含大量线粒体，可见心房颗粒、肌丝形成。③RT-PCR检测：经5-氮杂胞苷诱导四五周骨髓间充质干细胞有心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。且心房利钠肽出现3条阳性带。结论：经5-氮杂胞苷诱导脐血间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞，是细胞移植的优良供体。