环介导等温扩增结合核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术快速检测脑膜炎奈瑟菌

目的建立一种适合现场使用、灵敏、特异的脑膜炎奈瑟菌(N.men)检测方法。方法针对N.men的ctrA基因设计环介导等温扩增(LAMP)特异性引物和核酸侵入反应探针,对LAMP扩增产物进行核酸级联侵入反应和纳米金颗粒探针杂交检测。优化反应体系和反应条件后进行敏感性和特异性实验,并与Real-Time PCR检测方法进行比较。结果以核酸级联侵入反应和纳米金颗粒探针显色技术检测LAMP扩增产物和毛细管电泳法具有相同的敏感性和特异性;LAMP结合核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术的检测敏感性为10copies DNA分子/反应,且与其他病原体之间无交叉反应。在临床样本检测方面,LAMP结合核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术与Real-Time PCR检测效果相当。结论结合LAMP、核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术建立的N.men检测方法灵敏、特异,无需特殊仪器,适用于基层检测和现场快速检测。     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测沙门菌属方法的建立

建立一种检测沙门菌属快速敏感的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测方法。针对沙门菌属侵袭蛋白（invA）基因序列的六个区域设计四条LAMP引物，65℃保温约60min，完成对沙门菌属的扩增，扩增产物经电泳和酶切鉴定。利用LAMP和普通PCR方法同时检测4株沙门菌和9株非沙门菌（对照组）来验证LAMP方法的特异性；将肠炎沙门菌菌液做一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法进行检测来比较两者敏感性。4株沙门菌扩增出LAMP特征性梯状条带，9株非沙门菌没有出现LAMP扩增，LAMP产物的特异性通过限制性内切酶得到了证实；LAMP检测沙门菌属的特异性与普通PCR相同，但其敏感性比普通PCR高10倍，LAMP检测沙门菌属的检测下限为10cfu／ml，PCR检测下限为100cfu／ml。LAMP检测速度相比PCR更快速，在60min内即可完成扩增反应。建立了一个快速、特异、敏感的沙门菌属LAMP检测方法。     

沙门菌属stn基因LAMP快速检测方法的建立及应用

目的本研究以沙门菌属肠毒素基因(stn)为靶基因,运用环介导恒温扩增技术(LAMP),建立LAMP快速检测方法。方法对沙门菌属stn基因的6个特征区域设计4条引物,利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成,使目的基因高效扩增;对LAMP反应体系和反应条件进行优化,用沙门菌标准株和非沙门菌标准株检测方法的特异性和敏感性。与显色培养基法同时检测肉、蛋、奶、等样品共计100份,检测方法的实用性。结果以沙门菌属stn基因为靶基因建立的LAMP快速检测方法,沙门菌株阳性检出率100%,非沙门菌株检测均为阴性。100份检验样品检测结果与显色培养基检测结果对比,一致率100%。结论沙门菌属stn基因LAMP检测技术敏感性、特异性高,简便快速,是一种适合口岸及基层检验、检疫部门使用的沙门菌快速检测方法。     

环介导等温扩增(LAMP)技术检测奇异变形杆菌方法的建立

[目的]建立一种检测奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)快速且特异的环介导等温扩增(LAMP)检测方法. [方法]针对奇异变形杆菌脲酶调节子编码基因(ureR)特异性序列的6个位点设计4条LAMP引物,65℃孵育约60min,完成对奇异变形杆菌的扩增,扩增产物经电泳和酶切鉴定.利用LAMP和普通PCR方法同时检测1株奇异变形杆菌和13株非奇异变形杆菌来验证LAMP方法的特异性;将奇异变形杆菌菌液做一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法同时进行检测来比较两者敏感性. [结果]1株奇异变形杆菌扩增出LAMP特征性梯状条带,13株非奇异变形杆菌没有出现LAMP扩增,酶切也证实了LAMP产物的特异性;LAMP检测奇异变形杆菌的特异性与普通PCR相同,但其敏感性比普通PCR高10倍:LAMP检测奇异变形杆菌的检测下限为5 cfu/ml,PCR检测下限为50 cfu/ml.LAMP检测速度相比PCR更快速,在60 min内即可完成扩增反应.[结论]建立了一种特异、敏感、快速且不需要特殊设备的奇异变形杆菌LAMP检测方法,有望用于奇异变形杆菌的快速检测.     

两种基因分析法在口岸沙门菌检测中的应用评价

目的评估以沙门菌属肠毒素基因(Salmonella enterotoxin gene stn)为靶基因建立的环介导恒温扩增(loopmediated isothermal amplification,LAMP)沙门菌快速检测方法在口岸卫生检验中的作用。方法收集河南出入境检验检疫局检测的肉、蛋、奶、水产品、饮料等样本共计165份,采用沙门菌属stn基因LAMP技术、实时荧光PCR与沙门菌显色培养基培养法同时检测,比较沙门菌属stn基因LAMP技术与实时荧光PCR的符合率和一致性,并以显色培养基培养结果为标准评价这两种基因分析方法的敏感性和特异性。结果 165份检验样本检测结果,LAMP检测方法与实时荧光PCR检测结果对比,一致率97.6%,阳性检出率比较差异无统计学意义(χ2=0.10,P0.05);与显色培养基检测结果对比,一致性强(kappa=0.964),优于实时荧光PCR(kappa=0.952)。结论沙门菌属stn基因LAMP技术较实时荧光PCR敏感性强、特异性高,简便快速,对仪器设备要求不高,是一种适合口岸检验检疫部门使用的沙门菌快速检测方法。     

环介导等温扩增技术检测调味粉中罂粟可待因

目的基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP),建立调味粉中罂粟可待因的检测方法。方法根据可待因特异性基因序列设计引物,通过对12种罂粟种子、11种香辛料叶或种子、1种虞美人种子的DNA样品进行特异性实验、最佳温度筛选实验、敏感性实验,并以此确立LAMP反应体系,对市售8种调味粉进行检测。结果 12种罂粟和虞美人的DNA样品发生了特异性反应,最佳反应温度为66℃,LAMP检测最低浓度达9 pg/μL,敏感性是PCR检测(0.9 ng/μL)的100倍。市售8种调味粉中,有1种含有可待因成分。结论LAMP检测法灵敏度高、特异性强、操作方便、快速,适用于调味粉中罂粟可待因的检测。     

环介导等温扩增技术检测马尔尼菲青霉菌的研究

目的应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立马尔尼菲青霉菌(PM)快速检测方法,探讨该方法的特异性、敏感性等,评价其临床应用价值。方法针对马尔尼菲青霉菌的特异性基因MP1基因设计4条特异引物,反应前加入钙黄绿素荧光试剂,63℃恒温反应60min,结束后通过目视检测荧光及浊度仪检测产物浊度值判断结果;评价所建立LAMP方法的特异性和敏感性,建立标准曲线,并用LAMP法及PCR法检测样本,比较样本检出情况。结果该方法特异性良好,PM出现特异性LAMP扩增反应,而烟曲霉菌、腐皮镰刀菌、棘状外瓶酶菌、大肠埃希菌、嗜水气单胞菌、哈氏孤菌、创伤孤菌、水等均未出现扩增;检测限约为1.7×10-7 ng/μl,为PCR检测方法的10倍;以LAMP反应时间X轴,浓度的负次方数为Y轴,构建的标准曲线方程为y=0.4145x-8.9968,相关系数R2=0.9963,呈良好的线性关系;样本检测结果显示,LAMP法较PCR法获得更高的敏感性。结论 LAMP检测方法具有特异性高、敏感性高、反应时间短的特点,简便易行,适合于基层对PM的快速检测。     

DNA环介导恒温扩增技术在乙型肝炎病毒表面抗原基因检测中的应用

目的建立一种适合基层医疗机构开展的快速检测乙肝病毒的环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术。方法根据美国国立卫生研究院(NIH)基因序列数据库(genbank)公布的乙型肝炎病毒表面抗原基因序列(登录号:V00867),针对病毒表面抗原pre-S基因设计两对特异性的LAMP内外引物,提取DNA作为扩增模板,优化LAMP反应体系,恒温65℃反应1h,反应结果采用目测或琼脂糖凝胶电泳法判断;同时设计一对特异性的引物采用聚合酶链式反应(PCR)对35例乙肝感染者血清进行扩增,比较两种方法在检测中的特异性和敏感性。结果35例乙肝病毒患者血清LAMP反应检测阳性20例,普通PCR法检测阳性20例;对同一病毒模板做系列倍比稀释,LAMP能检测出的极限为10-8,而普通PCR的检测极限为10-6。结论LAMP能快速、敏感、特异地检测乙肝病毒表面抗原基因,实验仪器简单,不需要特殊的检测设备,适合基层各种检测机构的使用。     

环介导等温扩增快速检测临床假丝酵母菌属方法建立与应用

目的建立一种环介导等温扩增(LAMP)反应,根据假丝酵母菌属D1~D2 26SrDNA保守区域设计通用引物,直接对临床标本进行假丝酵母菌属检测。方法根据假丝酵母属的特异D1~D2 26SrDNA基因序列比对后的相对保守区设计特异引物,分别提取5种假丝酵母菌、临床对照菌株以及临床标本DNA,然后以LAMP技术扩增,并对白色假丝酵母菌孢子悬液进行系列梯度稀释检测,确定最低检测限。结果 5种假丝酵母菌直接提取DNA经LAMP和PCR方法检测均为阳性;30份经培养证实假丝酵母菌属感染标本,经LAMP检测有27份标本阳性,阳性检出率为90.0%;另10份临床对照标本和11种非假丝酵母菌属来源DNA样本经LAMP方法检测后结果均为阴性,无非特异性反应发生;LAMP最低检测限达到103 CFU/ml。结论结果证明LAMP是一种简便、快速、特异和敏感的检测方法,可以检测临床和环境标本中的常见假丝酵母菌属。     

逆转录聚合酶链反应用于检测恶性疟原虫的初步研究

目的 建立逆转录聚合酶链反应系统,用于检测恶性疟原虫感染。方法 以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计一对特异引物,分别采用RT－PCR技术和PCR技术进行检测恶性疟原虫血样并比较两才检测的敏感性。结果 从培养的恶性疟原血样中扩增出359bp特定扩增带,而间日疟和健康人血样均未见扩增带。经限制性内切酶分析证实扩增产物为目的片段。检测系统初步显示可检出恶性疟血样中0．34个疟原虫所含的RNA模板。以RNA为检测对象的RT－PCR肉眼可见条带的检测水平较以DNA为检测对象的PCR扩增高。结论 RT－PCR检测恶性疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,有一定的应用价值。     

环介导等温扩增技术应用于口岸病原体快速检测的现状及展望

环介导等温扩增技术由于不需要专业仪器,操作简便,价格便宜,被广泛应用于口岸多种病原体的快速检测.此文总结了环介导等温扩增技术在检测结核分枝杆菌、寨卡病毒、登革热病毒、疟原虫及肝炎病毒等方面的最新研究成果,并对其在口岸快速检测方面的应用前景进行综合分析.     

Investigation of LAMP Technique in Diagnosis Type of Plasmodium Species in Anopheles Mosquitoes :A Fast and Practical Technique to Detect Malaria Pathogens in the Field

BackgroundMalaria is one of the main parasitic diseases and a major health issue in some countries. This study aims to determine the rate and type of infections of Anopheles mosquitoes with malaria parasites using the molecular LAMP method in the Southeastern Iran.MethodsIn this study, 400 Anopheles mosquitoes were collected by the Zahedan Medical Insecticide Center in Nikshahr City, a high-risk area of malaria transmission in Sistan-Baluchestan Province. The mosquitoes were caught manually (by hand) in domestic (humans and animals), natural, and artificial outdoor places (Shelter pits). After DNA extraction, the LAMP method was used, which was compared with Multiplex Nested-PCR as a standard method.ResultsOut of 400 samples collected from Nikshahr City, 6 samples (1.5%) were infected with Plasmodium vivax. No Plasmodium falciparum or a mix (Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum) was detected in this study.ConclusionsThe results of this study indicate that in places with transmission of both species, i.e. Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum, detection of malaria parasites by the LAMP method could be very useful in spotting infections in the field. Thus, molecular epidemiological studies could be conducted annually to monitor malaria in endemic regions. The results of this research show that contamination with mosquito malaria vectors is increasing in Nikshahr City, and it seems that more studies will be required to eliminate malaria until 2026.     

鼠疫耶尔森氏菌环介导等温扩增检测方法的建立

目的:将环介导等温扩增技术(LAMP)应用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。方法:针对鼠疫耶尔森氏菌F1基因设计特异性引物,进行LAMP扩增。应用LAMP技术对鼠疫菌和非鼠疫菌进行检测以确定其特异性;对倍比稀释鼠疫菌液进行检测以确定其灵敏度,并与常规PCR方法进行比较。结果:对10种非鼠疫菌进行LAMP扩增,均为阴性结果,证明该方法具有很高的特异性。LAMP方法最低检出量为20个鼠疫菌,比常规PCR方法的灵敏度高10倍。通过加入染料进行LAMP扩增可直接观察结果。结论:本方法检测鼠疫耶尔森氏菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、结果易于判定,有望发展成为快速检测鼠疫耶尔森氏菌的有效手段。     

环介导等温扩增技术检测副溶血性弧菌方法的建立与应用

目的建立适合基层实验室快速检测副溶血性弧菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。方法根据副溶血性弧菌gyrB基因设计4条特异性引物,并对反应条件进行优化。结果建立的LAMP体系具有高度特异性,经对14株细菌进行扩增,副溶血性弧菌为阳性,其他菌株均为阴性。该方法对培养的副溶血性弧菌的检测下限为25cfu/mL,可在60min内完成扩增反应。用该体系对120份海产品进行检测,阳性率62.5%,与传统方法一致。结论 LAMP法与传统方法相比,可节省大量时间,且对实验仪器要求低,具有良好的实用性。     

嗜肺军团菌环介导等温扩增快速检测方法的建立与应用

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测嗜肺军团菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(LAMP),针对嗜肺军团菌mip基因设计5条引物(2条内引物、2条外引物及1条环引物),并对LAMP反应条件和反应体系进行优化.为验证该方法的特异性、敏感性,针对种系背景明确的12株嗜肺军团菌实验对照菌株、45株嗜肺军团菌地方分离株、6株非嗜肺军团菌、11株其他细菌以及59份外环境水样本进行检测,并将其结果与传统培养分离方法及定量PCR方法比较.结果 所检测的菌株样本中不同血清型嗜肺军团菌经LAMP检测均呈绿色为阳性,非嗜肺军团菌及其他菌株检测均呈橙色为阴性.实验结果表明,LAMP方法的检出率高于传统培养分离方法及定量PCR.应用该方法从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右,该体系检测灵敏度为5 cfu/ml,而且其检测结果在日(灯)光下通过肉眼即可判断.结论 实验建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测嗜肺军团菌,适合基层检验部门及小型实验室与现场监测等使用.     

4种结核分枝杆菌检测方法的比较

目的建立更快速、准确的痰结核分枝杆菌检测方法。方法收集83份肺结核病患者的痰标本,分别采用涂片抗酸染色、荧光染色法、罗氏培养和DNA环介导恒温扩增(LAMP)试验对结核分枝杆菌进行检测,并对其阳性检出率进行比较。结果 LAMP试验结核分枝杆菌检出率为72.6%,高于罗氏培养法的57.8%(χ2=11.4,P<0.01),同样高于荧光染色的59.8%(χ2=8.6,P<0.01),显微镜下抗酸染色法的检出率最低,为51.8%,明显低于LAMP法(χ2=22.2,P<0.01);荧光染色法与萋尼染色法比较,差异无统计学意义。结论 LAMP试验检测痰结核分枝杆菌具有快速、敏感、简便、特异等优点,在肺结核患者的早期诊断中将发挥重要作用。     

沙门菌属LAMP检测方法在食品卫生检验中的应用评价

目的探讨沙门菌属环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法在食品卫生检验中的应用价值。方法利用文献报道的LAMP检测方法和分离培养法分别对135份食品标本进行沙门菌检测,评价LAMP法和分离培养法的一致性。结果 LAMP方法检出14份食品标本沙门菌阳性,阳性率为10.4%,电泳和加荧光染料染色后均能判断结果;分离培养法检出6份食品标本沙门菌阳性,阳性率为4.4%。LAMP法检出阳性率高于培养法(P=0.021)。LAMP方法可在24 h内从食品中检测出沙门菌,而分离培养法检出沙门菌需要4~7 d,LAMP检测方法更快速。结论沙门菌属LAMP方法检测阳性率高于分离培养法,LAMP方法可用于食品中沙门菌的核酸检测。     

环介导等温扩增技术在钩端螺旋体病监测中的应用

目的:评价LAMP技术在钩端螺旋体检测与监测中的可行性。方法:采用LAMP技术对感染病人血清及钩体标准菌株感染鼠肾进行检测,同时与卫生行业标准推荐的引物G1/G2 PCR方法进行对比。结果:LAMP快速检测方法 60 min内即可完成检测,具有较高的检测灵敏度,对纯培养的钩体检测灵敏度可达1.5 CFU/ml,比PCR法高出两个数量级,结果肉眼直接可观。同时对21种共42株细菌进行LAMP扩增,仅钩体结果为阳性,显示该LAMP方法具有较强特异性。结论:LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高且成本低廉,在钩体的快速检测和疫情监控中具有良好的应用前景。     

应用LAMP同时快速检测沙门菌和志贺菌的效果评价

目的探讨环介导等温扩增（LAMP）方法同时快速检测沙门菌和志贺菌的应用价值。方法通过通用增菌培养,应用LAMP方法和分离培养法分别对76份食堂从业人员粪便标本进行沙门菌和志贺菌检测。结果LAMP方法检出1份标本沙门菌阳性,阳性率为1．32％;分离培养法检出1份都柏林沙门菌,阳性率为1．32％;2种方法的检测结果一致。LAMP方法可在3h内检出沙门菌、志贺菌,而分离培养法需要3-5d,鼠伤寒沙门菌LAMP方法的灵敏度为170CFU／ml,福氏志贺菌LAMP方法的灵敏度为190CFU／ml,与常见的食源性致病菌均无交叉反应。结论与分离培养法相比,LAMP方法特异性高,灵敏度高,不需要特殊仪器,能够在简易的实验条件下,快速、简便地同时检测沙门菌和志贺菌,LAMP方法适用于基层疾病控制实验室开展沙门菌和志贺菌的快速筛查检测。