不同毒力株弓形虫速殖子消减cDNA文库的构建

目的构建不同毒力株弓形虫速殖子cDNA消减文库。方法以弓形虫强毒株RH株速殖子为Tester、弱毒株Prugniaud株速殖子为Driver,进行正向抑制性消减杂交;以Prugniaud株为Tester、RH株为Driver,进行反向抑制性消减杂交。分别将获取的2组抑制性消减杂交产物与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并以PCR扩增鉴定插入片段。结果获得正向和反向cDNA消减文库,每个消减文库分别随机挑取384个阳性克隆,PCR扩增显示插入率为98%,片段长度在200~2000bp之间。结论通过抑制性消减杂交技术成功构建2个消减文库,为进一步筛选和鉴定弓形虫毒力相关基因奠定了基础。     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒 E2蛋白反式调节基因

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)E2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCVE2蛋白反式调节相关基因。方法以HCVE2表达质粒pcDNA3.1(-)_E2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HCVE2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到78个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到100～1000bp插入片段。挑取38个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得35个已知基因序列和3个未知基因。通过生物信息学分析获得其全长序列,其功能正在研究中。结论应用SSH技术成功构建了HCVE2反式调节基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明HCVE2反式调节的靶基因及致慢性肝脏疾病发生的分子生物学机制提供理论依据。     

应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒E1蛋白反式激活基因

目的　应用抑制性消减杂交 (SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)E1蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVE1蛋白反式激活相关基因。方法　以HCVE1表达质粒pcDNA3 .1( -) E1转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1( -)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,从中提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成 2组 ,分别与 2种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行 2次消减杂交及 2次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果　成功构建人HCVE1蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 89个阳性克隆 ,进行菌落PCR分析 ,均得到 10 0 10 0 0bp插入片段。挑取 46个含有插入片段的阳性克隆测序分析 ,获得 44个已知基因序列和 2个未知基因。通过生物信息学分析获得其全长序列 ,已被GenBank收录。结论　应用SSH技术成功构建了HCVE1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明HCVE1反式调节的靶基因及致肝脏疾病发生的分子生物学机制提供理论依据     

人胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建

目的应用抑制消减杂交技术(SSH)构建胰腺癌和正常胰腺组织间差异表达的抑制消减cDNA文库.方法分别提取胰腺癌(tester)和癌旁正常胰腺组织(driver)中的总RNA和mRNA,合成双链cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将胰腺癌双链cDNA分为两组,分别加上不同的接头,再与正常胰腺组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,分离出胰腺癌差异表达基因的cDNA片段.将该差异表达片段克隆至T/A载体,并转化大肠杆菌TOP 10F',经蓝白斑筛选后,再用PCR方法筛选阳性克隆,从而构建胰腺癌抑制消减cDNA文库.结果文库扩增后得到257个白色克隆,随机挑取50个阳性克隆进行PCR扩增分析,其中47个克隆有插入片段,克隆阳性率为94%,片段大小主要集中在300～600bp之间.结论成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆胰腺癌特异性表达基因奠定了基础.     

应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒全S蛋白反式激活基因

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HBV全S蛋白反式激活相关基因.方法以HBV全S表达质粒pcDNA3.1(-)-全S转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果成功构建人HBV全S蛋白反式激活基因差异表达的cD-NA消减文库.文库扩增后得到86个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1000 bp插入片段.挑取35个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得33个已知基因序列,和2个未知基因,通过生物信息学分析获得其全长序列,其中之一命名为全S蛋白反式激活基因1(CSTP1),已在GenBank中注册,注册号:AY553877.未知基因的功能还正在研究中.结论应用SSH技术成功构建了HBV全S反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明HBV全S反式调节的靶基因及致肝病发生的分子生物学机制提供理论依据.     

人胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建

目的应用抑制消减杂交技术(SSH)构建胰腺癌和正常胰腺组织间差异表达的抑制消减cDNA文库。方法分别提取胰腺癌(tester)和癌旁正常胰腺组织(driver)中的总RNA和mRNA．合成双链cDNA，经RsaI酶切后，将胰腺癌双链cDNA分为两组，分别加上不同的接头，再与正常胰腺组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，分离出胰腺癌差异表达基因的cDNA片段。将该差异表达片段克隆至T／A载体，并转化大肠杆菌TOP10F’，经蓝白斑筛选后，再用PcR方法筛选阳性克隆，从而构建胰腺癌抑制消减cDNA文库。结果文库扩增后得到257个白色克隆，随机挑取50个阳性克隆进行PCR扩增分析，其中47个克隆有插入片段．克隆阳性率为94％，片段大小主要集中在300～600bp之间。结论成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库，为进一步筛选、克隆胰腺癌特异性表达基因奠定了基础。     

正常肝组织与肝癌组织差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的 构建人正常肝组织与肝癌组织差异表达基因的消减cDNA文库。方法 采用新近建立的抑制消减杂交技术,以癌旁正常肝组织及肝癌组织作为对比材料,分离肝癌组织中不表达或低表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物用电穿孔法转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取100个白色克隆进行酶切鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得4000余个白色阳性克隆,随机挑取的100个白色克隆进行酶切鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得4000余个白色阳性克隆,随机挑取的100个白色克隆经酶切后均有200-600bp的插入片段。结论 用SSH法及T/A克隆技术成功构建了正常肝组织与肝癌组织差异表达基因的消减cDNA文库,该文库的建立为进一步筛选、克隆肝癌组织中失活或低表达的新的抑癌基因奠定了基因。     

溴氰菊酯抗性白纹伊蚊抑制消减cDNA文库的构建

目的 构建溴氰菊酯抗性白纹伊蚊抑制消减cDNA文库。 方法 分别提取白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株（R-lab株）和敏感株（S-lab株）总RNA，纯化后获得mRNA，并反转录为双链cDNA。以R-lab株mRNA作为实验方（tester）， S-lab株mRNA作为驱动方（driver），以及R-lab株mRNA为driver方，S-lab株mRNA为tester方，进行正、反双向抑制性消减。富集的差异表达cDNA克隆到pMD18-T载体， 构建白纹伊蚊对溴氰菊酯抗性和敏感双向消减文库。 结果 分别从正向文库和反向文库中获得580和477个阳性克隆，从所构建文库随机挑选150个克隆进行PCR鉴定，阳性克隆率为93%，cDNA片段主要分布于150～750 bp。 结论 构建了抗溴氰菊酯白纹伊蚊抑制消减cDNA文库。     

应用抑制性消减杂交技术克隆筛选丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白2反式激活基因

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建新基因丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白2(HCVFBP2)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCVFBP2反式激活相关基因.方法:以HCVFBP2表达质粒pcDNA3.1(-)-FBP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人类新基因HCVFBP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后选取48个克隆,进行菌落PCR分析,均得200～1000bp插入片断.挑取30个克隆进行测序,通过生物信息学分析获得28个已知功能基因序列和2个未知功能基因.结论:应用SSH技术成功构建了HCVFBP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明HCVFBP2生物学功能提供理论依据.     

应用抑制性消减杂交技术克隆NS5A-TP4反式激活基因

目的：应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建人类新基因NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆NS5A-TP4反式激活相关基因，了解该基因的可能生物学功能。方法：以NS5A-TP4表达质粒pcDNA3．1(-)-TP4转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)转染的HepG2细胞为对照；制备转染后的细胞裂解液，从总RNA中提取mRNA并逆转录为cDNA，经RSaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR)，将产物与pGEM-Teasy载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果：成功构建人类新基因NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到63个白色克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的36个克隆进行测序，并通过生物信息学分析获得20种已知功能基因序列和5个未知功能基因。结论：应用SSH技术成功构建了NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为阐明NS5A-TP4生物学功能提供理论依据。     

应用抑制消减杂交技术筛选大肠癌新相关基因

目的利用抑制消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization，SSH）构建人大肠癌差异表达cDNA文序，分离并克隆出大肠癌发病的相关新基因。方法运用抑制消减杂交技术分离大肠癌组织及癌旁正常黏膜差异表达基因的cDNA片断，将其与T载体连接构建文库，从库中随机挑取200个白色菌落．使用PCR方法鉴定阳性克隆并对其中50个克隆进行测序，将测序结果登录GenBank进行卜司源性对比分析，并对部分有意义的差异表达片断进行Virtual Northern Blot分析。结果成功构建人源性大肠癌消减cDNA文库，通过筛选获得20个差异表达的基因，其中有2个片断未检测到同源性序列，根据杂交结果考虑可能是存大肠肿瘤中差异表达的新基因。结论运用SSH技术成功构建了人大肠癌的差异表达的cDNA消减杂交文库，并筛选出2个存大肠肿瘤中差异表达的新基因。     

申克孢子丝菌菌丝相和酵母相cDNA消减文库的构建及差异表达基因的筛选

目的构建申克孢子丝菌双相cDNA消减文库,筛选与双相转换相关的差异表达基因。方法运用抑制性消减杂交技术,构建申克孢子丝菌菌丝相（Mycelium,M）和酵母相（Yeast,Y）的正反cDNA消减文库,并对其差异表达的基因进行生物信息学分析。结果 M＋Y文库获得751条表达序列标签（Expressed Sequence Tags,ESTs）,经拼接后获得101条uni-genes;Y＋M文库获得875条ESTs,拼接获得249条unigenes。申克孢子丝菌酵母相菌丝相的转换伴随着不同菌相细胞差异基因的高表达,这些高表达的差异基因可分为结构基因类、代谢酶类、细胞表面分子类及功能不明的细胞分子。结论成功构建了申克孢子丝菌双相转换相关的cDNA消减文库基础上,筛选出部分差异表达基因,为进一步研究申克孢子丝菌致病相关基因奠定了基础。     

应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选PS1TP5反式激活相关基因

目的构建乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活基因5(PS1TP5)的反式激活相关基因差异表达的cDNA,克隆PS1TP5蛋白反式激活相关基因。方法以PS1TP5表达质粒pcDNA3.1(-)-myc-his(A)-PS1TP5转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)-myc-his(A)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次PCR反应,产物与T/A克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析。结果成功构建人PS1TP5蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到70个200～1 000 bp插入片段的克隆,随机挑选其中30个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得24种编码基因,其中1个为未知功能的新基因,电子拼接后命名为HBV PS1TP5TP1(乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白5反式激活蛋白1),GenBank注册号DQ487761。结论筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞...     

应用SSH技术研究H_2O_2胁迫下细粒棘球蚴基因的表达

目的构建H2O2胁迫下细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)与正常组织差异表达的消减cDNA文库。方法以H2O2胁迫细粒棘球蚴cDNA为试验方(tester),正常生长的细粒棘球蚴cDNA为驱动方(driver),应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)研究H2O2胁迫下细粒棘球蚴基因的表达。结果文库扩增后得到124个阳性克隆,菌落PCR分析,均得到200~1000bp插入片段。将整个文库克隆进行测序,测得序列结果利用BLAST在线软件与GenBank数据库进行同源序列比对分析和BlastX分析。结果获得重要基因的cDNA序列,如氧化还原酶、蛋白激酶、生长因子等。另有部分克隆在GenBank中无法查到对应的同源基因,可能代表了新基因。结论成功构建了H2O2胁迫与正常组织差异表达的消减cDNA文库,为研究细粒棘球蚴在抗氧化过程中的相关靶基因筛选奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS4B蛋白反式激活相关基因.方法以HCV NS4B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交分析.将富集的二次PCR产物与T/A载体连接,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析.结果文库扩增后得到33个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中28个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段.测序及同源性分析显示,12种已知基因编码蛋白,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS4B反式激活靶基因.结论成功构建了HCV NS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS4B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据.