二代测序对比增强免疫组化检测非小细胞肺癌ROS1基因探索

目的:比较增强免疫组化（Ventana immunohistochemistry,Ventana IHC）检测非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）C-ros原癌基因1-受体酪氨酸激酶（C-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase,ROS1）蛋白表达和二代测序（next-generation sequencing,NGS）技术检测ROS1基因融合突变的一致性。方法:应用NGS技术在DNA层面检测966例NSCLC患者标本ROS1基因融合突变情况,同时应用Ventana IHC检测其中732例标本ROS1蛋白的表达情况。结果:NGS检测结果显示966例NSCLC患者的ROS1基因融合突变率为1.0%（10/966）,阳性样本病理类型为肺腺癌。Ventana IHC检测结果显示ROS1蛋白表达阳性率为17.6%（129/732）,阳性样本病理类型主要为肺腺癌。Ventana IHC和NGS两种方法检测结果的一致性为83.6%(612/732),kappa=0.110（P＜0.001）。两种方法检测ROS1基因差异具有统计学意义（P＜0.001）。结论:作为ROS1基因的检测方法,Ventana IHC法比NGS法更灵敏,两种方法检测结果的一致性较差,两者差异具有统计学意义。Ventana IHC筛查出ROS1阳性样本,可采用NGS进行验证。     

非小细胞肺癌患者EML4-ALK融合基因突变研究

背景与目的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要类型,相关位点突变检测研究已经成为肺癌分子靶向治疗的热门方向,研究NSCLC肿瘤组织中动物微管相关蛋白4与间变性淋巴瘤激酶融合基因(echinodem microtubule associated protein like 4-Anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的基因突变状态,比较免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)与蝎形探针扩增阻滞突变系统(Scorpions amplification refractory mutation system,Scorpions ARMS)荧光定量PCR与荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测EML4-ALK融合基因与EGFR基因突变的敏感性。方法应用IHC、ARMS荧光定量PCR及FISH技术检测85例NSCLC石蜡包埋肿瘤组织以及癌旁正常肺组织中EML4-ALK融合基因状态,并应用ARMS方法检测EGFR基因第18、19、20和21外显子突变状态。结果 115例NSCLC中IHC显示32例有ALK(D5F3)表达,表达率为27.8%;ARMS检测27例存在EML4-ALK融合基因突变,突变检出率为23.5%;53例检出EGFR突变,突变率为46%。而FISH检测23例存在EML4-ALK融合基因突变,检出率为20%,稍低于ARMS检测结果,提示ARMS的敏感度更高。结论联合运用IHC/ARMS荧光定量PCR/FISH技术能够对EML4-ALK融合基因状态做出快速、准确评价。     

肺癌EGFR和EML4-ALK基因突变与临床病理特征的关系

目的探讨肺癌患者标本表皮生长因子受体(EGFR)和棘皮动物微管结合蛋白样4与间变性淋巴激酶融合基因(EML4-ALK)突变与临床病理特征的相关性。方法选取2016年8月至2018年7月间上海市同济大学附属东方医院收治的212例肺癌患者标本,包括腺癌165例和其他组织学类型47例,均采用荧光PCR法检测EGFR和EML4-ALK突变,对EML4-ALK突变阳性的标本行FISH融合基因检测及AB-PAS特殊染色,分析基因突变的特点及与临床病理特征的相关性。结果EGFR总突变率36. 8%(78例),女性高于男性,年龄<60岁者高于≥60岁者,腺癌高于非腺癌患者,与低分化腺癌相比,中、高分化腺癌EGFR突变率更高,差异均有统计学意义(均P <0. 05)。EML4-ALK突变7例,总突变率为3. 3%(7例),年龄<60岁患者阳性率高于≥60岁患者,腺癌高于非腺癌(P <0. 05)。突变主要见于含有细胞内或细胞外黏液成分的腺癌患者。212例标本中,手术标本突变率41. 0%,活检小标本突变率29. 6%,细胞学样本突变率33. 3%,但三者之间差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论肺癌EGFR突变率高于EML4-ALK突变率,但两者在临床和病理特征上有一定相似性,女性、年龄较小和腺癌患者更常见。与低分化腺癌相比,中、高分化腺癌EGFR突变率更高,EML4-ALK突变患者一般含小灶细胞内或细胞外黏液成分,但送检标本类型对基因突变无较大影响。     

非小细胞肺癌中c-Met、EGFR、K-Ras和EML4-ALK基因的检测分析

的 探讨非小细胞肺癌（NSCLC）中肝细胞生长因子受体（c-Met）基因扩增与临床病理特征的关系以及分析c-Met与EGFR、K-Ras和EML4-ALK驱动基因的相关性。方法 采用荧光原位杂交技术（FISH）检测108例NSCLC患者的c Met基因扩增情况,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测EML4-ALK融合基因及c-Met基因表达量,聚合酶链扩增反应（PCR）及直接测序法检测EGFR和K-Ras基因突变情况,并分析c-Met基因与临床病理特征的关系及其与EGFR、K-Ras和EML4-ALK驱动基因的关系。结果 NSCLC中c-Met基因扩增率为1.85％,其在吸烟和非吸烟患者中扩增率分别为2.94％和1.35％;腺癌c-Met基因扩增率为1.23％,鳞癌未发现c-Met基因扩增;仅Ⅰ期和Ⅲ期中分别有1例c-Met基因扩增。NSCLC中EGFR、K-Ras基因突变及EML4-ALK融合基因的阳性率分别为42.59％、5.56％和12.04％。结论 FISH法对c-Met基因扩增检出率与qRT-PCR检测的c-Met基因表达水平基本一致;c-Met基因扩增与EGFR、K-Ras突变及EML4-ALK融合基因之间几乎是不共存的,c-Met扩增与NSCLC患者年龄、性别、吸烟状态、肿瘤组织类型及临床分期无关。     

Ⅳ期维吾尔族非小细胞肺癌组织EML4-ALK表达与临床病理特征的关系

目的 肺癌是目前发病率较高的肿瘤,是癌症相关死亡重要的原因之一.NCCN指南已将克唑替尼(Crizotin ib)作为EML4-ALK融合基因患者的标准一线治疗.本研究探讨维吾尔族Ⅳ期非小细胞肺癌(non-small cell lung canc er,NSCLC)患者的EML4-ALK重排与临床病理特征之间的关系.方法 回顾性分析2015-01-01-2016-05-31,在新疆医科大学附属肿瘤医院采用Ventana全自动免疫组化法进行EML4-ALK检测的158例维吾尔族Ⅳ期NSCLC患者的临床资料,分析其临床病理特征与EML4-ALK重排的关系.结果 158例维尔族Ⅳ期NSCLC患者中,检测到EML4-ALK融合基因11例(6.96％).未检测到EML4-ALK融合基因的患者147例(93.04％). EML4-ALK突变与吸烟史、患者的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变状况、病理类型有关,P＜0.05;而与性别、年龄、有无淋巴结转移及分化程度无关,P＞0.05.无EGFR突变的不吸烟的腺癌患者EML4-ALK融合基因阳性率高.结论 EML4-ALK融合基因多表达于腺癌、不吸烟或既往有吸烟史,且同时无EGFR突变的维吾尔族Ⅳ期NSCLC患者.明确Ⅳ期维吾尔族NSCLC患者中EML4-ALK的表达与临床病理学特征之间的联系,便于更好地发现相应的治疗优势人群,进行及时的检测与治疗.     

13例EML4-ALK融合基因阳性非小细胞肺癌的临床病理分析

目的 探讨棘皮动物微管相关类蛋白4（EML4）-间变性淋巴瘤激酶（ALK）融合基因阳性非小细胞肺癌（NSCLC）患者的临床病理特征。方法 回顾性分析13例EML4-ALK融合基因阳性的NSCLC患者的临床病理特征,采用HE染色观察组织病理学特征,免疫组化染色法检测组织胸苷酸合成酶（TS）的表达情况,DNA扩增后直接测序法检测组织表皮生长因子受体（EGFR）及K-Ras的突变情况,并分析该亚型肺癌患者培美曲塞的疗效。结果 13例EML4-ALK融合基因阳性NSCLC患者均为腺癌,男性5例,女性8例,中位年龄48岁,4例有吸烟史。10例NSCLC组织为腺泡样结构,其中6例伴有胞内或胞外黏液;所有患者均未检出EGFR和K-Ras基因突变,3例TS高表达,10例TS低表达;7例曾接受培美曲塞化疗方案,疾病控制率为85.7％,中位疾病进展时间为5.5个月。结论 EML4-ALK融合基因阳性NSCLC多见于不吸烟的年轻女性腺癌患者,多为伴有黏液产生的腺泡样结构,不同时合并EGFR和K-Ras突变,组织中TS低表达,大部分对培美曲塞化疗较敏感。     

非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因检测结果的初步分析

目的 探讨非小细胞肺癌（NSCLC）组织棘皮动物微管样蛋白4-间变淋巴瘤激酶（EML4-ALK）融合基因的突变情况,及其与NSCLC临床病理特征和预后的关系。方法 采用突变扩增阻滞系统检测26例NSCLC组织中EML4-ALK融合基因的9种突变和表皮生长因子受体（EGFR）的18、19、20、21外显子突变,进一步分析EML4-ALK融合基因突变与NSCLC临床病理特征和总生存期（OS）的关系。结果 26例NSCLC患者中检测到6例EML4-ALK融合基因突变。EML4-ALK融合基因突变与年龄、吸烟史、临床分期、组织分化和EGFR突变有关,与病理类型、性别、标本类型和血清癌胚抗原无关（P＞0.05）。EML4-ALK融合基因阳性者的中位OS为9个月,低于阴性者的12个月,但差异无统计学意义（P=0.460）。结论 NSCLC中 EML4-ALK融合基因突变多见于无吸烟史或少量吸烟、年龄较小、临床分期较晚、组织分化较差、无EGFR突变的患者。     

山东地区非小细胞肺癌分子靶向治疗驱动基因表达情况及临床特征分析

背景与目的分子生物学靶向治疗已逐渐成为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的一个重要治疗手段,本研究通过分析山东地区NSCLC多种驱动基因表达情况及临床病理特征,为筛选分子靶向治疗目标人群提供理论依据。方法采用荧光探针PCR法检测表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）、棘皮动物微管相关蛋白4-间变性淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase, EML4-ALK）、肉瘤致癌因子-受体酪氨酸激酶（ROS proto-oncogene 1, receptor tyrosine kinase, ROS1）、鼠类肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncgene, KARS）基因表达情况,回顾性分析阳性病例的临床病理特征。结果 EGFR基因突变阳性率为36.70%,主要为19、21外显子突变,突变人群主要为女性、腺癌、不吸烟患者,组间差异有统计学意义。EML4-ALK融合基因重排阳性率为9.37%。人群特征主要为60岁以下不吸烟人群,组间差异有统计学意义,基因突变与病理类型和性别间无明显差异。ROS1融合基因重排阳性率为3.67%,均为60岁以下患者,组间差异有统计学意义。23份病例标本开展KRAS基因检测,阳性标本数2例,阳性率为8.70%。2份阳性标本均为60岁以上病例,男女各占1例,病理类型均为腺癌,均无吸烟史。此外,未发现有两种基因同时突变的病例。结论 EGFR、EML4-ALK、ROS1、KARS基因在NSCLC患者中存在较高的突变率,且具有不同的人群特征,在选择靶向治疗人群中具有重要意义。     

非小细胞肺癌患者EML4-ALK和EGFR共存突变的检测及其与临床病理特征的关系

目的:检测无锡地区非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者EML4-ALK融合基因和EGFR基因突变情况及突变亚型,并探讨其与临床病理特征的关系。方法:整群选取并回顾性分析2015年01月至2017年10月于无锡市人民医院诊治的NSCLC患者病例资料188例,采用实时荧光PCR技术检测EML4-ALK基因和EGFR基因的突变情况,并结合临床资料分析其与临床病理特征的关联。结果:在188例NSCLC患者中,EML4-ALK融合基因阳性率为9.0%。其中,女性阳性率高于男性,差异有统计学意义（14.9% vs 5.8%,P=0.036）,但阳性率与年龄（P=0.294）、远处转移（P=0.464）、病理类型（P=0.302）及吸烟史（P=0.096）无显著相关。纳入患者中184例同时完成EGFR突变检测,突变阳性率为39.1%。其中,女性阳性率显著高于男性（65.6% vs 25.0%,P<0.001）,腺癌显著高于其他病理类型（P<0.001）,无吸烟史患者高于有吸烟史患者（45.3% vs 28.4%,P=0.023）,Ⅰ期（P=0.045）和瘤体直径≤5 cm（P=0.020）的患者突变阳性率亦偏高。但EGFR突变阳性率与年龄（P=0.853）、远处转移（P=0.921）无显著相关。184例同时检测EML4-ALK基因和EGFR基因的患者中,有3例为双突变阳性,发生率为1.63%。结论:无锡地区NSCLC的EML4-ALK融合基因、EGFR基因突变、共存突变的阳性率及其与临床病理特征的关系与国内外报道相仿。EML4-ALK融合基因及EGFR基因突变对临床治疗具有重要指导价值,共存突变患者的临床治疗方案仍有待进一步研究提供循证依据。     

EML4-ALK在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的 探讨EML4-ALK融合基因在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及其与临床病理特征的关系。方法 应用免疫组织化学SP法及组织芯片技术检测245例NSCLC及80例癌旁组织中EML4-ALK的表达情况,并分析其表达与NSCLC临床病理特征的关系。结果 EML4-ALK蛋白在NSCLC组织中的阳性表达率为7.35％（18／245）,而在癌旁组织中无表达。EML4-ALK在NSCLC中的表达与性别、吸烟史、病理类型及临床分期密切相关（P＜0.05）。结论 EML4-ALK可能在NSCLC的发生、发展过程中起到了重要作用,可作为潜在的治疗靶点。     

非小细胞肺癌患者肿瘤组织和血清EMIA—ALK融合基因突变的研究

目的观察在中国人群中非小细胞肺癌（NSCLC）患者血清及肿瘤组织的棘皮动物微管相关蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶（EMIA-ALK）融合基因突变表达率,及血清与肿瘤组织中突变的一致性,探讨临床应用实时荧光定量PCR（FQ—PCR）技术进行实时、动态检测EML4-ALK融合基因指导临床治疗的可行性。方法采用FQ—PCR检测123例NSCLC血清和98例NSCLC组织EML4-ALK融合基因突变,其中77例血清和肿瘤组织进行配对检测,并研究分析接受ALK抑制剂（克唑替尼）治疗患者的临床疗效。结果123例血清中EMIA—ALK融合基因突变13例（10．6％）,98例肿瘤组织中EMIA．ALK融合基因突变11例（11．2％）,EMIA-ALK融合基因突变主要存在于腺癌（χ2=4．083,P=0．036）、非吸烟患者（χ2=5．326,P=0．019）。以组织标本基因突变为标准,血清与组织突变一致性达到66．7％（6／9,κ=0．779）。EMIA-ALK融合基因突变的患者接受间变性淋巴瘤激酶（ALK）抑制剂（克唑替尼）治疗取得显著获益。结论NSCLC肿瘤组织和血清EML4-ALK融合基因突变主要存在于腺癌、非吸烟人群。在无法获取肿瘤组织标本时可以采用FQ-PCR检测血清EMIA—ALK融合基因突变代替组织基因检测,筛选出适合克唑替尼治疗的NSCLC患者。     

Fluorescence In Situ Hybridization,Immunohistochemistry, and Next‐Generation Sequencing for Detection of EML4‐ALK Rearrangement in Lung Cancer

Background.

The U.S. Food and Drug Administration-approved method for detecting EML4-ALK rearrangement is fluorescence in situ hybridization (FISH); however, data supporting the use of immunohistochemistry (IHC) for that purpose are accumulating. Previous studies that compared FISH and IHC considered FISH the gold standard, but none compared data with the results of next-generation sequencing (NGS) analysis.

Materials and Methods.

We studied FISH and IHC (D5F3 antibody) systematically for EML4-ALK rearrangement in 51 lung adenocarcinoma patients, followed by NGS in case of discordance.

Results.

Of 51 patients, 4 were positive with FISH (7.8%), and 8 were positive with IHC (15.7%). Three were positive with both. NGS confirmed that four of the five patients who were positive with IHC and negative with FISH were positive for ALK. Two were treated by crizotinib, with progression-free survival of 18 and 6 months. Considering NGS as the most accurate test, the sensitivity and specificity were 42.9% and 97.7%, respectively, for FISH and 100% and 97.7%, respectively, for IHC.

Conclusion.

The FISH-based method of detecting EML4-ALK rearrangement in lung cancer may miss a significant number of patients who could benefit from targeted ALK therapy. Screening for EML4-ALK rearrangement by IHC should be strongly considered, and NGS is recommended in borderline cases. Two patients who were negative with FISH and positive with IHC were treated with crizotinib and responded to therapy.     

非小细胞肺癌治疗的新靶点:EML4-ALK融合基因

3年前棘皮动物微管相关类蛋白4(echinoderm microtubule-associated protein-like 4,EML4)与间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)融合基因被发现存在于部分非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中。该融合基因常见于不吸烟的肺腺癌患者,有其独特的病理学特征,可以诱导肿瘤生成。ALK抑制剂能够作用于该基因的下游信号传导通路并拮抗其促肿瘤生成活性。本文旨在介绍EML4-ALK基因的结构、功能、生物学特征、检测方法及其在肺癌诊断治疗中的意义。     

EML4-ALK Rearrangement and Its Clinical Significance in Chinese Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer

Objective: To identify the clinicopathological characteristics and clinical outcomes of Chinese patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) and to investigate possible associations of NSCLC with echinoderm microtubule-associated protein-like 4 (EML4)-anaplastic lymphoma kinase (ALK) and epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations. Methods: Patients with stage IV NSCLC were screened for EML4-ALK rearrangement and EGFR mutations at the Peking University Cancer Hospital. EML4-ALK was identified using fluorescent in situ hybridization and confirmed by immunohistochemistry. EGFR mutations were determined using denaturing high-performance liquid chromatography. Results: The incidence of EML4-ALK was 9.7% (11/113). Patients with EML4-ALK were more likely to present the EGFR wild type (WT; p = 0.033). Response to EGFR-tyrosine kinase inhibitor (TKI) was similar between patients with EML4-ALK rearrangement and EGFR mutation (33.3 vs. 46.9%, p = 0.451), but progression-free survival (PFS) was inferior compared to those with EGFR mutation (2.1 vs. 8.8 months, p = 0.032), and similar to patients with WT/nonrearrangement (2.1 vs. 2.2 months, p = 0.696; and general p = 0.023 between the three cohorts). Moreover, 2 patients with concurrent EML4-ALK and EGFR mutations had superior PFS after EGFR-TKI compared to patients with single EML4-ALK rearrangement. Conclusions: Patients with EML4-ALK conferred similar objective response rates after EGFR-TKI although inferior PFS compared to those with EGFR mutation. Coexistence of EML4-ALK and EGFR mutation might represent a separate NSCLC genotype.     

EML4-ALK与非小细胞肺癌相关研究进展

 EML4-ALK是新近发现的主要表达于非小细胞肺腺癌中的融合基因,多出现在年轻的轻度吸烟或非吸烟患者中, ALK抑制剂crizotinib治疗EML4-ALK阳性非小细胞肺癌有很高的应答率,其出现进一步完善了非小细胞肺癌的个体化治疗。