ING4基因表达对乳腺癌细胞生长抑制作用的研究

目的：研究人ING4基因对乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用。方法：通过实时荧光定量-PCR（real-time fluorogentic quantitative-PCR，RFQ-PCR）检测3种乳腺癌细胞株中ING4 mRNA的表达水平；ING4基因的表达质粒转染MCF-7细胞；MTT法和FCM法检测ING4基因对MCFM细胞增殖的影响；Annexin-V／PI双染法观察细胞凋亡情况；RT-PCR法分析转染／NG4后p53、p21及bax基因的转录表达情况。结果：在3种乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-435和MDA-MB-231中ING4的表达均明显低于正常乳腺组织。转染ING4表达载体的MCF-7细胞较对照组细胞生长速度减慢（P〈0．05）；细胞周期中G1期比例增加，S期比例减少；细胞凋亡率升高。p53的表达未见明显变化，而p21和bax表达显著上调。结论：ING4与乳腺癌的发生发展具有一定相关性；高表达ING4基因能够抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长。     

Ad-p53诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡作用

目的：观察重组人p53腺病毒（ p53-expressing adenovirus,Ad-p53）对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞生长、细胞周期、凋亡和p53表达的影响。方法：流式细胞仪检测Ad-p53作用于MDA-MB-231细胞72h后细胞凋亡率和细胞周期变化,Western blot法检测MDA-MB-231细胞p53蛋白表达。结果：经Ad-p53处理72h后倒置显微镜下MDA-MB-231细胞形态发生明显的变化。流式细胞术检测结果显示, Ad-p53作用MDA-MB-231后其细胞凋亡率与对照组相比明显增加,G0/G1期细胞比例逐渐升高,S期、G2/M期细胞比例相应减少（ P＜0.05）。Western blot证实了外源野生型p53基因能在MDA-MB-231细胞表达增加。结论：Ad-p53可以抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的生长,促进其凋亡,其机制可能是通过阻滞细胞周期以及野生型p53蛋白表达增加实现的。     

脂氧合酶抑制剂NDGA对胰腺癌细胞PCNA-1增殖和凋亡的影响

目的：探讨脂氧合酶抑制剂NDGA对人胰腺癌细胞株PCNA-1生长抑制、诱导凋亡及其对bcl-2、bax表达的影响。方法：采用MTT法检测NDGA对胰腺癌细胞株PCNA-1增殖活性的影响,流式细胞术检测NDGA处理的胰腺癌细胞株PCNA-1的细胞周期及凋亡相关蛋白bcl-2、bax的表达。结果：NDGA抑制胰腺癌细胞株PCNA-1的增殖活性,呈剂量依赖效应关系;细胞经100μmol／L的NDGA处理后G0／G1期细胞减少（P〈0．05）、S期细胞增多（P〈0．05）,G2／M期细胞无明显变化;细胞经100μmol／L的NDGA处理48h后bcl-2蛋白与对照组相比表达下调（P〈0．01）、bax蛋白与对照组相比表达上调（P〈0．01）。结论：NDGA对胰腺癌细胞株PCNA-1有抑制增殖、诱导其凋亡作用,诱导细胞凋亡的机制可能与细胞凋亡相关基因bcl-2表达下调、bax表达上调有关。     

外源性TGFBI抑制乳腺癌细胞生长的体内外实验

目的 研究转化生长因子β诱导基因 (transforming growth factor-β induced gene, TGFBI) 是否能抑制人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)的体内外增生。方法 将外源性TGFBI稳定转染到人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)中,测定细胞增殖率、细胞周期、软琼脂克隆形成率及P21、P53蛋白表达变化,检测乳腺癌细胞的致瘤性。结果 外源性TGFBI在人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)中能够稳定地高表达;外源性TGFBI可以明显地抑制乳腺癌细胞因血清生长因子刺激的增生;与转染空质粒的对照组细胞V23101比较,外源性TGFBI相对软琼脂克隆形成数减少了90.89%; TGFBI可以使人乳腺癌细胞阻滞在G1期,延缓其进入S期的时间。外源性TGFBI可以延长裸鼠肿瘤发生的潜伏期,并降低肿瘤发生率。结论 TGFBI能够抑制人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)的体内外增生。     

5-Aza-CdR对乳腺癌细胞增殖及Maspin 基因表达的影响

目的研究5-氮-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对乳腺癌MDA-MB-435S细胞增殖及抑癌基因Maspin表达的影响。方法用特异性甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理乳腺癌细胞株MDA-MB-435S8d后，采用四唑盐（MTT）比色法观察细胞在药物处理前后的生长活性，应用流式细胞仪进行细胞周期的检测，RT-PCR检测细胞处理前后MaspinmRNA的表达。结果5μmol／L 5-Aza-CdR处理乳腺癌细胞株MDA-MB-435S8d后，与对照组比较能明显抑制肿瘤细胞的生长。流式细胞仪检测发现5μmol／L5-Aza-CdR作用72h后可导致MDA-MB-435S细胞G2／M期阻滞，减少进入有丝分裂期的细胞百分比。RT-PCR显示Maspin mRNA在5μmol／L 5-Aza-CdR作用72h后重新表达。结论在人乳腺癌MDA-MB-435S细胞中，Maspin基因可能因高甲基化而导致转录失活，经特异性甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理可使Maspin基因重新表达，后者能导致该肿瘤细胞G2／M期阻滞，并抑制细胞生长。     

沉默EZH2基因表达对肾癌细胞生物学行为的影响

目的 研究RNA干扰靶向沉默EZH2基因表达对ACHN肾癌细胞株增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法 应用Western blot法检测EZH2蛋白在人正常近端肾小管上皮细胞株HK-2和肾癌细胞株786-0和ACHN中的表达。脂质体法介导化学合成EZH2 siRNA转染ACHN细胞株,Western blot法检测转染后ACHN细胞EZH2蛋白的表达情况,CCK-8法检测转染后ACHN细胞增殖率,流式细胞术检测转染后ACHN细胞周期分布和凋亡情况。结果 肾癌细胞株786-0和ACHN中EZH2蛋白的表达水平明显高于人正常近端肾小管上皮细胞HK-2。RNA干扰EZH2基因可成功地敲减ACHN细胞EZH2蛋白的表达。EZH2-siRNA干扰后,实验组ACHN细胞生长明显受抑制,在转染后48和72 h细胞增殖受抑制效应著（P＜0.05）。细胞周期分析显示：siEZH2转染组G1期ACHN细胞比例呈增加趋势,而S期和G2期细胞比例呈减少趋势,其中在转染后48h G1期ACHN细胞比例显著增加,而S期和G2期细胞比例明显下降（P＜0.05）;凋亡分析显示：siEZH2转染组ACHN细胞凋亡率随转染后时间的延长而呈增加趋势,在转染后48和72 h细胞凋亡率增加最显著（P＜0.05）。结论 沉默EZH2基因表达可靶向肾癌ACHN细胞周期中G1/S限制点而阻滞细胞周期进展,同时可有效抑制肾癌细胞增殖和促进细胞凋亡。     

CD151对人宫颈癌Hela细胞增殖反应的影响

目的：探讨CD151对人宫颈癌Hela细胞增殖的影响。方法：利用脂质体分别将pcDNA3．1-CD151、pcD—NA3．1-antiCD151和pcDNA3．1-GFP重组质粒转染Hela细胞。Westernblot分析细胞CDl51及核增殖抗原（PCNA）的表达；MTT法检测细胞增殖反应；流式细胞仪分析细胞周期变化。结果：转染pcDNA3．1-CD151与未转染组及转染pcDNA3．1-GFP对照组比较，Hela细胞CD151表达显著上调（P〈0．01）；细胞增殖反应显著提高（P〈0．01）；增殖期S＋G2/M细胞比例增高（P〈0．05）；PCNA表达亦明显增强（P〈0．01）。而转染pcDNA3．1-antiCD151后，Hela细胞CD151表达明显下调（P〈0．01）；细胞增殖反应及PCNA表达明显下降（P〈0．01）；S＋G2／M细胞比例降低（P〈0．05）。结论：CD151的表达对肿瘤细胞的增殖反应起重要作用，通过反义CD151基因干预．可下调细胞中CD151的表达，抑制肿瘤细胞增殖。     

shRNA-CXCR4对人乳腺癌细胞增殖活性的影响

背景与目的：CXCR4足趋化细胞因子SDF—l（基质细胞衍生因子-1）的受体：CXCR4／SDF-1轴在肿瘤侵袭，转移中具有重要作用．阻断CXCR4／SDF-1轴，有可能成为一个新的肿瘤治疗标靶，本研究拟探讨shR-NA—CXCR4对人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA—MB-231，MDA．MB435s细胞增殖活性的影响。方法：通过质粒shRNA—CXCR4沉默CXCR4基因后．RT—PCR，Weslernblot检测3株人乳腺癌细胞的CXCR4mRNA及其蛋白的表达；MTT．流式细胞仪检洲它们的增殖结果：质粒shRNA—CXCR4作用于3株人乳腺癌细胞后能明显抑制其CXCR4基因的tuRNA（MDA—MB-23l：实验组CXCR4／GAPDH为0．152．空白组和阴性对照组分圳为0．40及0．45．MDA-MB-435s：实验组为0．198，空白对照组和阴性对朋组分别为0．690及0．775，MCF-7：实验组为0．089，空白对照组和阴性对照组分别为0．327及0．313）及蛋白表达水平（MDA—MB-231：实验组CXCR4／β-actin为0．153，空白组和阴性对照组分圳为0．829及0．878，MDA—MB-435s：实验组为0．173，空白对照组和阴性对照组分别为0．877及0．906，MCF-7：实验组为0．177，空白对照组和阴性对照组分别为0．911及0．874）（P〈0．05）；MTT显示能明显抑制3株人乳腺癌细胞的增殖（P〈0．05）；流式细胞仪显示3株人乳腺癌细胞S期细胞数量明显减少（P〈0．05），将更多的细胞阻滞在G0／G1朗（P〈0．05）结论：shRNA—CXCR4作用于CXCR4基因后能明显抑制人乳腺癌细咆生长和增殖一可能是治疗乳腺癌的一个潜在治疗耙点。     

肿瘤转移抑制基因nm23-H1对不同宫颈癌细胞侵袭和增殖的作用

背景与目的：nm23-H1是一种多效性基因,其抑癌作用有一定的组织特异性。本研究目的在于探讨nm23-HI对不同宫颈癌细胞增殖和侵袭的作用。方法：将真核表达载体pcDNA3．1-nm23-HI转染入宫颈癌细胞,Transwell小室法检测转染前后细胞侵袭性改变。M1Tr法绘制生长曲线,比较细胞增殖能力。流式细胞仪检测细胞周期改变。结果：与亲本细胞Caski、SiHa和空载体转染细胞Caski-3．1、SiHa-3．1相比．pcDNA3．1-nm23-H1转染细胞Caski—N和SiHa—N的侵袭力和增殖受到明显抑制（P〈0．05）,G2／M期和S期细胞比例降低（P〈0．05）,而G。／G．期细胞比例明显增加（P〈0．05）。nm23-H1对HeLa细胞增殖、侵袭及细胞周期均无明显影响（P〉0．05）。结论：nm23-H1对不同宫颈癌细胞的增殖和侵袭等细胞表型可产生细胞特异性的抑制作用。     

RNA干扰技术沉默Stat3基因对胃癌细胞SGC7901生物学行为影响的实验研究

目的：构建Stat3-siRNA表达载体，探讨转染Slat3-siRNA表达载体阻断人胃癌细胞系SGC7901的Stat3信号传导通路对人胃癌细胞增殖和凋亡的影响。方法：利用RNAi技术，构建Star3－siRNA表达载体，稳定转染胃癌细胞系SGC7901，利用Real—time PCR、Western Blot、MTT、流式细胞技术等方法分别检测Stat3基因mRNA和蛋白表达及细胞增殖和凋亡的变化情况，结果：成功构建Stag—siRNA表达载体，经测序验证无误。Weslern Blot及Real—time PCR结果显示：Stat3基因的表达水平均下降，其中以SGC7901-siRNA3干扰效果最明显，差异具有显著性（P〈0．05）。MTT法结果显示：稳定转染SGC7901细胞后，细胞的增殖能力明显下降，与对照组相比差别显著（P〈0．05）。流式细胞技术显示：Stat3-siRNA3实验组较对照组出现了明显的细胞凋亡，在G1期前出现的亚二倍峰即为凋亡峰。结论：Star3基因的RNAi重组体可以有效的抑制Star3基因的表达，RNA干扰技术沉默Stat3基因能够抑制胃癌细胞的生长，促进其凋亡。     

RNA干扰抑制MTA 1的表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的影响

目的:探讨通过RNA干扰技术抑制MTA1的表达及对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和细胞周期的影响。方法:建立3种稳定表达靶向MTA1的shRNA的MDA-MB-231细胞系。通过反转录-聚合酶链反应(reverse transeription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫组化法验证基因表达的抑制效果;采用细胞计数法及噻唑蓝(thiazolylblue,MTT)法检测细胞的增殖能力;流式细胞仪分析细胞周期。结果:MTA1基因被抑制后,其mRNA表达明显下降,RT-PCR结果显示,稳定转染3种重组质粒后,MTA1mRNA水平较对照组分别下调了70.07%、82.40%和63.44%;同时,MDA-MB-231细胞的生长明显受抑制,与对照组细胞相比,细胞计数示细胞数目明显减低;MTT分析示细胞增殖下降,流式细胞分析示细胞周期阻滞在G0/G1期。结论:在MDA-MB-231细胞中,抑制MTA1的表达可有效抑制细胞生长并导致细胞周期的阻滞;利用RNA干扰技术抑制MTA1的表达可能会成为一种有效的乳腺癌基因治疗手段。     

RNA干扰REG1A基因抑制人膀胱癌T24细胞增殖

目的:观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默REG1A (regenerating islet-derived 1 alpha)基因的表达对人膀胱癌T24细胞增殖及细胞周期的影响.方法:化学合成针对REG1A基因的3对siRNA,使用脂质体将其转染至T24细胞中.应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测REG1A siRNA转染后T24细胞REG1A mRNA和蛋白的表达,CCK-8(cell counting kit-8)法检测转染后的细胞增殖情况,FCM检测转染后细胞周期的变化.结果:与空白对照组比较,REG1A siRNA转染T24细胞后,REG1A mRNA和蛋白表达分别下降了(83.10±0.06)％和(55.81±0.16)％,差异有统计学意义(P＜0.05);细胞增殖受到抑制(P＜0.05),G0/G1期细胞百分比明显增加(P＜0.05),细胞增殖指数下降(P＜0.05).结论:REG1A siRNA能有效抑制膀胱癌T24细胞REG1A mRNA和蛋白的表达,并抑制细胞增殖.     

抑癌基因PTEN对乳腺癌ZR-75-1细胞增殖和转移的抑制作用

背景与目的:研究表明,抑癌基因PTEN不仅能抑制肿瘤细胞的增殖,还能抑制其转移,但其机理还不甚明了.本文研究抑癌基因PTEN对人乳腺癌ZR-75-1细胞增殖和转移的作用.方法:以脂质体介导法分别将野生型PTEN质粒和磷酸酶缺陷的PTEN质粒转染人乳腺癌ZR-75-1细胞,用MTT法测定细胞增殖抑制率:转染后用嘌呤霉素筛选阳性克隆.用Western blot法检测细胞中PTEN蛋白的表达.通过细胞-基质粘附实验和人工重组基底膜侵袭实验,检测细胞粘附抑制率与侵袭抑制率.结果:野生型PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞增殖明显被抑制,并伴有部分细胞凋亡;该细胞与未经转染的和磷酸酶缺陷的PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞比较.细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(42.7% vs.0%及2.7%,P＜0.01),细胞增殖抑制效应随细胞培养时间与质粒浓度的增加而增强.而磷酸酶缺陷的PTEN质粒转染的与未经质粒转染的ZR-75-1细胞比较,细胞增殖抑制率差异无统计学意义(2.7%vs.0%,P＞0.05).在两种PTEN质粒转染的ZR-75-1细胞中PTEN蛋白均明显表达,其中转染野生型PTEN质粒的细胞的粘附抑制率与侵袭抑制率分别达65.7%和70.4%,而转染磷酸酶缺陷的PTEN质粒的ZR-75-1细胞的粘附抑制率与侵袭抑制率分别只有8.8%和6.9%(P＜0.05).结论:具有双特异磷酸酶活性的野生型PTEN基因对ZR-75-1细胞的增殖和转移有一定的抑制作用.     

顺铂耐药乳腺癌细胞株的建立及FANCF 基因在耐药中的作用

[摘要] 目的：探讨三阴性乳腺癌顺铂（cisplatin, DDP)耐药细胞和敏感细胞中FA/BRCA通路关键基因FANCF的表达和功能,以及与DDP耐药的相关性。方法：DDP浓度递增法诱导建立乳腺癌细胞MDA-MB-231的DDP耐药细胞株MDA-MB-231/DDP;通过RNAi技术敲减MDA-MB-231 敏感细胞和DDP耐药细胞中FANCF,并在mRNA和蛋白水平进行敲减效果验证。CCK-8 法检测DDP耐药细胞株增殖活性,Western blotting 法检测该细胞中FANCF蛋白表达,流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞周期和凋亡情况,实时定量PCR（RT-qPCR）法检测FANCF mRNA的表达。结果：MDA-MB-231细胞DDP诱导3个月建立的MDA-MB-231/DDP细胞株耐药指数为13.5,其G0/G1 期细胞增多、S期和G2/M期细胞减少。MDA-MB-231/DDP细胞中FANCF mRNA和蛋白表达水平显著升高（均P<0.01）。FANCF敲低后MDA-MB-231/DDP细胞凋亡增加,细胞对DDP的药物敏感性显著升高（均P<0.01）。结论：FANCF基因通过抗凋亡作用导致MDA-MB-231细胞对DDP的耐药性,FANCF是乳腺癌治疗的一个潜在靶点。     

不同人乳腺肿瘤细胞系中Jagged1基因和蛋白的表达水平

目的:研究Jagged1蛋白和mRNA在人乳腺癌细胞系中的表达。方法:分别使用蛋白印迹法及实时定量聚合酶链式反应检测Jagged1蛋白和基因在人乳腺癌细胞系中的表达情况。结果:Jagged1在不同的人乳腺肿瘤细胞系中蛋白和基因的表达水平不同。结论:Jagged1蛋白在人乳腺癌细胞系ZR-75-30和MDA-MB-231中高表达,Jagged1基因在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231,HCC 1937中高表达,Jagged1可能是在人乳腺癌的发展进程中发挥着重要的作用。     

shRNA靶向沉默CNTN1表达抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-468增殖及克隆形成能力

目的:探讨短发夹RNA(shRNA)靶向沉默CNTN1基因表达对乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖及克隆形成能力的影响。方法:采用RT-PCR和Western blot法检测乳腺癌细胞株MCF7-ADR、MDA-MB-468、MCF7以及Hs578T中的CNTN1 mRNA和蛋白表达水平。采用LipofectamineTM2000 向MDA-MB-468细胞株转染成功构建的靶向沉默CNTN1表达的shRNA载体片段,并采用RT-PCR法和Western blot法进行鉴定。分别通过MTT法、流式细胞仪技术和平板克隆实验检测各组细胞增殖及克隆形成能力的改变。结果:CNTN1 mRNA和蛋白表达水平在MDA-MB-468中最高。沉默组MDA-MB-468细胞发生G1期阻滞,增殖能力明显降低(P＜0.05),克隆形成能力明显减弱(P＜0.05)。结论:CNTN1基因在乳腺癌MDA-MB-468细胞中高表达,沉默其表达可抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖和克隆形成能力。     

沉默p65基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞周期的影响

目的研究miRNA(microRNA)沉默p65基因后对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞周期分布的影响。方法用pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体构建p65 miRNA表达质粒,转染MDA-MB-231细胞,用RT-PCR检测转染前后各组细胞中p65 mRNA表达变化;凝胶电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)实验研究转染前后细胞中NF-κB结合活性的变化;流式细胞术(Flow cytometry, FCM)观察转染前后细胞周期分布的变化;Westernblot法检测转染前后细胞周期相关因子cyclinD1、CDK4、p21蛋白表达的变化。结果p65 miRNA质粒明显下调MDA-MB-231细胞中p65 mRNA的表达水平,并显著抑制细胞中NF-κB的结合活性(P<0.05)。FCM结果显示,转染组细胞G₀/G₁期细胞比例显著增加,S、G₂/M期细胞比例明显下降(P<0.05);Western blot分析结果显示,沉默p65基因后细胞中cyclinD1蛋白表达下调,p21蛋白表达增加。结论p65 miRNA可以显著降低p65 mRNA的表达,诱导乳腺癌细胞发生G₀/G₁期阻滞,可能是通过降低cyclinD1蛋白,上调p21蛋白表达而实现的。