相关成纤维细胞自噬调控对乳腺癌MCF-7细胞上皮间质转化影响

目的 研究报道,乳腺癌相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)在乳腺癌的侵袭、转移中起到促进作用,而机制未明.本研究探讨乳腺癌CAFs自噬调控对MCF-7细胞EMT进程的影响.方法 采用胶原酶消化法对CAFs及配对人乳腺癌正常成纤维细胞(NBFs)进行原代培养,采用免疫荧光和蛋白质印迹法进行鉴定;建立CAFs和NBFs与MCF-7条件培养基(CM)共培养及Transwell小室共培养模型,共分为3组进行实验,空白组即MCF-7单独培养组(CON),对照组即正常乳腺癌成纤维细胞与MCF-7共培组(NBFs),实验组即乳腺癌相关成纤维细胞与MCF-7共培养组(CAFs).Transwell侵袭及迁移实验检测各组MCF-7细胞侵袭和迁移能力.蛋白印迹法检测各组MCF-7细胞EMT上皮标志分子E-cadherin蛋白和间质标志分子N-cadherin和Vimentin蛋白表达情况;蛋白质印迹法检测CAFs与NBFs自噬相关蛋白LC3B、Beclin1和p62表达差异;自噬抑制剂3MA处理CAFs后蛋白质印迹法检测CAFs上述自噬相关蛋白表达差异;予以自噬抑制剂3MA预处理CAFs后,收集CM与MCF-7共培养,分3组进行实验,空白组即MCF-7单独培养组(CON);对照组即MCF-7与CAFs-CM共培养组(CAFs-CM);实验组即MCF-7与3MA-CAFs-CM共培养组(3MA-CAFs-CM).蛋白质印迹法检测各组MCF-7细胞EMT上皮标志分子E-cadherin蛋白和间质标志分子N-cadherin和Vimentin蛋白表达情况.结果 通过酶消化法原代培养可获取α-SMA(+)、Vimentin(+)E-cadherin(-)具有CAFs典型特征的肌成纤维细胞;Transwell侵袭、迁移实验证实CAFs可促进MCF-7细胞侵袭、迁移;蛋白质印迹法检测显示,CAFs组MCF-7 E-cadherin蛋白表达量为0.432±0.012,比NBFs组的0.585±0.02及空白组的0.659±0.016表达水平低,F=120.098,P<0.05.而CAFs组间质蛋白标志物Vimentin蛋白表达量为0.309±0.065,比NBFs组的0.103±0.011及空白组的0.062±0.009表达低,F=42.395,P均<0.05.CAFs组N-cadherin蛋白表达量为1.439±0.07比BNFs组的1.3347±0.028及空白组的1.176±0.021表达低,F=22.578,P<0.05,提示CAFs促进MCF-7发生EMT;CAFs细胞的Beclin1蛋白表达量为2.950±1.261,高于NBFs的0.862±0.727,t=-3.21,P<0.05;CAFs细胞的LC3BⅡ/LC3BⅠ灰度值比值为2.937±0.194,高于NBFs的2.314±0.224,t=-3.638,P<0.05;而CAFs p62蛋白表达量为0.342±0.093,低于NBFs的0.750±0.021,t=7.432,P<0.05,提示CAFs自噬水平高于NBFs.予以自噬抑制剂3MA处理CAFs后,处理组CAFs细胞的Beclin1蛋白表达量为0.211±0.008,低于未处理组的0.266±0.009,t=8.094,P<0.05;处理组CAFs细胞的LC3BⅡ/LC3BⅠ灰度值比值为0.496±0.004,低于未处理组的0.618±0.022,t=9.312,P<0.05;而处理组的p62蛋白表达量为0.307±0.043,高于未处理组的0.143±0.008,t=-6.471,P<0.05,说明3MA可以抑制CAFs自噬水平.自噬调控后共培养,各组E-cadherin蛋白表达有统计学意义,F=44.157,P<0.05;与对照组MCF-7细胞E-cadherin蛋白表达量1.209±0.010相比,CAFs-CM组的1.062±0.027表达下调,而3MA-CAFs-CM组MCF-7细胞E-cadherin蛋白表达量为1.104±0.019,较CAFs-CM组表达上调,均P<0.05;3组MCF-7细胞Vimentin和N-cadherin表达差异有统计学意义,P<0.05.结论 CAFs能够促进MCF-7发生EMT并增强其侵袭转移能力,而抑制CAFs自噬后,其诱导的MCF-7发生EMT进程受到抑制.     

缺氧能引起EMT的发生促进乳腺癌的侵袭和迁移

 目的　探讨缺氧对人类乳腺癌细胞MCF-7上皮-间质转化（ EMT）标志分子E-钙黏着素（E-cadherin）、波型蛋白（Vimentin）及侵袭迁移能力的影响,揭示缺氧引起乳腺癌侵袭转移的机制, 为临床治疗乳腺癌提供实验及理论依据。方法　采用Western blot检测低氧诱导因子-1α（HIF-1α）、E-cadherin、Vimentin的变化;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测缺氧对人类乳腺癌细胞MCF-7黏附能力的影响;Transwell侵袭小室法检测缺氧对MCF-7细胞侵袭和迁移能力的影响。结果　随着缺氧时间的延长,人类乳腺癌细胞中E-cadherin表达明显降低（0.09±0.02）（t＝30.98,P＝0.0007）,Vimentin表达明显升高（0.69±0.04）（t＝915,P＝0.0000) ;缺氧72 h组MCF-7细胞黏附（81.23±0.74）（t＝82.05,P＝0.000）、侵袭（120±6） （t＝22.78,P＝0.0009）和迁移能力明显增强（190±6）（t＝23.49,P＝0.000）。结论　缺氧能下调E-cadherin、上调Vimentin而引起EMT的发生,促进MCF-7细胞黏附、侵袭和迁移。     

乳腺癌MCF-7细胞通过TGF-β诱导的上皮-间质转化获得耐药北大核心CSCD

目的:通过研究高侵袭转移性乳腺癌细胞株MDA-MB-231和低侵袭转移性细胞株MCF-7中上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和耐药的相关性,以探讨乳腺癌耐药的机制。方法:采用实时荧光定量PCR法检测MDA-MB-231和MCF-7细胞中EMT标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和纤黏蛋白(bronectin)以及转录因子Snail、Slug和锌指E-box同源结合框1(Zincnger E-box binding homeobox 1,ZEB1)mRNA的表达水平;划痕愈合实验和Transwell小室实验分别检测MDA-MB-231和MCF-7细胞的迁移和侵袭能力;CCK-8法检测MDA-MB-231和MCF-7细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶、顺铂和紫杉醇的敏感性,并采用实时荧光定量PCR法检测耐药基因多重耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1,MDR1)和MDR相关蛋白1(MDR-associated protein,MRP1)mRNA的表达水平。用转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)诱导MCF-7细胞发生EMT,或用靶向E-cadherin基因的E-cadherin-siRNA沉默EMT相关标志物E-cadherin的表达,再用CCK-8法检测MCF-7细胞对5-氟尿嘧啶敏感性的变化。结果:MDA-MB-231细胞中vimentin、fibronectin、Slug和ZEB1 mRNA的表达水平均高于MCF-7细胞(P值均<0.000 1),E-cadherin mRNA的表达水平明显低于MCF-7细胞(P=0.000 2),Snail mRNA的表达水平无明显差异。与MCF-7细胞相比,MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力明显更强(P值均<0.000 1);5-氟尿嘧啶、顺铂和紫杉醇对MDAMB-231细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值明显高于MCF-7细胞(P值均<0.05);MDA-MB-231细胞中耐药相关基因MDR1和MRP1 mRNA表达水平明显更高(P值均<0.000 1)。TGF-β诱导MCF-7细胞发生EMT后,5-氟尿嘧啶对MCF-7细胞的IC50值明显上升(P<0.05);沉默E-cadherin表达后,MCF-7细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性明显增强(P<0.05)。结论:乳腺癌中EMT和耐药存在相关性,诱导EMT发生可导致细胞耐药。     

Trim37过表达通过激活Wnt/β-catenin通路促进乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及EMT

目的:探讨Trim37通过Wnt/β-catenin通路对乳腺癌发展的影响及其作用机制。方法:实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和Western blot检测Trim37在乳腺癌组织、癌旁正常组织、人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)和人正常乳腺上皮细胞(MCF-10A细胞)中的表达。pcDNA-Trim37或Trim37 siRNA转染MCF-7细胞后,CCK-8法检测过表达及下调Trim37对细胞增殖的影响,Transwell实验检测过表达及下调Trim37对细胞侵袭的影响,细胞划痕愈合实验检测过表达及下调Trim37对细胞迁移的影响,Western blot检测过表达及下调Trim37对细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin和Snail)及β-catenin、CyclinD1、p-ERK、p-AKT和p-FAK蛋白表达的影响。Wnt/β-catenin通路抑制剂(XAV939)作用MCF-7细胞后,检测MCF-7细胞增殖、...     

TET1蛋白对人乳腺癌MDA-MB-231细胞株增殖和侵袭能力的影响及其相关机制北大核心CSCD

目的探讨TET1对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、转移、侵袭等生物学行为的影响,并初步探究其相关分子机制。方法应用慢病毒载体建立TET1过表达稳转细胞株(MDA-MB-231-TET1)及阴性对照组稳转细胞株(MDA-MB-231-NC),Real-time PCR及Western blot法检测TET1的表达情况。CCK-8法、流式细胞术检测细胞的增殖及细胞周期分布,细胞划痕实验及Transwell小室检测细胞迁移及侵袭能力;Western blot及免疫荧光实验检测EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin)分子的表达。结果成功构建过表达TET1细胞株(P=0.03)。相较于阴性对照组和空白对照组细胞,MDA-MB-231-TET1组细胞增殖、迁移及侵袭明显受到抑制(P<0.001),G2/M期细胞周期阻滞(P=0.002);同时,伴随E-cadherin表达升高(P<0.001),N-cadherin(P=0.003)、Vimentin(P=0.041)表达降低,β-catenin(P<0.001)表达降低,并且TET1可抑制β-catenin向细胞核内转移,进而抑制EMT的发生。结论 TET1可抑制MDA-MB-231细胞增殖,并能抑制其迁移及侵袭,其机制可能与通过Wnt/β-catenin通路抑制EMT的发生相关。     

塔斯品碱衍生物TPD7对乳腺癌细胞迁移和侵袭的抑制作用

目的:探讨塔斯品碱衍生物TPD7对乳腺癌细胞MCF-7和ZR-75-30细胞迁移和侵袭的影响,阐明TPD7抑制细胞迁移和侵袭可能的作用机制。方法:采用细胞划痕法、Transwell小室侵袭法检测MCF-7和ZR-75-30细胞的迁移和侵袭。采用Western blot法检测MMP9、β-catenin及c-Myc的蛋白表达。RT-PCR法检测β-catenin及c-Myc的mRNA表达。结果:TPD7对MCF-7细胞和ZR-75-30细胞迁移和侵袭均有显著抑制作用,且下调MMP9、β-catenin、c-Myc的蛋白表达和mRNA表达,呈剂量依赖性。结论:TPD7抑制乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞迁移和侵袭,可能是通过Wnt信号通路抑制上皮-间质转化。     

HAP1对乳腺癌细胞MCF-7生物学特性影响的观察

目的:探讨亨廷顿相关蛋白1(HAP1)基因过表达对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖、体外迁移侵袭和细胞凋亡的影响及其可能机制.方法:通过转染的方法将逆转录病毒pBabe-puro(嘌呤霉素)HAP1质粒和pBabe-puro质粒导入人乳腺癌细胞系MCF-7,用嘌呤霉素筛选稳定表达两质粒的细胞系,荧光定量PCR和蛋白质印迹法鉴定是否成功构建HAP1过表达细胞系;细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)和克隆形成实验检测细胞的生长增殖,Transwell小室法检测细胞的侵袭和迁移,流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果:成功构建稳定表达pBabe-HAP1的MCF-7-pBabe-puro-HAP1细胞模型.CCK-8检测72 h细胞增殖率,MCF-7-pBabe-puro-HAP1为(75.97±6.76)％,明显低于MCF-7-pBabe-puro细胞(93.98±6.63)％(P=0.03)及MCF-7细胞(100.00±0.oo)％,P=0.004;MCF-7-pBabe-puro-HAP1细胞克隆形成率为(22.67±1.26)％,明显低于MCF-7(35.00±0.50)％(P=0.000)和MCF-7-pBabe-puro细胞(33.83±0.76)％,P＝0.000;Transwell小室侵袭和迁移实验表明,MCF-7-pBabe-puro-HAP1组的侵袭(3.33±0.58,P=0.000)和迁移(50.00±3.61,P＜0.01)能力明显降低;流式细胞仪检测细胞凋亡,MCF-7-pBabe-puro-HAP1凋亡率为(8.03±0.15)％,高于MCF-7-pBabe-puro(3.13土0.25)％(P=0.000)和MCF-7细胞(3.33±0.35)％,P=0.000.结论:HAP1基因能够抑制肿瘤细胞增殖和迁移侵袭,并能诱导细胞凋亡,其可能作为一个抑癌基因在肿瘤发生发展中发挥重要作用.     

沉默LncRNA WT1-AS对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭和迁移的影响

目的探讨LncRNA WT1-AS对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭和迁移的影响。方法qRT-PCR检测WT1-AS在三阴性乳腺癌细胞中的表达及基因沉默的效率;Transwell实验检测WT1-AS对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响;划痕实验检测WT1-AS对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响;Western blot检测WT1-AS对MDA-MB-231细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail表达的影响。结果与正常乳腺上皮细胞相比,WT1-AS在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468中的表达量明显上调;沉默WT1-AS后,MDA-MB-231细胞侵袭和迁移能力明显降低,且E-cadherin表达明显上调,N-cadherin、Vimentin和Snail表达量显著下调。结论WT1-AS可以通过调控EMT促进三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭与迁移能力。     

ROR1-AS1调控Notch1信号通路对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡影响

摘 要：［目的］ 研究酪氨酸蛋白激酶跨膜受体 1 反义 RNA 1（tyrosine protein kinase transmembrane receptor 1 antisense RNA 1，ROR1-AS1）调控Notch1信号通路对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影响。［方法］ 实时荧光定量PCR方法检测乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-361细胞和正常乳腺上皮MCF10A细胞中ROR1-AS1表达变化。乳腺癌MCF-7细胞分成对照、sh-NC（转染shRNA 对照）、sh-ROR1-AS1（转染ROR1-AS1 shRNA）、sh-ROR1-AS1+Jagged1组（转染ROR1-AS1 shRNA，Notch1通路激活剂Jagged1处理）。CCK-8实验检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，Transwell小室检测细胞迁移和侵袭，Western blot方法检测细胞中活化的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶9（cleaved cysteinyl aspartate-specific protease-9，C-Caspase-9）、上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）、活化的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶3（cleaved cysteinyl aspartate-specific protease-3，C-Caspase-3）、神经型钙黏蛋白（N-cadherin）、Notch1、Hes1蛋白表达。 ［结果］ 乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-361细胞中ROR1-AS1水平明显高于正常乳腺上皮MCF10A细胞（P<0.05）。与对照组、sh-NC组比较，sh-ROR1-AS1组乳腺癌MCF-7细胞存活率降低(100.00%±9.82%，99.74%±12.05%，58.91%±6.33%)，细胞凋亡率升高(4.81%±0.26%，4.93%±0.34%，20.58%±2.11%），细胞迁移数目( 225.36±12.84个，224.89±19.56个，140.89±13.64个）和侵袭数目(180.47±16.32个，177.54±16.92个，110.44±10.87个)减少，细胞中C-Caspase-9、E-cadherin、C-Caspase-3蛋白表达水平增加，N-cadherin、Notch1、Hes1蛋白表达水平降低（P<0.05）。与sh-ROR1-AS1组比较，sh-ROR1-AS1+Jagged1组乳腺癌MCF-7细胞存活率升高(100.00%±11.58% vs 147.36%±12.05%），细胞凋亡率降低(19.54%±1.74% vs 8.36%±0.75%)，细胞迁移数目(139.58±12.78个 vs 175.26±16.94个)和侵袭数目（107.45±9.35个 vs 162.04±13.67个）均升高，C-Caspase-9、E-cadherin、C-Caspase-3蛋白水平降低，N-cadherin、Notch1、Hes1蛋白水平升高（P<0.05）。［结论］ 下调ROR1-AS1通过抑制Notch1信号减弱乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移、侵袭和EMT能力，激活细胞凋亡。     

M2型TAMs激活NF-κB通路促进结肠癌细胞侵袭转移的实验研究

目的:观察M2型肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)对结肠癌LoVo细胞侵袭转移的影响，探讨其可能的作用机制。方法:建立M2型TAMs与LoVo细胞共培养体系。采用流式细胞术检测M2型TAMs生物标记分子CD163、CD206的表达情况以明确M2型TAMs诱导成功，细胞划痕实验检测M2型TAMs对细胞迁移能力的影响，酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞上清液IL-10、TGF-β1的浓度，蛋白印迹法(Western Blot）检测NF-κB通路及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相关蛋白表达水平，免疫荧光技术检测NF-κB p65及E-cadherin入核情况。结果:流式细胞术检测结果显示，诱导后的TAMs高表达CD163、CD206；划痕实验结果显示，随着M2型TAMs浓度增加，LoVo细胞迁移能力增强(P<0.05)；酶联免疫吸附测定结果显示，随着M2型TAMs浓度增加，细胞上清液中IL-10、TGF-β1的浓度增加(P<0.05)；Western Blot结果表明，M2型TAMs可以明显上调IKKα、IKKβ蛋白表达(P<0.05)，抑制IκBα蛋白表达(P<0.05)，促进EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin及ZEB1的表达，抑制E-cadherin的表达(P<0.05)；免疫荧光结果显示，随着M2型TAMs浓度增加，NF-κB p65入核增多，E-cadherin入核减少。结论:M2型TAMs可以激活NF-κB通路，进而介导EMT发生。     

PAX-6在人乳腺癌中的表达及促进肿瘤转移的机制

目的:研究配对盒基因-6(paired box,Pax-6)在人乳腺癌组织中的表达和临床预后,及PAX-6对乳腺癌细胞MB-231和MCF-7迁移和侵袭的影响及机制。方法:以人正常乳腺上皮、乳腺癌及配对癌旁组织为研究对象;通过实时定量PCR和免疫蛋白印迹实验分析PAX-6在乳腺癌组织、癌旁组织及正常上皮组织中的相对表达;在线数据库分析PAX-6在乳腺癌中表达与预后的相关性;免疫蛋白印迹实验分析PAX-6在乳腺癌细胞系中的相对表达,选取高表达PAX-6基因的乳腺癌MB-231和MCF7细胞进行基因敲除,设定敲除效率高的si-PAX-6(#1)为实验组(P<0.05),si-NC细胞为对照组;Transwell实验分析PAX-6敲除对细胞迁移和侵袭的影响;实时定量PCR和免疫蛋白印迹实验验证PAX-6基因对细胞迁移和侵袭影响的机制。结果:与正常乳腺上皮、配对癌旁组织相比,PAX-6在人乳腺癌组织中表达上调(P<0.001);在线数据发现PAX-6的表达程度与乳腺癌的预后呈负相关,PAX-6基因表达程度越高,患者预后越差(P=0.038);与正常乳腺上皮细胞相比,PAX-6基因在乳腺癌细胞MB231、MCF-7和BT-549中高表达;与对照组相比,实验组si-PAX-6(#1)细胞迁移和侵袭明显受到抑制（P<0.001）;si-PAX-6(#1)敲除后能下调Vimentin、N-cadherin、MMP2、MMP7和MMP9 mRNA和蛋白表达水平,上调E-cadherin mRNA和蛋白表达水平。结论:PAX-6在乳腺癌的发生发展中起着重要的作用,可能作为潜在的癌基因参与乳腺癌的进程。     

乳腺癌组织和细胞中低表达的LZTS2 通过PI3K/AKT信号通路抑制癌细胞增殖、迁移和EMT

[摘要] 目的：探讨亮氨酸拉链肿瘤抑制因子2（leucine zipper tumor suppressor 2, LZTS2）基因在人乳腺癌组织和细胞系中的表达及其对乳腺癌细胞增殖、迁移和EMT的影响及其作用机制。方法：收集2016 年1 月至2016 年12 月开封中心医院乳腺外科收治的50 例女性乳腺癌患者的癌及癌旁组织标本和乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468 以及正常人乳腺上皮细胞株HBL-100,用qPCR 和Western blotting 检测乳腺癌组织和细胞中LZTS2 mRNA和蛋白表达水平。构建pcDNA-LZTS2 真核表达载体并采用脂质体转染MCF-7 细胞,同时转染pcDNA3.1 作为阴性对照。用Western blotting 检测转染48~72 h 后MCF-7 细胞中LZTS2 蛋白表达水平;用MTT法、Transwell 小室法检测LZTS2 过表达对细胞增殖、迁移和侵袭的影响,同时用Western blotting检测细胞中EMT相关蛋白Cyclin D1、波形蛋白、神经钙黏蛋白、上皮钙黏蛋白以及PI3K/AKT信号通路中相关蛋白的表达。结果：人乳腺癌组织中LZTS2 mRNA和蛋白表达水平均明显低于癌旁组织（P<0.05 或P<0.01）;乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231 和MDA-MB-468 细胞中LZTS2 mRNA和蛋白表达水平显著低于乳腺上皮细胞HBL-100（P<0.05 或P<0.01）。与空白对照组和pcDNA3.1组相比,pcDNA-LZTS2 组MCF-7 细胞中LZTS2 蛋白表达水平明显上调（P<0.01）,细胞增殖、迁移和侵袭能力显著受到抑制（P<0.05 或P<0.01）,同时过表达LZTS2 细胞中Cyclin D1、波形蛋白和神经钙黏蛋白表达水平均明显降低（P<0.05 或P<0.01）、上皮钙黏蛋白表达水平明显升高（均P<0.01）,显示LZTS2 过表达通过降低p-PI3K和p-AKT 表达而抑制PI3K/AKT信号通路。结论：LZTS2 在乳腺癌中低表达,过表达LZTS2 能够抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,可能与抑制细胞EMT过程的PI3K/AKT信号通路有关。     

lncBRM对乳腺癌细胞生长的影响及作用机制

目的  探讨Brahma相关长链非编码RNA （long non-coding RNA for association with Brahma，lncBRM）对人乳腺癌细胞系（MCF-7、MDA-MB-453）生长、迁移和侵袭的影响及可能的作用机制。方法 采用RT-PCR实验检测lncBRM在不同乳腺癌细胞（MCF-7、 ZR-75-30、BT474、MDA-MB-231和MDA-MB-453）和正常人乳腺上皮细胞株MCF 10A中的表达；利用siRNA在MCF-7、MDA-MB-453细胞中敲低lncBRM，分别转染si-lncBRM质粒（si-lncBRM组）和空载质粒（si-Ctrl组），采用CCK-8实验检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况，Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移能力，采用Western blot检测迁移相关蛋白E-cadherin和N-cadherin的表达水平，并采用miRDB数据库预测lncBRM靶点。结果 lncBRM在不同乳腺癌细胞中的表达水平均高于正常人乳腺上皮细胞株MCF 10A （P<0.01）。si-Ctrl组比较，敲低lncBRM可抑制MCF-7、MDA-MB-453细胞增殖能力（P<0.05），提高细胞凋亡率（P<0.01），细胞侵袭和迁移细胞数目较少（均P<0.01）；同时E-cadherin表达明显上调，而N-cadherin表达下调（均P<0.01）。miRDB数据库预测发现lncBRM和68个miRNAs存在结合位点，敲低lncBRM导致评分最高的前5个miRNA中的4个（miR-4646-5p、miR-204-3p、miR-204-5p和miR-6832-3p）表达上调。结论 lncBRM可能通过调控miRNAs的表达而抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移并诱导其凋亡。     

乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADM的上皮间质化现象及机制

目的:建立乳腺癌阿霉素耐药细胞株,命名为MCF-7/ADM,探讨耐药细胞的上皮间质化(EMT)现象及机制,为耐药乳腺癌的治疗奠定基础.方法:中等浓度间歇法建立乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADM.采用MTT和Transwell实验分别检测耐药对细胞增殖、迁移与转移能力的影响;荧光定量PCR检测MCF-7/ADM细胞EMT相关分子标志物E-钙黏蛋白及间质细胞分子标记N-钙黏蛋白、波形蛋白、纤维连接蛋白等的表达.ELISA检测TGF-β的表达,Western blot检测TGF-β及Smad2/3在蛋白水平的表达.结果:乳腺癌阿霉素耐药细胞MCF-7/ADM的耐药指数为32.2,对5-氟脲嘧啶、顺铂、环磷酰胺产生交叉耐药性.与MCF-7细胞相比,MCF-7/ADM细胞迁移和转移能力明显增强,E-cadherin表达降低而N-cadher-in表达显著增高,细胞上清中TGF-β1表达增加,细胞内TGF-β及磷酸化Smad2/3在蛋白水平表达升高.结论:乳腺癌阿霉素耐药细胞MCF-7/ADM发生EMT现象,可能与经典TGF-β通路激活有关.     

过表达TRAIL的间充质干细胞对肺癌A549细胞系生物学功能的影响

目的:探究过表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）对肺癌A549细胞系生物学功能的影响。方法:通过慢病毒载体携带TRAIL感染小鼠BMSCs,构建过表达TRAIL的小鼠BMSCs,RT-PCR法检测BMSCs中TRAIL基因表达。根据是否感染TRAIL基因,将细胞分为BMSCs组、NC-BMSCs组和TRAIL-BMSCs组,收集各组BMSCs的培养基,作为A549细胞条件培养基。根据条件培养基的不同,将A549细胞分为A549组、A549-BMSCs组、A549-NC-BMSCs组和A549-TRAIL-BMSCs组。MTT、Transwell和平板克隆形成实验检测各组A549细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆能力,Western blot法检测细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达情况。结果:RT-PCR法检测结果显示,与BMSCs组比较,TRAIL-BMSCs组细胞中TRAIL mRNA的表达水平显著升高,过表达TRAIL小鼠BMSCs构建成功。MTT、Transwell和平板克隆形成实验检测结果显示,与A549组比较,A549-BMSCs组和A549-NC-BMSCs组细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆能力显著增加,而A549-TRAIL-BMSCs组细胞在不同时间点的增殖能力显著降低,发生侵袭、迁移的细胞数量和克隆形成数量均显著降低;Western blot法检测结果显示,A549组、A549-BMSCs组、A549-NC-BMSCs组和A549-TRAIL-BMSCs组A549细胞中E-cadherin的表达水平分别为（0.45±0.03）、（0.23±0.03）、（0.25±0.02）、（0.95±0.09）;N-cadherin的表达水平分别为（0.57±0.07）、（0.97±0.08）、（0.99±0.12）、（0.19±0.03）;Vimentin的表达水平分别为（0.52±0.05）、（1.02±0.09）、（0.99±0.11）、（0.20±0.02）,与A549组比较,A549-BMSCs组和A549-NC-BMSCs组细胞中E-cadherin的表达水平显著降低,N-cadherin和Vimentin的表达水平显著增加,A549-TRAIL-BMSCs组细胞中E-cadherin的表达水平显著增加,N-cadherin和Vimentin的表达水平显著降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论:BMSCs可促进A549细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆和EMT转化,BMSCs过表达TRAIL基因则对A549细胞的生物学功能具有明显抑制作用。     

Foxm1对非小细胞肺癌细胞迁移、浸润的影响

目的：探讨Foxm1在非小细胞肺癌细胞EMT过程中的作用进而研究其对非小细胞肺癌细胞迁移和浸润能力的影响.方法：采用Western blot和RT-PCR技术检测不同非小细胞肺癌细胞系中Foxm1和EMT相关因子的表达水平.小RNA转染技术干扰H1299细胞中Foxm1的表达.Transwell试验观察Foxm1对非小细胞肺癌细胞迁移浸润能力的影响.结果：Foxm1在四种非小细胞肺癌细胞中均有表达,且H1299表达量相对较高,H1650表达量相对较低.分别以上述两种细胞为试验对象,结果显示Foxm1的表达与EMT相关分子E-cadherin、Vimentin的表达呈明显相关性.CCK-8结果显示：Foxm1抑制剂Thiostrepton处理72h后对H1299、H1650的IC50值分别为1.21μmol/L和3.08μmol/L.Thiostrepton处理和干扰后,Foxm1和Vimentin的表达量明显下降.Transwell小室迁移试验24h后,空白组、阴性对照组和干扰组穿膜细胞数分别为42.6±6.9,36.3 ±4.2,4.6±1.1;侵袭试验24h后,空白组、阴性对照组和干扰组穿膜细胞数分别为12.3 ±3.4,10.0 ±1.4,3.1 ±2.6.结论：Foxm1在非小细胞肺癌细胞中可能通过调节EMT进程来促进肿瘤细胞的迁移和浸润能力.     

siRNA沉默LOX基因对鼻咽癌细胞侵袭及迁移能力的影响

目的:探讨RNAi干扰赖氨酰氧化酶基因(LOX)后对鼻咽癌细胞5-8F侵袭及迁移能力的影响。方法:设计并构建针对LOX基因的RNAi片段,脂质体介导siRNA-LOX-01（siRNA-LOX-01 组）和siRNA-LOX-02（siRNA-LOX-02组）转染5-8F细胞,同时设非特异性干扰片段为对照组。应用实时荧光定量PCR、免疫印迹试验检测转染后各组LOX的mRNA和蛋白表达及上皮间质转化（EMT）相关指标E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、MMP9 等的表达变化;细胞黏附实验、基底膜侵袭实验和细胞划痕实验分别研究LOX基因沉默后对5-8F细胞侵袭及迁移能力的影响。结果:与对照组相比,siRNA-LOX-01组和siRNA-LOX-02组LOX表达在mRNA 及蛋白水平下降,细胞的迁移速率变慢,穿膜细胞数减少,细胞黏附率增加(均P<0.05),E-cadherin的表达增加,N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug及MMP9的表达减少。结论:干扰LOX能明显抑制鼻咽癌细胞的侵袭及迁移能力,作用机制可能与N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug及MMP9蛋白表达下调有关,LOX有望成为治疗鼻咽癌的有效靶点。     

癌源性外泌体对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响

目的 探究乳腺癌细胞来源的外泌体对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响。方法 使用超速离心法对人乳腺癌MCF-7细胞培养液中的外泌体进行提取和纯化,通过透射电子显微镜观察外泌体的形态和大小,Western blot实验鉴定外泌体的标志蛋白。以外泌体与MCF-7细胞共培养48 h后的细胞为实验组,以未处理的MCF-7细胞为对照组。用MTT法、克隆形成实验、细胞划痕实验、细胞侵袭实验、流式细胞术实验和Western blot实验检测乳腺癌源性外泌体对MCF-7细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、凋亡及上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)能力的影响。结果 透射电子显微镜下外泌体的形状为典型的杯托状或者凹的半球状结构,直径40~110 nm;Western blot实验结果显示外泌体标志性蛋白CD9及CD81均明显表达;MTT和克隆形成实验结果显示,实验组细胞增殖及克隆形成能力较对照组明显增强(P＜0.05);划痕实验和侵袭实验结果显示,与对照组相比,实验组细胞迁移及侵袭能力明显增强(P＜0.001);流式细胞术分析显示,在外泌体刺激的乳腺癌细胞中,凋亡细胞的百分比显著低于对照组(P＜0.05);Western blot结果显示,乳腺癌来源的外泌体增加了N-cadherin和Vimentin的表达,降低了E-cadherin表达,促进了乳腺癌EMT过程(P＜0.05)。结论 乳腺癌细胞来源的外泌体能增强肿瘤细胞的细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力,促进乳腺癌EMT过程,并抑制肿瘤细胞凋亡。表明肿瘤来源外泌体可能作为细胞间信号转导的介质,在促进肿瘤生长和转移的信息传递方面发挥重要作用。     

siＲNA 介导的eIF3b基因沉默抑制乳腺癌细胞MCF-7的侵袭和迁移

目的:探讨siＲNA介导的eIF3b基因沉默对乳腺癌细胞MCF-7侵袭和迁移能力的影响。方法:设计eIF3b基因的小分子干扰RNA(siRNA)片段,脂质体介导转染入乳腺癌细胞株MCF-7,转染分3个组:I组(空白对照组)、II组(转染非特异性对照组)和III组（转染eIF3b-siRNA组）。应用qＲT-PCＲ和Western blotting免疫印迹法检测转染前后eIF3b基因mＲNA和蛋白表达水平;运用Matrigel 胶模型细胞迁移和侵袭实验检测MCF-7细胞迁移和侵袭能力的变化。结果:与I组（1.09±0.19）、II组（1.05±0.17）相比,III组eIF3b 蛋白表达水平（0.45±0.06）明显下降,差异具有统计学意义(P＜0.05),I组和II组eIF3b蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。III组eIF3b mRNA相对表达水平为0.54±0.08,明显低于I组(1.12±0.16)和II组(1.08±0.18),差异有统计学意义（P＜0.05）,I组和II组eIF3b mRNA表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。细胞迁移实验中,III组细胞明显少于I组和II组(P＜0.05);细胞侵袭实验中,III组穿过人工基底膜的细胞明显少于I组和II组(P＜0.05)。结论:下调eIF3b表达可明显抑制乳腺癌细胞侵袭和迁移。