中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白对大鼠肾脏缺血再灌注损伤肾小管上皮细胞的保护作用

目的 探讨中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)对大鼠缺血再灌注损伤肾脏肾小管上皮细胞凋亡的保护作用及机制.方法 建立大鼠肾脏缺血再灌注模型,雄性SD大鼠随机分为对照组、缺血再灌注模型组、NGAL组 ;HE染色观察3组大鼠肾组织病理变化 ;TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡 ;实时定量PCR、Western印迹法检测凋亡蛋白fas、bcl-2的表达变化.结果 与缺血再灌注模型组比较,NGAL组肾小管上皮细胞凋亡数量显著减少[(8.6±3.4)/HP比(20.8±3.7)/HP,P＜0.05] ;NGAL组肾组织fas mRNA(2.34±0.51比6.84±2.34,P＜0.05)、fas蛋白(0.65±0.05比0.95±0.08,P＜0.05)表达显著下调,bcl-2蛋白(0.33±0.05比0.24±0.03,P＜0.05)表达显著上调,但bcl-2 mRNA表达无明显改变.结论 NGAL对大鼠缺血再灌注损伤肾小管上皮细胞有保护作用,其作用可能与减少细胞凋亡、改变凋亡蛋白的表达有关.     

神经生长因子对大鼠脊髓损伤后神经元凋亡的影响

目的探讨神经生长因子(NGF)对脊髓损伤保护作用的分子机制.方法采用Allen's法以25 gcm力致伤大鼠T8脊髓,经蛛网膜下腔导管于术后即刻、2、4、8、12、24 h各注入NGF溶液,并与生理盐水组(NS组)和正常对照组作对照,采用免疫组织化学方法和末端单位标记法(TUNEL)原位末端标记法分别检测bcl-2、bax蛋白在脊髓神经元的表达及神经元凋亡情况.结果正常组中脊髓灰质bax蛋白阳性细胞吸光度(A)值为34.51±4.47,NS组中bax蛋白表达增加,以2 h及12 h最为显著,而NGF组与NS组相比,bax蛋白表达明显减少(P＜0.01).正常组中脊髓灰质bcl-2蛋白表达的A值为19.72±2.92,NS组中bcl-2表达下降,而NGF组与NS组相比较,bcl-2蛋白表达明显增多(P＜0.01).TUNEL检测结果显示,正常对照组中未见神经元凋亡,NS组中自2 h后可见神经元凋亡,NGF组与NS组相比,神经元凋亡指数明显减少(P＜0.01).结论NGF能通过抑制bax蛋白的表达,促进bcl-2表达抑制脊髓损伤后神经元凋亡,从而保护损伤的脊髓组织,这可能是NGF对脊髓损伤具有保护作用的机制之一.     

脊髓损伤后促红细胞生成素对bcl-2的影响

目的 探讨促红细胞生成素（EPO）对大鼠脊髓损伤后伤区脊髓细胞凋亡和神经功能恢复的影响。方法 Wistar大鼠210只，随机分为4组：假手术组、脊髓损伤组、脊髓损伤加重组人EPO治疗组、脊髓损伤加生理盐水治疗组。采用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记（TUNEL标记法）检测神经元和少突胶质细胞凋亡，Western blot免疫印迹法和免疫组化染色检测bcl-2表达，免疫组化染色和图像分析方法观察对白质内神经纤维（NF-200染色）的保护作用，通过感觉诱发电位（SSEP）、运动诱发电位（MEP）和大鼠BBB后肢运动功能评分，观察损伤脊髓传导功能的恢复。结果 EPO保护组bcl-2在各时相点的表达明显增高，8h和7d时神经元和少突胶质细胞的TUNEL阳性细胞数明显减少；在7d时白质中NF-200阳性神经纤维明显增多；SSEP和MEP的平均潜伏期和波幅以及BBB功能评分明显提高，与损伤组和生理盐水治疗相比，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 EPO通过上调bcl-2的表达，在抑制脊髓损伤后神经元和少突胶质细胞的凋亡中起到神经保护作用。     

保达新对缺血再灌注损伤大鼠心肌的影响

目的 观察保达新对缺血再灌注损伤心肌的保护作用.方法 将24只左冠状动脉前降支(LAD)结扎大鼠分成3组(假手术组、对照组、治疗组),分别在心肌缺血30 min后再灌注60min,复灌前5 min静脉注射0. 9%生理盐水0.25 ml/kg;或保达新0 .5 μg/kg,检测血液中乳酸脱氢酶(LDH)、血浆丙二醛(MDA)、白细胞介素(IL)-6及IL-8的差异和各组间bcl-2、bax蛋白表达的差异.结果 对照组与其他两组比较LDH、MDA、IL-6及IL-8明显增加(P＜0.05),治疗组中LDH、MDA、IL-6及IL-8较空白组明显增加(P＜0.05).对照组与假手术组比较bcl-2、bax蛋白表达明显增加(P＜0.05),治疗组中bcl-2表达较其他两组明显增加(P＜0.05),bax表达较对照组明显减少(P＜0.05).结论 保达新可通过减少脂质过氧化物产生、减轻过氧化反应,抑制细胞凋亡来保护缺血再灌注损伤的心肌.     

EPO硬膜外途径干预大鼠脊髓损伤后caspase-3及FasL表达与细胞凋亡的相关性研究

[目的]在大鼠急性脊髓损伤后不同时间硬膜外腔注射促红细胞生成素,观察并探讨其对脊髓神经功能的保护作用以及对脊髓神经细胞凋亡的影响.[方法]将48只体重(270±10)g成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为正常组(n=6),假手术组(仅切除椎板,n=6),对照组(1、6、24 h组分别给与等量生理盐水硬膜外注射.n=18),实验组(1、6、24 h组分别给与5 000 u/kg-bw的rhEPO硬膜外注射,n=18).按改良Allen打击法建立大鼠脊髓不完全损伤模型,通过动物神经运动功能BBB评分及斜板试验评价神经损伤程度;分别采用TUNEL法及免疫组化法检测脊髓神经细胞凋亡指数和Caspase-3,fas-fasl死亡蛋白的表达.光镜下观察统计分析结果.[结果]与对照组相比,脊髓损伤后促红细胞生成素1、6、24 h干预的实验组神经运动功能均有改善,脊髓神经细胞凋亡指数均明显下降(P＜0.01);实验组中,fas-fasl死亡蛋白较对照组表达减少.2组中神经细胞凋亡数与Caspase-3、fas-fasl死亡蛋白表达细胞数呈线性正相关(P＜0.01),相关系数分别为r=0.941(Caspase-3)和r=0.929(fas-fasl).[结论]早期应用外源性EPO对脊髓不完全损伤具有保护作用,可明显改善神经运动功能恢复情况,此种保护作用可能与EPO能够阻断Caspase-3、fas-fasl死亡蛋白途径的神经细胞凋亡有关.     

急性胰腺炎大鼠肾上腺损伤中bax与bcl-2表达的研究

目的 观察急性胰腺炎(AP)大鼠肾上腺损伤时细胞凋亡及调控基因bcl-2和bax蛋白的表达及作用.方法 采用牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射法建立AP模型.术后3、6、12 h检测血皮质酮水平,观察肾上腺病理,TUNEL检测细胞凋亡,免疫组织化学检测bcl-2和bax蛋白表达.结果 与SO组比较,AP3 h组血清皮质酮显著增高,随后逐渐降低(P＜0.05).随病程延长,肾上腺细胞凋亡指数增高,bax蛋白表达增强,bax/bcl-2比值亦逐渐升高(P值均＜0.05),并与凋亡指数(AI)呈正相关(r =0.759,P＜0.05).结论 bax和bcl-2可能参与了AP肾上腺损伤的发病过程.通过激活bcl-2和抑制bax的蛋白表达,减少细胞凋亡发生从而保护肾上腺结构和功能,可能为今后AP及相关肾上腺损伤的药物及基因治疗提供依据和新思路.     

髓鞘相关蛋白抗体对大鼠脊髓损伤早期bcl-2与bax表达的影响

目的 探讨髓鞘相关蛋白(Nogo-A)抗体应用于脊髓损伤动物模型中对bcl-2与bax表达的影响.方法 建立大鼠急性脊髓损伤实验动物模型.180只大鼠随机分成对照组、损伤组和损伤后Nogo-A抗体治疗组,每组各60只.不同时间点损伤节段脊髓取材,分别行苏木素-伊红(HE)染色、免疫组织化学法检测bcl-2、bax表达并进行定量分析.结果 HE染色后光镜下观察:损伤后治疗组出血、小胶质细胞增生和炎细胞浸润均较损伤组轻.bcl-2、bax在损伤组和治疗组表达呈现动态变化,损伤后24 h bcl-2表达达高峰(3组分别为0.1004±0.0091、0.1890±0.0100、0.2456±0.0179,F=197.541,P＜0.01);损伤后8 h bax表达达高峰(3组分别为0.1084±0.0041、0.3440±0.0070、0.2472±0.0071,F=1856.199,P＜0.01);3组各时间点的图像分析结果 经单因素方差分析,差异有统计学意义(P＜0.05),治疗组和损伤组比较,bcl-2表达增强而bax表达减弱.结论 Nogo-A抗体治疗脊髓损伤能抑制bax表达,促进bcl-2表达,减轻脊髓继发性损伤.     

灯盏细辛对大鼠肾冷缺血再灌注损伤中细胞凋亡的影响

目的 观察中药灯盏细辛对大鼠肾脏冷缺血再灌注损伤(IRI)中肾脏细胞凋亡及相关基因表达的影响.方法 封闭群SD大鼠36只,随机分为3组,每组12只.假手术组(A组),对照组(B组),实验组(C组).药物应用:C组术前15 min,灯盏细辛注射液按1.2 ml/100 g通过尾静脉注射,A、B组按相应剂量注射生理盐水.动物手术:A组,切除右肾.B、C组采用的是冷IRI模型,3组大鼠均在术后24h再次手术切除左肾进行检测.透射电镜检查肾组织形态学,免疫组织化学检测凋亡相关的基因bcl-2与bax的表达,原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡.结果 (1)超微结构检查(透射电镜):A组结构正常;B组细胞呈损伤形态:线粒体肿胀,微绒毛减少,胞质内空泡形成,部分细胞核可见凋亡迹象.C组病变较B组显著减轻.(2)免疫组织化学蛋白阳性染色指数(PI):缺血再灌注后B、C组的bcl-2表达分别为(21.21±1.18)％和(35.52±1.94)％,较A组(4.95±0.77)％均增多(P＜0.05),B组低于C组(P＜0.05).B、C组的bax表达分别为(58.55±2.90)％和(45.90±3.14)％,较A组(4.67±0.67)％增多(P＜0.05),而且B组高于C组(P＜0.05).A组的蛋白阳性染色指数的比值bcl-2/bax为(1.06±0.07)高于B组(0.35±0.03)和C组(0.78±0.07,P＜0.05),而且C组高于B组(P＜0.05).(3)细胞凋亡检测(TUNEL):细胞凋亡指数B组(28.57±3.58)％和C组(19.99±3.37)％均显著大于A组(2.33±0.42)％(P＜0.01),C 组小于B组(P＜0.01).结论 灯盏细辛减少大鼠肾脏冷IRI诱导的肾脏细胞的凋亡,与调节凋亡相关基因bcl-2与bax表达有关.     

促红细胞生成素在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的表达及其意义

目的:观察促红细胞生成素(EPO)在大鼠脊髓缺血再灌注损伤(SCII)中的表达和重组人促红细胞生成素(rhuEPO)预处理对再灌注损伤脊髓神经细胞的作用。方法:将W ister大鼠分为正常组、假手术组、rhuEPO处理组和生理盐水对照组;rhuEPO处理组和生理盐水对照组于术前3h腹腔注射rhuEPO和生理盐水,制备大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型。以免疫组化和W estern blot法检测脊髓组织中EPO的表达变化;以原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记法(TUNEL法)检测细胞的凋亡情况。结果:EPO在无损伤脊髓中即有少量的表达,SCII后8h表达显著上调,于12、24h(12h与24h组比较差异无显著性意义,P>0.05)达高峰,伤后3d表达逐渐下调,5d仍保持较高水平。rhuEPO处理组SCII后8h、12h及24h时神经细胞凋亡水平明显低于生理盐水对照组,差异有显著性意义(P<0.01)。结论:在脊髓缺血再灌注损伤中EPO呈现时序性表达变化,可能是机体内源性神经保护的机制之一;EPO预处理能明显抑制SCII后神经细胞的凋亡。     

大鼠脊髓缺血再灌注损伤后CaMKII的表达及作用研究

[目的]探讨钙调蛋白依赖性蛋白激酶2(Ca MKII)在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中作用。[方法]雄性SD大鼠56只,随机分为假手术组(n=8)、实验组(n=48),假手术组暴露肾动脉下腹主动脉,但不阻断,实验组采用Naslund腹主动脉阻断法制作脊髓缺血再灌注损伤模型,于再灌注后0、1、3、7、14、28 d取脊髓标本,HE染色观察脊髓病理变化,免疫组化和Westewrn blot检测Ca MKII的表达情况,TUNEL染色检测神经细胞凋亡。[结果]实验组脊髓组织出现明显病理学改变。Western blot在56KD分子量处可见Ca MKII蛋白特异性条带,假手术组Ca MKII表达较少,实验组0 d即出现Ca MKII表达增多,且随着时间延长表达量逐渐增多,于3 d达高峰后逐渐降低,至14 d时仍高于假手术组(P0.01)。免疫组化结果显示,Ca MKII蛋白主要表达于脊髓神经元胞浆,Ca MKII阳性细胞数的变化趋势与免疫组化结果相似。TUNEL染色示假手术组有少量凋亡细胞散在分布,实验组术后0 d开始出现凋亡细胞增多,3 d达高峰,后逐渐减少,28 d时仍高于假手术组(P0.05)。[结论]脊髓缺血再灌注损伤后Ca MKII表达增加,同时细胞凋亡数增多,Ca MKII可能通过调节细胞凋亡来影响脊髓缺血再灌注损伤。     

Effect of nerve growth factor on neuronal apoptosis after spinal cord injury in rats

OBJECTIVE: To explore the molecular mechanism of the protective effect of nerve growth factor (NGF) on injured spinal cord. METHODS: The posterior T(8) (the 8th thoracic segment) spinal cords of 60 Wistar rats were injured by impacts caused by objects (weighing 10 g) falling from a height of 2.5 cm with Allen's way. Solution with nerve growth factors (NGF) was given to 30 rats (the NGF group) through a microtubule inserted into the subarachnoid cavity immediately, and at 2, 4, 8, 12 and 24 hours after spinal cord injury (SCI) respectively. Normal saline (NS) with same volume was given to the other 30 rats (the NS group) with the same method. And 5 normal rats were taken as the normal controls. The expression of bcl-2 and bax proteins in spinal cord was detected with immunohistochemistry. The apoptotic neurons in spinal cord were measured with terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling of DNA fragments (TUNEL) staining. RESULTS: The positive expression of bcl-2 protein was strong in the normal controls, but decreased in the NS group, and increased significantly in the NGF group as compared with that of the NS group (P<0.01). The positive expression of bax protein was also strong in the normal controls, but increased in the NS group, and decreased significantly in the NGF group as compared with that of the NS group (P<0.01). Apoptotic neurons were found in the NS group, and they decreased significantly in the NGF group as compared with that of the NS group (P<0.01). CONCLUSIONS: NGF can protect the injured nerve tissues through stimulating the expression of bcl-2 protein, inhibiting the expression of bax protein and inhibiting the neuronal apoptosis after SCI.     

大鼠牵张性脊髓损伤后细胞凋亡及相关基因表达的实验研究

目的观察大鼠牵张性脊髓损伤后细胞凋亡现象,检测脊髓损伤后凋亡相关基因的表达。方法大鼠脊髓T13～L2经牵张损伤,皮层体感诱发电位(CSEP)监测P1N1波幅下降至术前波幅70%后,分别于术后30min、6h、1、4、7、14、21d处死大鼠,取材(n=4)。应用流式细胞仪、原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记(TUNEL)技术观察脊髓细胞凋亡情况,用免疫组化检测p53、bax和bcl2的表达。结果流式细胞仪及TUNEL法检测显示,损伤组术后6h凋亡细胞开始增多,术后7d细胞凋亡率达高峰,随后开始回落,持续21d,与空白对照组及椎板切除组比较,差异有显著性意义(P<005,001)。TUNEL法染色显示,白质中出现大量胶质细胞凋亡。免疫组化染色显示损伤组术后6h开始,p53、bax和bcl2阳性表达开始增多,p53阳性细胞数术后4d达高峰,bax和bcl2术后7d达高峰,损伤组各时相点的阳性表达与空白对照组与椎板切除组比较差异有显著性意义(P<005,001)。结论牵张性脊髓损伤后存在细胞凋亡现象,从形态上看包括神经元和胶质细胞凋亡,细胞凋亡是牵张性脊髓损伤继发损害中细胞死亡的一种重要形式,也是继发损伤期的重要病理变化。凋亡相关基因p53、bax大量表达,可能在脊髓细胞凋亡过程中起重要作用。     

重组人红细胞生成素治疗脊髓冲击性损伤的实验研究

[目的]研究重组人红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rh-EPO)对脊髓冲击性损伤的治疗效果。[方法]24只新西兰白兔采用重物坠落的方法造成脊髓冲击性损伤。损伤12 h后,对照组静脉给予生理盐水;小剂量组、中等剂量组和大剂量组分别静脉给予rh-EPO 100、500、1000 IU/kg。损伤后24 h、48 h、1周评估下肢神经功能。损伤后1周时处死动物,脊髓标本进行HE和Caspase-3组化染色,电子显微镜评估超微结构损伤。[结果]EPO治疗组的神经功能评分明显高于对照组,HE染色和电子显微镜显示组织和超微结构损伤明显轻于对照组,Caspase-3阳性细胞数明显少于对照组。中等剂量组和大剂量组的治疗效果无显著性差异。[结论]脊髓冲击性损伤后12 h给予人红细胞生成素可减轻脊髓的组织和超微结构继发性损伤,并可对抗神经细胞凋亡,促进脊髓功能恢复。中等剂量EPO是治疗脊髓损伤的适当选择。     

Effects of nerve growth factor on neuronal nitric oxide production after spinal cord injury in rats

OBJECTIVE: To explore the protective effects of nerve growth factor (NGF) on injured spinal cord. METHODS: The spinal cord injury (SCI) model of Wistar rats was established by a 10 gx2.5 cm impact force on the T(8) spinal cord. NGF (60 microg/20 microl) was given to the rats of the treatment group immediately and at 2, 4, 8, 12, 24 hours after SCI. The level of neuronal constitutive nitric oxide synthase (ncNOS) and the expression of ncNOS mRNA in the spinal cord were detected by the immunohistochemistry assay and in situ hybridization method. RESULTS: Abnormal expression of ncNOS was detected in the spinal ventral horn motorneuron in injured rats. The levels of ncNOS protein in the NGF group were significantly lower than those in the normal saline group (P<0.05 ). The ncNOS mRNA expression was found in the spinal ventral horn motorneuron in injured rats and the expression in the NGF group was significantly decreased compared with that in the normal saline group (P<0.01). CONCLUSIONS: NGF can protect the injured tissue of the spinal cord by prohibiting abnormal expression of nitric oxide synthase and the neurotoxicity of nitric oxide.     

重复高压氧预处理对大鼠脊髓缺血再灌注时低氧诱导因子-1α及促红细胞生成素表达的影响

目的 探讨重复高压氧预处理对大鼠脊髓缺血再灌注时低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和促红细胞生成素(EPO)表达的影响.方法 雄性SD大鼠48只,体重250～300g,采用随机数字表法,将其随机分为3组(n=16):假手术组(S组)、脊髓缺血再灌注组(I/R组)和重复高压氧预处理(HOP组).HOP组实施高压氧预处理,参数为:氧浓度＞98%,氧含量1000ml/L,压力2.5 ATA,1 h/d,连续5 d,最后1 d处理后24 h,I/R组和HOP组采用夹闭腹主动脉20min再开放的方法制备脊髓缺血再灌注模型.再灌注48h时评价后肢运动功能,然后处死大鼠,取L5-7节段脊髓组织,测定HIF-1α、EPO的mRNA及其蛋白表达水平,光镜下观察病理学结果.结果 与S组比较,I/R组和HOP组后肢运动功能和脊髓前角正常运动神经元计数降低,脊髓组织HIF-1α、EPO的mRNA及其蛋白表达水平上调(P＜0.05);与I/R组比较,HOP组后肢运动功能和脊髓前角正常运动神经元计数升高,脊髓组织HIF-1α及EPO的mRNA及其蛋白表达水平上调(P＜0.05).HOP组脊髓组织病理学损伤程度轻于I/R 组.结论 重复高压氧预处理可上调HIF-1α及EPO表达,从而减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤.

Abstract：

Objective To investigate the effect of repeated hyperbaric oxygen preconditioning (HOP) on the expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1a) and erythropoietin (EPO) following spinal ischemiareperfusion (I/R) in rats. Methods Forty-eight male SD rats weighing 250-300 g were randomly divided into 3 groups (n = 16 each): sham operation group (S group); I/R group and repeated HOP group (HOP group). The animals in HOP group were pretreated with O2 ( ＞ 98 % ) at 2.5 ATA I h/d for 5 consecutive days at 24 h before spinal cord I/R. The animals were anesthetized with intraperitoneal pentobarbital sodium 35 mg/kg. Spinal cord ischemia was produced by cross-clamping of abdominal aorta distal to renal artery for 20 min in I/R and HOP groups. Hind-limb motor function was assessed and scored st 48 h of reperfusion. The animals were then sacrificed and the L5-7 segment of the spinal cord was removed for determination of the expression of HIF-1 α and EPO mRNA and protein and microscopic examination. Results Compared with group S, the hind-limb motor function scores and the number of normal motor neurons in the anterior horn of the spinal cord were significantly decreased, and the expression of HIF-1α and EPO mRNA and protein was up-regulated in I/R and HOP groups ( P ＜ 0.05). Compared with group I/R, the hind-limb motor function scores and the number of normal motor neurons in the anterior horn of the spinal cord were significantly increased, and the expression of HIF-1α and EPO mRNA and protein was up-regulated in group HOP ( P ＜ 0.05). The spinal cord injury was attenuated in group HOP compared with group I/R. Conclusion Repeated HOP can reduce the spinal cord I/R injury though up-regulating the expression of HIF1α and EPO in rats.     

大剂量甲基强的松龙对大鼠慢性压迫性脊髓损伤后神经细胞凋亡影响的实验研究

目的:观察大剂量甲基强的松龙对大鼠慢性压迫性脊髓损伤后神经细胞凋亡及神经功能恢复的影响。方法:将60只同龄Wistar大鼠,置入后路渐进式压迫装置,制作成中度慢性压迫性脊髓损伤模型。随机分为大剂量甲基强的松龙治疗组(A组,30只)和单纯慢性压迫性脊髓损伤组(B组,30只)。应用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记(TUNEL)技术,分别于慢性压迫性脊髓损伤后1、3、7、14、28d对脊髓损伤区进行细胞凋亡检测。结果:A、B两组均发现细胞凋亡,两组细胞凋亡率比较,差异有显著性(P<0.01和0.05)。治疗组细胞凋亡的减少与神经功能的恢复相一致。结论:慢性压迫性脊髓损伤可导致细胞凋亡,大剂量甲基强的松龙对神经细胞凋亡可起到抑制作用。