穿孔素在隐球菌性脑膜炎患者外周血单个核细胞的表达及临床意义

目的 研究隐球菌性脑膜炎(cryptococcal meningitis)患者外周血单个核细胞中穿孔素(perforin,又称pore-form-ing protein,PFP)表达及其与细胞因子的关系.方法 首先用密度梯度离心法分离得到25例隐球菌性脑膜炎患者和30例健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),其次用免疫印迹(western blot)的方法检测其中的PFP的蛋白含量,用实时荧光定量(RFQ)-PCR方法测定其中PFP的mRNA含量,并分析隐球菌性脑膜炎患者蛋白含量与细胞因子浓度的相关性.结果 与健康对照组比较,隐球菌性脑膜炎患者PBMC中PFP蛋白含量和mRNA均明显降低,PFP蛋白表达水平与IL-10,IFN-γ水平均无相关性.结论 PFP可能参与隐球菌性脑膜炎的疾病进程,这为探讨隐球菌性脑膜炎的病情监控和有效治疗提供了新的线索.     

原发性胆汁性肝硬化患者三种免疫效应分子的表达及临床意义

目的研究颗粒溶素（granulysin，GNLY）、颗粒酶B（granzymeB，GrB）及穿孔素（perforin，PF）三种免疫效应分子在原发性胆汁性肝硬化（primarybiliarycirrhosis，PBC）外周血中的表达并探讨其与PBC的关系。方法以正常健康人和肝炎后肝硬化患者为对照，用实时荧光定量RT—PCR方法检测PBC患者PBMC中GNLY、GrB及PFmRNA的含量。用ELISA方法检测PBC患者血清中GNLY表达情况并分析其与肝功能的相关性。结果PBC组GNLY、GrBmRNA平均拷贝数显著高于健康对照组（P〈0．01）和疾病对照肝炎后肝硬化组（P〈0．001），而PFmRNA与对照组相比差异无统计学意义。PBC患者血清中的GNLY蛋白表达显著高于健康对照组（P〈0．01）和乙型肝炎后肝硬化组（P〈0．01）。血清中GNLY浓度与血清GGT、AIJP的浓度呈正相关（P〈0．01）。结论PBC患者GNLY、GrBmRNA和含量显著高于对照组，同时ELISA方法检测出PBC患者血清中GNLY蛋白含量显著高于对照组，GNLY、GrB表达与PBC的发病存在一定的关联性，为临床PBC病情的监控提供可靠依据。     

TRAIL及其受体与隐球菌性脑膜炎的关联性研究

目的研究建立实时荧光定量（RFQ）-PCR法测定TRAIL及其受体DeR1、DcR2、DR4、DR5 mRNA含量的方法，探讨其在隐球菌性脑膜炎患者外周血单个核细胞中表达的检测价值，并分析隐球菌性脑膜炎患者细胞因子与TRAIL及其受体的相关性。方法设计特异性的引物和探针，以人基因GAPDH为内参照，用实时定量PCR的方法检测35例健康人和35例隐球菌性脑膜炎患者外周血单个核细胞中TRAIL及其受体mRNA的表达水平，采用ELISA方法检测血清IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ浓度。结果与健康人比较，隐球菌性脑膜炎患者外周血单个核细胞中TRAIL mRNA的表达明显下降（P〈0．01）；受体DeR1 mRNA的表达显著升高（P〈0．01），受体DeR2、DR4、DR5 mRNA的变化无统计学意义。隐脑患者血清中IL-10显著升高（P〈0．01），与TRAIL的变化成负相关；IFN-γ显著下降（P〈0．01），与TRAIL的变化成正相关。结论隐球菌性脑膜炎患者TRAIL下降及其受体DeR1mRNA的表达明显升高，提示TRAIL及其受体DeR1可能参与隐球菌性脑膜炎的疾病进程，这为有效治疗隐球菌性脑膜炎提供了新的线索。     

急性乙型肝炎患者外周血单个核细胞颗粒溶素mRNA定量测定及临床意义

目的应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测乙型肝炎（简称乙肝）患者外周血单个核细胞（PBMC）中颗粒溶素（GNLY）mRNA的表达,探讨GNLY基因表达水平与急性乙肝的关系。方法实时荧光定量RT-PCR分别检测40例急性乙肝患者及100名正常对照的PBMC的GNLY基因表达水平,同时检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平。结果急性乙肝患者发病期mRNA表达显著高于正常对照组（P〈0.01）,恢复期GNLY基因表达与正常对照组差异无统计学意义（P〉0.05）。乙肝患者GNLYmRNA与血清ALT、AST呈正相关。结论实时荧光定量RT-PCR检测GNLY mRNA的表达准确可靠。患者外周血GNLY基因表达水平与急性乙肝的发生发展存在一定的相关性。     

隐球菌性脑膜炎患者外周血中TLR4的表达以及血清中TNF-α,IL-10的水平研究

目的探讨Toll样受体4（TLR4）在隐球菌性脑膜炎患者外周血中的表达,以及研究血清中TNF—α,IL-10的变化情况。方法收集25例隐球菌性脑膜炎患者和25例健康体检者全血,采用荧光定量PCR（FQ—PCR）检测TLR2,TLR4的mRNA表达。ELISA法检测血清中TNF—α,IL-10的表达。结果隐球菌性脑膜炎患：者TLR4 mRNA的表达显著低于对照组（0．35±0．18）（P〈0．05）,TLR2均无显著变化（0．87±0．23）（P〉0．05）。血清中的IL-10显著升高（4．25±1．30）pg／ml（P〈0．05）,TNF—α的变化不显著（1．49±0．87）pg／ml（P〉0．05）。结论隐球菌性脑膜炎患者TLR4 mRNA表达显著下降,可能在隐球菌性脑膜炎的发病过程中起一定的作用。     

隐球菌性脑膜炎患者中Th17细胞相关细胞因子的高表达及其临床意义

目的研究Th17细胞相关细胞因子IL-17A、IL-17F、IL-22在隐球菌性脑膜炎患者发病机制中的作用。方法收集了2011年2月至2013年2月期间来院就诊的免疫功能正常的隐球菌患者22例以及同期来院体检的健康个体20例,收集外周抗凝血,分离了外周血单个核细胞,采用RT-PCR以及ELISA检测了隐球菌性脑膜炎患者和健康对照者外周血单个核细胞(PBMC)中Th17相关细胞因子1L-17A、IL-17F以及IL-22的mRNA表达以及血浆中各蛋白水平的表达。并分析其与脑脊液蛋白浓度、颅内压、脑脊液隐球菌抗原滴度、脑脊液葡萄糖浓度的关系。结果隐球菌性脑膜炎患者外周血单个核细胞中IL-17A、IL-22的mRNA水平以及血浆中IL-17A、IL-22水平较健康对照组显著增高(P0.01),且与隐球菌性脑膜炎患者的预后因子脑脊液蛋白浓度、颅内压、脑脊液隐球菌抗原滴度、脑脊液葡萄糖浓度相关。结论 Th17细胞相关细胞因子IL-17A、IL-22可能参与了隐球菌性脑膜炎的发病机制,可能是潜在的评价隐球菌性脑膜炎病情的指标。     

四种TRAIL受体在隐球菌性脑膜炎中的表达及临床意义

目的 研究建立实时荧光定量(RFQ)-PCR法测定四种TRAIL受体DcR1,DcR2,DR4,DR5 mRNA含量的方法 ,探讨其在隐球菌性脑膜炎患者外周血单个核细胞中表达的检测价值,并分析隐球菌性脑膜炎患者免疫指标与四种TRAIL受体的相关性.方法 设计特异性的引物和探针,以人基因GAPDH为内参照,用实时定量PCR的方法 检测35例健康人和35例隐球菌性脑膜炎患者外周血单个核细胞中TRAIL受体mRNA的表达水平,采用全自动特定蛋白分析仪检测IgG,IgA,IgM,C3,C4.结果 与健康人比较,隐球菌性脑膜炎患者外周血单个核细胞中TRAIL受体DcR1 mRNA的表达显著升高(P<0.01),受体DcR2,DR4,DR5 mRNA的变化无统计学意义.隐球菌性脑膜炎患者血清中的C3和IgG显著下降(P<0.01),且与DcR1的变化成负相关,结论 隐球菌性脑膜炎患者TRAIL受体DcR1 mRNA的表达明显升高,提示TRAIL受体DcR1可能参与隐球菌性脑膜炎的疾病进程,这为有效治疗隐球菌性脑膜炎提供了新的线索.     

外周血单个核细胞APOBEC3G mRNA水平与乙肝病毒慢性感染关系的研究

[目的]探讨外周血单个核细胞（PBMC）APOBEC3G mRNA水平与乙肝病毒（HBV）慢性感染的关系。[方法]用实时荧光相对定量RT—PCR的方法检测27例慢性乙肝患者以及16名健康人PBMC中APOBEC3G mRNA的水平，同时检测乙肝患者外周血HBV病毒载量及丙氨酸氨基转移酶（ALT）。[结果]慢性乙肝患者PBMC中APOBEC3G mRNA的表达水平高于健康对照组，差异具有显著性（P〈0．01），且与外周血HBV病毒载量成正相关（r=0．73，P〈0．01），与ALT水平无明显相关性（P〉0．05）。[结论]APOBEC3G在人体内对HBV复制的影响可能不是直接的抑制作用。     

谷氨酰胺对COPD外周血单个核细胞HSP70、TNF-α表达的影响

目的探讨谷氨酰胺（Gin）对慢性阻塞性肺疾病患者外周血单个核细胞（PBMC）中热休克蛋白70（HSP70）和肿瘤坏死因-α（TNF-α）表达的影响。方法选择30例COPD急性加重期（AECOPD）患者为研究对象,设为AECOPD组．将治疗10～20d后处于稳定期的上述患者设为SCOPD组,分别以Gin干预,并以健康人为正常对照组。采用Real—timePCR法检测上述5组PBMC中HSP70mRNA和TNF-α mRNA的表达水平。结果AECOPD和SCOPD空白对照组HSP70mRNA、TNF-α mRNA的表达高于正常对照组,差异有统计学意义（t分别=-3．74、-3．57、-3．63、-3．31,P均〈0．05）;AECOPD组和SCOPD组中,用Gin干预的较未用Gln的PBMC中HSP70表达均升高,差异有统计学意义（t分别=4．87、2．81,P均〈0．05）,而TNF-α表达均下降（t分别=-3．42、-2．97,P均〈0．05）。结论Gin可抑制COPD患者炎症因子TNF-α的活性,升高HSP70的表达。     

急性乙型肝炎患者外周血单个核细胞颗粒溶素mRNA定量测定及临床意义

目的应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测乙型肝炎(简称乙肝)患者外周血单个核细胞(PBMC)中颗粒溶素(GNLY)mRNA的表达,探讨GNLY基因表达水平与急性乙肝的关系。方法实时荧光定量RT-PCR分别检测40例急性乙肝患者及100名正常对照的PBMC的GNLY基因表达水平,同时检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。结果急性乙肝患者发病期mRNA表达显著高于正常对照组(P<0.01),恢复期GNLY基因表达与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。乙肝患者GNLYmRNA与血清ALT、AST呈正相关。结论实时荧光定量RT-PCR检测GNLY mRNA的表达准确可靠。患者外周血GNLY基因表达水平与急性乙肝的发生发展存在一定的相关性。     

BLyS and APRIL expression in peripheral blood mononuclear cells of cryptococcal meningitis patients and their clinical significance

ObjectiveTo investigate the levels of APRIL, BlyS and receptors as TACI, BCMA and BAFF-R in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of cryptococcal meningitis (CM) patients and its clinical significance.MethodsPBMC from 30 CM patients and 32 healthy controls were isolated. The mRNA levels of APRIL, BLyS and BLyS receptors were detected by fluorescent quantitation PCR. The effect of PBMC from CM patients on in vitro growth of Cryptococcus neoformans was compared in presence and absence of BLyS.ResultsPBMC of CM patients exhibited significantly lower BLyS, TACI and BCMA mRNA levels but significantly higher BAFF-R mRNA levels than controls. Growth of C. neoformans was significantly slower in presence of BLyS than its absence.ConclusionLevels of BlyS and its receptors correlated with cryptococcal meningitis progression, and provide new clues for monitoring CM conditions and its effective therapy.     

隐球菌荚膜抗原胶体金免疫层析法在非HIV患者隐球菌脑膜炎诊断中的价值

目的探讨隐球菌荚膜抗原胶体金免疫层析法在非HIV患者隐球菌脑膜炎中的诊断价值。方法回顾性分析2013-2018年复旦大学附属华山医院3627例疑似中枢神经系统感染的住院患者的临床资料,收集符合隐球菌脑膜炎初诊的患者214例,分析各检验结果对隐球菌脑膜炎的诊断价值。结果隐球菌脑膜炎患者多数表现为脑脊液糖和氯化物水平显著下降,蛋白含量增高,白细胞增多且以单核细胞为主,脑脊液真菌镜检和培养的阳性率分别为75.23%和78.04%,脑脊液隐球菌胶体金免疫层析法检测阳性率高达100%。隐球菌脑膜炎患者随治疗时间的推移,脑脊液和血的隐球菌荚膜抗原滴度逐渐下降。结论胶体金免疫层析法适用于非HIV患者隐球菌脑膜炎的快速诊断,灵敏度高、特异性强,对隐球菌肺炎的患者能提前筛查是否有中枢神经系统感染,对荚膜抗原的动态监测有助于隐球菌病治疗疗效的观察。     

隐球菌脑膜炎患者外周血CD200表达水平及其临床意义

目的 分析隐球菌脑膜炎患者外周血CD200的表达水平及其与其他炎性因子水平的关系。方法 选取2009年6月～2013年11月期间上海长海医院和长征医院收治的25例隐球菌脑膜炎患者为研究对象,归为观察组,同时选取同期来体检的30名健康成人作为对照组。收集受试者的外周抗凝血,分离外周单个核细胞(PBMC),采用反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)方法检测PBMC中CD200的mRNA水平,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测其血浆CD200蛋白水平以及TNF-α,IFN-γ和IL-17的水平,并采用Pearson相关分析探讨CD200与这些炎性因子的相关性。结果 观察组和对照组PBMC的CD200mRNA水平分别为1.73±0.51和1.69±0.47,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。观察组血浆CD200蛋白水平为212.3±70.5 pg/ml,显著高于对照组的90.5±32.2 pg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组血浆TNF-α,IFN-γ水平显著低于对照组,IL-17水平显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析结果提示血浆CD200水平与IFN-γ呈负相关(r=-0.635,P<0.001),与IL-17水平呈正相关(r=0.668,P<0.001)。结论隐球菌脑膜炎患者血浆CD200水平显著升高,其可能通过调节IFN-γ和IL-17等炎性因子水平来影响患者的免疫功能,参与其发病,提示CD200有望成为隐球菌脑病免疫治疗的一个新的靶点。     

The spectrum of meningitis in a population with high prevalence of HIV disease

We studied the spectrum of meningitis and impact of HIV infection retrospectively (8 months) and prospectively (5 months) in 284 adult patients with meningitis hospitalized in Soweto, South Africa. Tuberculous meningitis (TBM) was the most common cause of meningitis (25.4%) followed by acute bacterial meningitis (ABM; 22.5%), acute viral meningitis (14.1%) and cryptococcal meningitis (13%). The in-hospital mortality was &gt;40% in TBM, ABM, cryptococcal meningitis, the neurosurgery and the parameningeal/parenchymal groups. At least 37.3% of all patients were HIV-seropositive (only 67% of patients were tested). In at least 27% of the study group the meningitis was an AIDS-defining illness (TBM, cryptococcal meningitis). Only 56.2% of patients with ABM has positive cultures (CSF or blood), of which <it>Streptococcus pneumoniae</it> was by far the most frequently found organism (35.8%). The spectrum of meningitis in HIV-affected communities in Africa can be expected to change towards a predominance of TBM and cryptococcal meningitis.      

LA检测隐球菌荚膜多糖抗原在隐球菌性脑膜炎诊断中的应用

目的 探讨乳胶凝集试验（LA）在隐球菌性脑膜炎中的早期诊断价值.方法 收集56例确诊的隐球菌性脑膜炎患 者和25例结核性脑膜炎、病毒性脑膜炎患者的脑脊液,采用乳胶凝集试验检测隐球菌荚膜多糖抗原,并与真菌培养和直接镜检方法相比较,评价其诊断的灵敏度和特异度.结果 乳胶凝集试验、真菌培养和直接镜检3种方法诊断的灵敏度分别为91.1％、69.6％和73.2％,乳胶凝集试验特异度分别为96.0％、100％、100％.结论 乳胶凝集试验检测隐球菌荚膜多糖抗原可作为隐球菌性脑膜炎的早期诊断方法.     

Use of high-dose fluconazole as salvage therapy for cryptococcal meningitis in patients with AIDS.

Eight patients with AIDS were treated orally with 800 mg of fluconazole daily for cryptococcal meningitis for a mean duration of 4.5 months. Previous antifungal treatment had failed for all of the patients. No major toxicity was observed. Three patients died from cryptococcal infection. High-dose fluconazole may be effective salvage therapy for cryptococcal meningitis.     

原发性胆汁性肝硬化患者外周血穿孔素的表达及其临床意义

  目的  研究原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)患者外周血穿孔素(perforin, 又称pore-forming protein, PFP)的表达, 探讨PFP在PBC发病机制中的作用及其临床意义。  方法  应用荧光定量PCR检测86例PBC、56例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis type B, CHB)和69名健康对照者的外周血单个核细胞(peripheral bloodmono nuclear cells, PBMCs)中PFP mRNA基因表达的差异; 采用流式细胞术分别检测CD3-CD56+自然杀伤细胞(natu-ral killer cells, NK)、CD3+CD8+细胞毒性T细胞(cytotoxic Tlymphocytes, CTL)和CD3+CD56+自然杀伤性T细胞(natural killer Tlymphocytes, NKT)的PFP蛋白表达量。  结果  PBC组PBMCs中PFP mRNA基因表达较健康对照者升高(P < 0.05);PBC、CHB患者和健康对照者NK、CTL和NKT占PBMCs的比例无明显差别(P>0.05), PBC患者NK、CTL和NKT中表达PFP蛋白的细胞较健康对照者明显升高(P < 0.01)。PFPmRNA基因表达量及NK、CTL和NKT表达PFP蛋白的细胞比例与PBC患者Mayo危险评分呈显著负相关(P < 0.01), PBC患者总胆红素水平与NK、CTL表达PFP蛋白的细胞比例呈负相关(P < 0.05)。  结论  PBC患者PFP的异常表达, 提示PFP可能参与PBC的发病。PBC患者NK、CTL和NKT表达PFP蛋白的细胞比例可做为PBC患者生存预后的有效指标。     

The clinical laboratory evaluation of cryptococcal infections in the acquired immunodeficiency syndrome

The medical and laboratory records were reviewed in 37 acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) patients with cryptococcal infections. In 24 patients with the presentation of cryptococcal meningitis, the initial cerebrospinal fluid (CSF) culture was positive. The initial India ink mount demonstrated organisms in 79% of culture positive CSF specimens. After therapy the subsequent India ink mounts demonstrated 84% sensitivity and 53% specificity with respect to culture outcome. Cultures of blood, bronchoalveolar lavage fluid, and brain were more likely to be positive than cultures from other sites. The initial blood cultures were positive in eight of eight patients at presentation of cryptococcal meningitis. When the initial CSF titer was greater than 1:2, the corresponding CSF culture was always positive. A negative culture during therapy did not necessarily indicate eradication of infection. The initial cerebrospinal fluid and serum cryptococcal antigen titers varied significantly and could not be correlated with survival. In three instances when the CSF cryptococcal antigen titers and cultures were negative, a positive serum cryptococcal antigen greater than 1:8 suggested disseminated infection.     

人颗粒溶素的克隆、原核表达及其抗体制备

目的构建人颗粒溶素(GNLY)质粒,进行原核表达,纯化得到相对分子质量9 000目的片段,免疫新西兰大白兔得到兔抗GNLY多克隆抗体。方法分离外周血单个核细胞,用卡介苗和白细胞介素-2(IL-2)刺激,培养12 d。抽提细胞RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得含有222 bp的GNLY cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a( )中,得到重组质粒pET28a( )-GNLY并将其转化大肠杆菌,诱导表达后用镍(Ni)亲和层析纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹试验(Westernblot)进行鉴定。用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,得到抗-GNLY特异性多抗。结果成功构建了pET28a( )-GNLY表达质粒。用大肠杆菌表达带6个组氨酸的融合蛋白并进行纯化,最后免疫兔得到抗-GNLY特异性多抗,并经Western blot验证正确。结论获得了纯化的GNLY蛋白和抗-GNLY多抗血清,为今后对疾病中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞活性的研究打下了基础。