人颈椎间盘退变与细胞凋亡及基质金属蛋白酶11的表达

背景：前期研究发现基质金属蛋白酶11基因在人退变颈、腰椎间盘组织中明显上调。目的：观察人退变颈椎间盘髓核组织中基质金属蛋白酶11的表达与细胞凋亡的关系。方法：纳入30个经MRI确认的退变颈椎间盘髓核组织和20个因颈椎创伤治疗获得的正常颈椎间盘髓核组织。结果与结论：苏木精-伊红染色显示退变的颈椎间盘髓核组织中髓核细胞较正常髓核组织明显减少（P〈0.01）,而凋亡细胞较正常髓核组织明显增多（P〈0.01）。免疫组化染色显示退变的颈椎间盘髓核组织中基质金属蛋白酶11的表达明显高于正常髓核组织（P〈0.01）,且基质金属蛋白酶11表达与TUNEL染色检测到的细胞凋亡正相关（r=0.44,P〈0.05）。说明高表达的基质金属蛋白酶11不仅可直接破坏细胞外基质尚可诱导髓核细胞凋亡,在椎间盘退变的过程中发挥重要作用。     

正常与退变髓核细胞形态学及Ⅱ型胶原蛋白的定量分析

背景：椎间盘退变导致椎间隙狭窄的主要变化是髓核细胞表达软骨特异性基因产物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的减少。 目的：对成人的正常与退变椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色及番红O染色进行定量观察比较。 方法：取成人脊柱侧弯患者与椎间盘突出症患者自愿者术中取出的废弃髓核组织各3例,经培养后每个患者各测量26个细胞,正常组和退变组分别测量78个细胞。对正常与退变椎间盘髓核细胞进行番红“O”染色并行灰度及测定细胞内Ⅱ型胶原蛋白行免疫荧光染色定量测定。 结果与结论：免疫荧光染色显示：退变椎间盘髓核细胞仅轻度染色,染色模糊,其呈类圆形,纺锤形,梭形及不规则形,其内仅有极少量荧光颗粒;Ⅱ型胶原表达较正常髓核细胞降低显著（P〈0.05）。番红O染色显示：退变的髓核细胞肿胀,细胞核肿胀染色略淡,细胞突起延长,胞浆染色不匀伴有空泡,部分细胞崩解,细胞分布零散,混乱,可见成片坏死区。与正常髓核细胞图像灰度值相比差异无显著性意义（P〉0.05）。结果表明退变的椎间盘髓核细胞减少、部分凋亡,其细胞内Ⅱ型胶原蛋白含量较正常髓核细胞显著减少。     

人颈椎间盘退变与细胞凋亡及基质金属蛋白酶11的表达

背景:前期研究发现基质金属蛋白酶11基因在人退变颈、腰椎间盘组织中明显上调.目的:观察人退变颈椎间盘髓核组织中基质金属蛋白酶11的表达与细胞凋亡的关系.方法:纳入30个经MRI确认的退变颈椎间盘髓核组织和20个因颈椎创伤治疗获得的正常颈椎间盘髓核组织.结果与结论:苏木精-伊红染色显示退变的颈椎间盘髓核组织中髓核细胞较正常髓核组织明显减少(P < 0.01),而凋亡细胞较正常髓核组织明显增多(P < 0.01).免疫组化染色显示退变的颈椎间盘髓核组织中基质金属蛋白酶11的表达明显高于正常髓核组织(P < 0.01),且基质金属蛋白酶11表达与TUNEL染色检测到的细胞凋亡正相关(r=0.44,P < 0.05).说明高表达的基质金属蛋白酶11不仅可直接破坏细胞外基质尚可诱导髓核细胞凋亡,在椎间盘退变的过程中发挥重要作用.     

退变兔髓核细胞和正常髓核细胞生物学特性的比较

目的探讨退变和正常兔髓核细胞的不同生物学特性。方法分离和培养原代兔椎间盘髓核细胞,体外传至第5代使其发生退变,细胞分成原代髓核细胞组（原代）和第5代退变细胞组（退变）,用倒置显微镜和HE染色观察其形态学变化,用番红O染色观察糖胺聚糖的变化,用Ⅱ型胶原免疫组织化学观察Ⅱ型胶原的变化。结果原代兔髓核细胞在体外传至第5代后,细胞由类软骨细胞样的星形或多角形变为梭形或纤维长条形。番红O染色显示,退变组红色平均染色面积显著低于原代（P〈0．05）,免疫组织化学染色显示,退变组棕黄色平均染色面积显著低于原代（P〈0．05）。结论原代兔髓核细胞在体外传到第5代时由类软骨细胞样变成纤维细胞样,且糖胺聚糖和Ⅱ型胶原的含量显著下降,为进一步构建体外髓核细胞退变模型提供了依据。     

体外培养人正常椎间盘髓核细胞与退变髓核细胞的生物学性状比较:可以为干预退变髓核细胞提供最佳时机吗?

背景:人体椎间盘是一个承受载荷却又缺乏血管的结构,因而容易发生退行性变,但椎间盘退变的机制尚不明确.目的:通过体外培养人正常椎间盘髓核细胞与退变髓核细胞生物学性状比较,认识退变髓核细胞的细胞学退变时机.方法:分离、培养人正常及退变椎间盘髓核细胞,对两种细胞采用光镜、电镜等形态学方法进行大体形态和超微结构观察,采用生长曲线和XTT实验研究两种细胞的生长动力学差异,测定髓核细胞的活力和细胞Ⅱ型胶原及糖胺多糖的mRNA表达.结果与结论:退变椎间盘细胞至少要比正常椎间盘细胞提前2代出现形态学老化表现.退变髓核细胞表现为G1期阻滞,使细胞不能进入S期,细胞有丝分裂受到抑制.退变髓核细胞总体来说,生长要比正常髓核细胞快,但老化也较快.退变髓核细胞自第1代开始,Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达比同期正常髓核细胞低得多.说明在体外培养条件下,退变髓核细胞持续增殖能力低,更容易衰老、凋亡.提示退变髓核细胞体外培养衰老较快,进行干预试验逆转椎间盘退变的最佳时机为传2代之前的细胞.     

体外培养人退变髓核细胞的生物学性状

背景：椎间盘退行性变后很难自行修复,研究退变髓核细胞的生物学特性可为研究椎间盘退变机制、组织工程椎间盘构建、基因治疗等提供理论基础。目的：观察体外培养的人退变髓核细胞的生物学特性。方法：分离培养人退变椎间盘髓核细胞,采用光镜、电镜观察细胞的形态和超微结构,荧光定量PCR技术检测髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA的表达。ELISA法检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原水平,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖水平。结果与结论：体外培养的传2代内的退变椎间盘髓核细胞结构与原代细胞相似,传3代后的细胞出现退变及凋亡改变。对体外培养第1代的退变髓核细胞和正常髓核细胞的Ⅱ型胶原和糖胺多糖进行检测发现,退变髓核细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖mRNA水平及细胞外基质中Ⅱ型胶原和糖胺多糖的表达均明显低于正常髓核细胞,呈现去分化趋势。     

骨髓间充质干细胞与髓核细胞的体外共培养

背景：细胞移植治疗椎间盘退行性变目前尚处在实验室研究阶段。目的：通过SD大鼠骨髓间充质干细胞与退行性改变的髓核细胞体外共培养,探索骨髓间充质干细胞能否通过直接接触促进髓核细胞外基质的表达以及髓核细胞能否诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化。方法：取已自然退变的第6代髓核细胞与生长良好的第4代骨髓间充质干细胞按不同比例（75：25,50：50和25：75）体外共培养7d,单独髓核细胞（100：0）与单独骨髓间充质干细胞（0：100）分别作为阳性对照和阴性对照。结果与结论：RT-PCR检测显示共培养组（75：25和50：50）蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白条带均明显亮于单独髓核细胞培养组（100：0）,吸光度值比较差异有显著性意义;免疫组织化学检测显示Ⅱ型胶原蛋白在共培养组（75：25和50：50）胞浆内的表达明显高于单独髓核细胞培养组（100：0）。共培养组中可见骨髓间充质干细胞由长梭形向多角形、类圆形转变,胞浆内异染颗粒增多。提示通过体外直接接触共培养,骨髓间充质干细胞能逆转髓核细胞退变,而且髓核细胞能诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞转换。     

髓核细胞移植抑制椎间盘退变

背景：近年来,椎间盘细胞移植和椎间盘移植修复椎间盘退变研究取得较大的进展。目的：探讨髓核细胞的体外培养方法以及髓核细胞移植在抑制椎间盘退变研究中的作用。方法：通过数据库检索的方式探讨髓核细胞移植抑制椎间盘退变的研究。髓核细胞的主要功能是产生胶原和蛋白聚糖,改进髓核细胞的培养方法,使培养后的髓核细胞数量增多,合成和分泌细胞外基质增加,通过髓核细胞移植来修复退变的椎间盘。结果与结论：通过三维小球聚集培养、微载体旋转立体培养等方法可以使髓核细胞数量增多,肝细胞生长因子对髓核细胞增殖产生促进作用。髓核细胞移植可以恢复退变椎间盘高度,促进退变椎间盘内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的生物合成和分泌。随着对椎间盘退变研究的不断深入,髓核细胞移植对退变椎间盘可能是一种重要的治疗手段。     

蛋白聚糖酶2与金属蛋白酶组织抑制剂3在腰椎间盘髓核退变中的表达及意义

目的观察人体腰椎间盘髓核在不同退变程度时蛋白聚糖酶2及金属蛋白酶组织抑制剂3（TIMP-3）的阳性表达,探讨其在髓核退变过程中的作用。 方法选取脊柱外科腰椎手术摘除的髓核标本45例,采用Pfirrmann分级法对椎间盘髓核退变MRI进行分级。分为3组：对照组（Pfirrmann分级I、Ⅱ级）、退变组（Pfirrmann分级Ⅲ-IV级）和严重退变组（Pfirrmann分级V级）,每组15例。用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后,应用免疫组织化学方法检测髓核细胞中蛋白聚糖酶2及TIMP-3的表达。 结果椎间盘髓核细胞中蛋白聚糖酶2的阳性细胞率在对照组、退变组、严重退变组分别为（13.58±7.76）%、（33.48±13.95）%、（56.00±18.39）%,且退变组与对照组比较,表达增强（P<0.01）;严重退变组分别与对照组和退变组比较,表达均增强（P<0.01）。对照组、退变组和严重退变组的TIMP-3阳性细胞率分别为（34.78±13.80）%、（46.77±10.98）%、（50.65±16.45）%,且退变组与对照组比较,表达增强（P<0.05）;严重退变组与对照组比较,表达亦增强（P<0.01）;严重退变组与退变组比较,表达也增强（P<0.05）。对照组、退变组和严重退变组的蛋白聚糖酶2/TIMP-3比值分别为（45.37±30.57）%、（75.90±40.30）%和（120.62±49.67）%;退变组与对照组比较,比值升高（P<0.05）;严重退变组分别与对照组和退变组比较,比值均升高（P<0.01）。 结论在腰椎间盘髓核中蛋白聚糖酶2与TIMP-3的表达及蛋白聚糖酶2/TIMP-3比值均随髓核退变程度加重而升高,提示二者与髓核退变有密切关系,其比值升高与髓核退变程度呈正相关。     

脉冲电磁场对人退变髓核细胞A2A腺苷受体的影响

目的 观察脉冲电磁场对人退变髓核细胞A2A腺苷受体及白细胞介素1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的影响。 方法 取人退变髓核细胞进行体外培养,取生长良好的二代髓核细胞给予脉冲电磁场干预（磁场强度0.8 mT,频率50 Hz,脉宽150 μs,曝磁时间30 min,共曝磁6次）。采用蛋白免疫印迹法（WB）及RT-PCR法观察髓核细胞A2A腺苷受体表达变化,采用ELISA法检测髓核细胞炎症因子IL-1β、TNF-α表达变化。另外本研究还分别采用A2A腺苷受体拮抗剂和激动剂处理人退变髓核细胞,再采用ELISA法检测脉冲电磁场对人退变髓核细胞IL-1β、TNF-α表达的影响。 结果 人退变髓核细胞经脉冲电磁场处理后,发现A2A腺苷受体表达水平明显增强（P<0.05）,同时IL-1β、TNF-α表达水平明显降低（P<0.05）。人退变髓核细胞经A2A腺苷受体拮抗剂处理后,发现能逆转脉冲电磁场对IL-1β、TNF-α的抑表达作用;人退变髓核细胞经A2A腺苷受体激动剂处理后,发现能增强脉冲电磁场对IL-1β、TNF-α的抑表达作用。 结论 脉冲电磁场干预能明显抑制人退变髓核细胞炎症因子IL-1β、TNF-α表达,并且该抑制作用可能与上调A2A腺苷受体表达有关。     

胰岛素样生长因子1及血小板源性生长因子对人退变髓核细胞生物学活性的影响

背景：有研究表明胰岛素样生长因子1和血小板源性生长因子可抑制人椎间盘细胞凋亡。目的：观察在体外培养条件下胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子对人退变髓核细胞生物学活性的影响。方法：体外单层培养人退变髓核细胞,通过免疫组织化学鉴定细胞。对传3代人退变髓核细胞采用分别不同生长因子干预,实验分4组：胰岛素样生长因子1组,血小板源性生长因子组,胰岛素样生长因子1＋血小板源性生长因子组及对照组。结果与结论：胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子均可促进细胞增殖,促进细胞合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖,其中胰岛素样生长因子1促Ⅱ型胶原合成作用强于血小板源性生长因子（P〈0.05）,血小板源性生长因子促蛋白聚糖合成作用强于胰岛素样生长因子1（P〈0.05）。胰岛素样生长因子1促进细胞合成Ⅰ型胶原,血小板源性生长因子抑制细胞合成Ⅰ型胶原。结果证实,胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子均可通过促进细胞增殖、促进细胞合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖,从而提高人退变髓核细胞的生物学活性。     

椎间盘骨水泥颗粒对人髓核细胞增殖的影响并非无足轻重

背景：椎体成形和椎体后凸成形治疗骨质疏松性椎体骨折过程中,常发生椎间盘骨水泥渗漏,但有关骨水泥进入椎间盘后对椎间盘细胞的影响尚不明确.目的：观察骨水泥颗粒对人髓核细胞增殖能力的影响.方法：采用体积分数0.001%,0.01%,0.1%,0.5%,1.0%的磷酸钙骨水泥颗粒或聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥颗粒处理人正常髓核细胞,以常规培养的人正常髓核细胞为对照,以 CCK-8法检测各组细胞增殖活性.结果与结论：不同体积分数的磷酸钙骨水泥颗粒对人正常髓核细胞增殖无影响.体积分数0.001%,0.01%的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥颗粒对人正常髓核细胞增殖无显著影响;体积分数0.1%,0.5%,1.0%的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥颗粒明显抑制人正常髓核细胞的增殖,与对照组比较差异有显著性意义（P 〈0.05）,且该效应具有时间依赖性和剂量依赖性：在处理3,6 d 时,对人正常髓核细胞增殖的抑制效应随颗粒体积分数的增加而逐渐增强;当颗粒体积分数为0.1%,0.5%和1.0%时,对人正常髓核细胞增殖抑制的效果随着时间的延长逐渐加强.     

大鼠退变髓核腰交感神经干注射对交感神经干炎症因子表达的影响

目的观察X线引导下大鼠退变髓核腰交感干注射对腰交感神经干炎症因子表达的影响。方法实验用雄性SD大鼠共72只,随机分为三组:空白对照组、假手术组、髓核注射组。髓核注射组大鼠行X线下自体退变髓核悬液右侧腰交感干注射,假手术组注射等剂量生理盐水,空白对照组不做任何处理。注射后14天,取各组大鼠右侧腰交感干行组织学观察,并采用ELISA法定量分析炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达变化。结果髓核注射组大鼠腰交感干组织学观察发现有明显的炎性细胞浸润及血管肿胀、充血;ELISA检测发现腰交感干IL-1β(20.1±4.40pg/ml),IL-6(26.5±8.9pg/ml)及TNF-α(60.77±6.37pg/ml)蛋白含量比空白对照组IL-1β(8.02±1.31pg/ml),IL-6(10.30±1.43pg/ml),TNF-α(24.38±4.81pg/ml)及假手术组IL-1β(7.52±2.11pg/ml),IL-6(11.58±2.56pg/ml),TNF-α(26.12±6.81pg/ml)表达显著增高(P0.05)。结论大鼠自体退变髓核导致腰交感神经干炎症因子表达升高可能与盘源性内脏痛的发生有关。     

静水压下芹菜素对体外培养人髓核细胞凋亡率及基质代谢的影响

背景：生物力学环境的异常及一氧化氮过度表达是椎间盘退变进程中重要的影响因素。目的：探讨静水压下芹菜素对体外单层培养的人髓核细胞凋亡率及基质代谢的影响。方法：在静水压加载系统中对体外单层培养的人髓核细胞（传4代）施以0.1-3.0MPa的静压,加压2h,同时使用芹菜素和一氧化氮供体对髓核细胞进行干预,分析不同静水压下芹菜素对髓核细胞凋亡率、基质金属蛋白酶及基质表达的影响。结果与结论：在0.3MPa静水压下,芹菜素能改善由于高浓度一氧化氮引起的髓核细胞功能抑制状态,降低基质金属蛋白酶3过表达,恢复基质金属蛋白酶3与其抑制因子1之间的平衡;而在3MPa静水压下,芹菜素能降低一氧化氮引起的髓核细胞高凋亡,并在一定程度上缓解基质金属蛋白酶3与其抑制因子1之间的不平衡。说明芹菜素能够对髓核细胞的功能状态、凋亡率,对基质金属蛋白酶3及其抑制因子1平衡产生影响,而且这种影响在不同的静水压环境下有所不同。     

髓核细胞诱导骨髓间充质干细胞向髓核方向的分化

背景：国内外已有很多文献相继报道了用骨髓间充质干细胞-藻酸盐复合植入材料来修复大鼠退变的腰椎间盘,但尚缺少对此复合物与正常髓核细胞之间的各项生物学指标的比较。目的：在Transwell非接触共培养条件下,研究髓核细胞对骨髓间充质干细胞的诱导作用。方法：全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞并鉴定,取第3代骨髓间充质干细胞及髓核细胞复合藻酸盐接种于Transwell共培养系统中,上室接种骨髓间充质干细胞藻酸盐复合物,下室接种髓核细胞藻酸盐复合物,共培养7d后回收上层骨髓间充质干细胞。结果与结论：RT-PCR方法检测共培养组Ⅱ型胶原、Sox-9和多功能蛋白聚糖的mRNA表达均接近正常髓核细胞。说明共培养条件下髓核细胞能诱导骨髓间充质干细胞向髓核方向分化。     

单侧椎弓根螺钉置入并椎间融合对邻近椎间盘节段退变的影晌

背景：坚强内固定和良好融合存在严重缺陷和不足。目前还未见临床应用单侧椎弓根螺钉固定结合椎间cage植骨融合治疗腰椎退变性疾病对邻近节段退变影响的相关报道。目的：回顾分析单侧椎弓根螺钉固定结合椎间cage植骨融合治疗部分腰椎退变性疾病后对固定融合邻近上下节段退变的影响。方法：2006-03／2009-12对收治的部分腰椎管狭窄症、腰椎失稳及腰椎间盘脱出症患者22例,进行了单侧椎弓根螺钉固定加椎间cage植骨融合,术中不显露对侧。在固定融合后3,6,12,20个月及取出内固定钉棒后3,6个月,随访X射线片及MRI。针对X射线片运用角平分线法测量固定融合邻近上位椎间隙高度变化,MRI测量椎间盘髓核退变情况。结果与结论：所有病例获得随访,患者椎管狭窄症状及神经根性症状消失,并且在随访期间内没有新的临床症状出现。固定融合前、固定融合后3,6,12,20个月邻近节段上位椎间隙高度分别为（7.420±0.0354）,（7.4266±0.0369）,（7.4533±0.0369）,（7.5166±0.0369）,（7.4308±0.0369）mm,结果表明,腰椎单侧固定融合后邻近节段椎间隙高度无明显变化（P〉0.05）。MRI测量结果显示,固定融合邻近上位椎间盘髓核信号在T2加权像无明显退变。提示单侧椎弓根螺钉固定结合椎间融合治疗部分腰椎退变性疾病能有效预防崮定融合邻近上下节段退变。     

三氧化二砷对白血病HL-60细胞株的凋亡作用

目的：探讨三氧化二砷对HL-60的诱导凋亡作用。方法：琼脂糖电泳检测DNA条带;Hoecst 33258染色后荧光显微镜观察细胞核的变化。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：10μmol/L三氧化二砷处理HL-60细胞24~48 h可见到DNA出现梯形条带;处理24~48 h HL-60细胞核呈现细胞核浓缩和核碎裂现象。流式细胞仪测定12、24、和48 h的细胞凋亡率分别为（8.5±2.1）%、（12.8±3.4）%及（21.4±5.8）%,而培养48 h的HL-60细胞自然凋亡率仅为（1.5±0.5）%（P〈0.05）。结论：三氧化二砷可诱导HL-60细胞凋亡。     

骨形态发生蛋白7通过PI3K/Akt通路可抑制人髓核细胞的凋亡

背景：骨形态发生蛋白7可促进人髓核细胞的细胞外基质合成,减缓椎间盘退变.近年来,有学者提出其可能通过对抗髓核细胞凋亡从而发挥上述作用,但其进一步的分子机制一直未被详细阐明.目的：观察骨形态发生蛋白7对无血清诱导下发生凋亡的人髓核细胞产生的作用及其对PI3K/Akt通路的影响,分析并探讨骨形态发生蛋白7抑制人髓核细胞凋亡的分子机制.方法：通过改良Pfirrmann分级及相关条件选取12例患者获取椎间盘组织,采用酶消化法获取人髓核细胞后分组实验,以含体积分数15％胎牛血清的培养基正常培养的髓核细胞设为空白组;使用无血清培养基培养48 h诱导凋亡作为阳性对照组;在无血清条件下,通过加入不同剂量的骨形态发生蛋白7以及同时添加PI3K/Akt通路拮抗剂LY294002形成处理组和拮抗组.使用流式细胞术检测各组细胞凋亡率;免疫荧光观察p-Akt表达;蛋白印迹法检测Akt,p-Akt,BAD和Caspase 9等通路蛋白的表达变化.结果与结论：无血清凋亡诱导下,流式细胞术结果显示,随着骨形态发生蛋白7处理浓度上升,髓核细胞凋亡率明显下降,加入LY294002共同作用后细胞凋亡率再次升高（P＜0.05）.p-Akt免疫荧光和蛋白印迹法检测结果进一步表明,与凋亡阳性对照组相比,加入骨形态发生蛋白7的实验组中,p-Akt表达明显增加,其下游凋亡相关蛋白BAD、Caspase 9蛋白表达减少（P＜0.05）,而在同时加入Akt通路拮抗剂LY294002后,p-Akt蛋白表达下降而凋亡相关蛋白的表达又恢复到相对较高的水平（P＜0.05）.结果证明,骨形态发生蛋白7在无血清诱导的人类髓核细胞凋亡中通过激活PI3K/Akt通路,拮抗了BAD-Caspase 9相关的细胞凋亡过程,抑制了髓核细胞的退变.