胃癌细胞中STAT1的表观遗传学调控机制的研究

目的研究抑制信号传导和转录激活因子1(STAT1)基因表达对胃癌MKN-45细胞增殖、侵袭、迁移等表观遗传学特性的影响。方法将胃癌细胞分为三组:空白对照组不做任何处理,空载体对照组、STAT1 SiRNA处理组分别转染SiRNA和特异性干扰STAT1基因表达的STAT1 SiRNA。蛋白质印迹法(Western Blot)检测STAT1、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表达;噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖活性;Transwell法检测MKN-45细胞侵袭、迁移能力。结果抑制STAT1表达后,MKN-45细胞的增殖活性、侵袭以及迁移能力显著降低(P0.05),且STAT1 SiRNA处理组细胞中VEGF、MMP-2、MMP-9表达量较空白对照组明显降低(P0.05);空载体对照组与空白对照组细胞的增殖活性、侵袭以及迁移能力、VEGF、MMP-9、MMP-2表达量比较差异均无显著性(P0.05)。结论 STAT1可能通过调控肿瘤细胞的转移能力以及血管生成等抑制胃癌细胞增殖及侵袭、迁移能力。     

过表达SHIP-1对白血病细胞侵袭、迁移及PI3K/AKT信号通路的影响

目的:探讨含有SH2结构的5'肌醇磷酸酶-1(SHIP-1)对白血病细胞增殖、侵袭和迁移能力以及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路的影响。方法:采用脂质体Lipofectamine 2000将过表达载体p CDNA3.1-SHIP1转染白血病THP-1细胞,实验分为3组:对照组(未做处理的细胞),空载体组(转染空载体p CDNA3.1-NC)和过表达组(转染过表达载体p CDNA3.1-SHIP1);应用CCK-8法检测细胞的增殖情况,Transw ell法检测细胞侵袭、迁移能力,免疫印迹实验(Western blot)检测细胞中SHIP-1、AKT、磷酸化AKT(p AKT)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表达量。结果:细胞转染过表达载体后SHIP-1的表达量显著高于对照组(P0.05);与对照组相比,空载体组细胞的吸光值没有明显差异(P0.05),过表达组细胞的吸光值显著降低(P0.05);空载体组细胞的侵袭、迁移数与对照组无明显差异(P0.05),过表达组细胞的侵袭、迁移数显著低于对照组(P0.05);与对照组相比,空载体组细胞中AKT、p AKT和MMP-9的表达量没有显著差异(P0.05),过表达组细胞中AKT蛋白的表达量无显著差异(P0.05),但p AKT、MMP-9的表达量均显著降低(P0.05)。结论:SHIP-1抑制白血病细胞的增殖,且降低其侵袭、迁移能力,其机理可能与通过影响PI3K/AKT信号转导通路的活化从而下调MMP-9的表达有关。     

莱菔硫烷对鼻咽癌细胞中Klf4表达及侵袭迁移能力的影响

目的探讨莱菔硫烷(sulforaphane,SF)对鼻咽癌细胞中Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,Klf4)表达及侵袭、转移能力的影响。方法将鼻咽癌细胞株HONE1和5-8F分为HONE1对照组、HONE1SF处理组、5-8F对照组、5-8FSF处理组,HONE1对照组和5-8F对照组正常培养,不做任何处理;HONE1SF处理组和5-8FSF处理组细胞采用梯度浓度SF处理。72 h后采用CCK-8实验检测细胞存活率,并计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50));取50%IC_(50)浓度SF处理HONE1和5-8F后,采用免疫荧光法观察Klf4的亚细胞定位,采用划痕试验和Transwell试验观察细胞侵袭迁移能力,采用Western blot法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)等上皮-间充质细胞转化相关蛋白表达情况。结果经0~20.0μmol/L SF处理后的HONE1和5-8F细胞存活率逐渐下降,SF的IC_(50)值分别为8.6和9.4μmol/L;HONE1SF处理组和5-8FSF处理组细胞质中Klf4表达明显高于HONE1对照组和5-8F对照组,细胞迁移速度低于HONE1对照组和5-8F对照组,侵袭细胞数少于HONE1对照组和5-8F对照组;HONE1SF处理组E-cadherin表达量[(17 543 490±7 545)Int]高于HONE1对照组[(13 543 656±4 554)Int],N-cadherin[(14 239 989±6 902)Int]及vimentin[(6 090 321±3 475)Int]低于HONE1对照组[(16 093 409±9 348)、(8 994 382±8 543)Int](P0.05);5-8FSF处理组E-cadherin表达量[(15 430 038±6 821)Int]高于5-8F对照组[(12 397 373±6 432)Int],N-cadherin[(11 980 109±2 343)Int]及vimentin表达量[(4 903 480±3 090)Int]低于5-8F对照组[(15 999 890±2 390)、(7 098 023±5 409)Int],差异均有统计学意义(P0.05)。结论 SF可导致鼻咽癌细胞Klf4在细胞质中聚集,降低其在体外的侵袭迁移能力,可能与细胞质中的Klf4升高E-cadherin表达、降低vimentin表达有关。     

胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1表达对鼻咽癌细胞系CNE1发生发展的研究

目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBP-rP1)对鼻咽癌细胞系CNE1细胞的增殖、侵袭、迁移能力的影响。方法构建2条特异性针对IGFBP-rP1基因的小干扰RNA(siRNA32、siRNA34)及其阴性对照siRNA,将CNE1细胞分为4个转染组:siRNA32组(siRNA32转染)、siRNA34组(siRNA34转染)、阴性对照组(阴性对照siRNA转染)、空白组(不做任何处理),分别培养24h或48h后检测相关指标。结果siRNA32组和siRNA34组IGFBP-rP1mRNA及蛋白表达水平显著低于阴性对照组和空白组(P0.05);siRNA32组和siRNA34组CNE1细胞迁移数、穿过PVP-F膜的CNE1细胞数显著低于阴性对照组和空白组(P0.05);培养24、48h后,siRNA32组和siRNA34组CNE1细胞增殖OD值显著低于阴性对照组和空白组(P0.05);培养48h后,siRNA32组和siRNA34组G0/G1期、G2/M期细胞所占比例显著高于阴性对照组和空白组(P0.05);siRNA32组和siRNA34组S期细胞所占比例显著低于阴性对照组和空白组(P0.05)。结论抑制IGFBP-rP1表达能降低鼻咽癌CNE1细胞的增殖、侵袭、迁移能力,为临床治疗鼻咽癌提供一种新的思路。     

沉默p21活化激酶1表达对人黑素瘤A375细胞凋亡及侵袭能力的影响

目的探讨shRNA沉默p21活化激酶1(p21-activated kinase 1, PAK1)基因表达对人黑素瘤A375细胞凋亡、迁移及侵袭能力的影响。方法对数生长期人黑素瘤A375细胞随机分为转染组(转染PAK1特异性shRNA)、阴性对照组(转染NC-shRNA)、空白对照组(不进行转染)。转染后培养72 h,采用实时荧光定量PCR法检测A375细胞PAK1 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测A375细胞PAK1及p-PAK1蛋白相对表达量,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力。结果转染后培养72 h,转染组PAK1 mRNA相对表达量(0.45±0.07)、PAK1蛋白相对表达量(0.53±0.01)、p-PAK1蛋白相对表达量(0.21±0.03)均低于阴性对照组(0.98±0.04、0.65±0.02、0.38±0.04)、空白对照组(1.00±0.08、0.67±0.51、0.36±0.02)(P0.05),细胞凋亡率[(11.20±0.21)%]高于阴性对照组[(5.86±0.51)%]、空白对照组[(5.43±0.03)%](P0.05),迁移细胞数[(47.00±2.23)个]、侵袭细胞数[(30.00±4.44)个]较阴性对照组[(76.00±4.85)、(54.00±3.67)个]、空白对照组[(77.90±4.97)、(56.00±4.12)个]少(P0.05),阴性对照组上述各指标与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论沉默PAK1基因表达可促进人黑素瘤A375细胞凋亡,降低其迁移及侵袭能力。     

整合素连接激酶对鼻咽癌细胞系迁移及上皮-间充质转化的影响

目的:探讨整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)对鼻咽癌细胞迁移及上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)转化的影响及其作用机制。方法:通过脂质体介导将ILK SiRNA转染CNE2鼻咽癌细胞系,细胞分为siILK组、siGAPDH阳性对照组及siControl阴性对照组。RT-PCR和Western印迹检测鼻咽癌细胞系CNE2中ILK的RNA水平和蛋白水平表达的变化。Transwell实验和划痕试验观察ILK SiRNA对细胞迁移能力及侵袭能力的影响,RT-PCR法检测了与EMT过程中的相关基因mRNA的表达水平。结果:转染ILK SiRNA后,CNE2细胞中ILK mRNA和蛋白表达水平均明显下降;ILK SiRNA可明显抑制CNE2细胞的迁移及侵袭能力;上调E-cadherin的表达,下调OCLN,Vimentin,Twist1,FN1的表达,抑制EMT过程的发生。结论:ILK在鼻咽癌细胞系CNE2中高表达,降低ILK表达可诱导鼻咽癌细胞间充质-上皮细胞转型的发生,并因此而显著降低其侵袭和转移潜力。     

F10基因过表达及沉默对绒癌细胞系JEG-3侵袭性的影响

目的探讨F10基因过表达及沉默对绒癌细胞系JEG-3侵袭相关蛋白酶表达的影响。方法采用细胞转染技术及RNA干扰技术,分别建立和筛选出F10基因稳定过表达及沉默的绒癌细胞系JEG-3。将SPF级裸鼠(4~5周龄)30只随机分为F10过表达组、F10沉默组和未处理组各10只,分别接种F10基因过表达的JEG-3细胞、F10基因沉默的JEG-3细胞和未处理的JEG-3细胞。于接种5周后处死裸鼠取皮下肿瘤,采用免疫组织化学法和Western blot法检测各组瘤体组织中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)、基质金属蛋白酶组织抑制物-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase,TIMP-1),血浆纤溶酶原激活物抑制因子(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)等侵袭相关蛋白酶的表达,并进行比较。结果免疫组织化学结果显示,F10过表达组成瘤组织中MMP-2、MMP-8、MMP-11、MMP-16、MMP-19蛋白表达水平(0.332±0.037、0.473±0.089、0.441±0.031、0.470±0.040、0.548±0.062)高于未处理组(0.209±0.021、0.314±0.108、0.207±0.025、0.400±0.057、0.466±0.038)和F10沉默组(0.049±0.013、0.168±0.034、0.149±0.024、0.240±0.024、0.175±0.029)(P0.05),未处理组高于F10沉默组(P0.05);F10过表达组TIMP-1(0.191±0.027)和PAI-1蛋白(0.130±0.020)表达水平低于未处理组(0.249±0.036、0.284±0.020)和F10沉默组(0.310±0.018、0.463±0.115)(P0.05),未处理组低于F10沉默组(P0.05)。wesrern blot检测结果显示,上述侵袭相关蛋白酶在3组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 F10通过上调MMP-2、MMP-8、MMP-11、MMP-16、MMP-19表达,下调TIMP-1、PAI-1表达,促进绒癌细胞增殖、侵袭和转移。     

MMP-2基因对前列腺癌细胞恶性表型的影响及其机制研究

目的探讨基质金属蛋白酶2(MMP-2)基因对前列腺癌细胞恶性表型的影响及其机制。方法 Western blot和RT-PCR检测人正常前列腺上皮RWPE-1细胞和前列腺癌PC3细胞中MMP-2的表达情况;以脂质体Lipfectamine 2000将MMP-2 siRNA和MMP-2 control质粒分别转染至siRNA MMP-2组和siRNA control组细胞中,以不做处理的细胞为对照组。Western blot和RT-PCR检测其转染效果;CCK-8法检测细胞增殖;Transwell法检测细胞的侵袭和迁移;FCM检测细胞凋亡;Western blot检测细胞中血管内皮生长因子(VEGF)和Cleaved Caspase-8蛋白的表达。结果与RWPE-1细胞相比,PC3细胞中MMP-2蛋白和mRNA的表达水平显著升高(P0.05)。MMP-2在siRNA MMP-2组细胞中的蛋白和mRNA表达显著低于对照组(P0.05),而siRNA control组与对照组间MMP-2的蛋白和mRNA表达水平差异无显著性(P0.05)。siRNA MMP-2组细胞的OD值、侵袭细胞数、迁移细胞数和VEGF蛋白的表达水平显著下降,而细胞凋亡率和Cleaved Caspase-8蛋白水平显著升高,差异均显著性(P0.05);对照组和siRNA control组间OD值、侵袭细胞数、迁移细胞数、细胞凋亡率、VEGF和Cleaved Caspase-8蛋白表达均未见显著差异(P0.05)。结论 MMP-2在前列腺癌PC3细胞中高表达,干扰其表达可抑制细胞的增殖、侵袭和迁移,并促进细胞凋亡,其作用机制可能与下调VEGF蛋白和上调Cleaved Caspase-8蛋白的表达有关。     

siRNA靶向抑制CXCR4基因表达对鼻咽癌细胞增殖及侵袭的影响及机制研究

目的探讨抑制鼻咽癌细胞趋化因子受体-4(CXCR4)基因表达对癌细胞增殖、侵袭的影响及机制。方法回顾性收集鼻咽癌42例临床资料及相应的癌旁组织。RT-PCR和Western bloting分别检测鼻咽癌及相应的癌旁组织中CXCR4基因的mRNA及蛋白表达;人鼻咽癌细胞系CNE-2Z分为空白组(细胞未做任何处理)、NC-siRNA组(细胞转染无义siRNA序列)和CXCR4-siRNA组(细胞中转染CXCR4的靶向siRNA序列)。转染48 h后Western bloting检测各组细胞中CXCR4、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期素D1(Cyclin D1)蛋白表达;CCK8实验和Transwell小室分别检测细胞的增殖及侵袭能力。结果鼻咽癌中CXCR4基因的mRNA及蛋白表达均显著高于癌旁组织(P0.01);转染CXCR4-siRNA组后CXCR4的蛋白表达显著降低;NC-siRNA组细胞存活率、细胞侵袭数及MMP-2、MMP-9、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达与空白组差异无统计学意义(P0.05);CXCR4-siRNA组细胞存活率、细胞侵袭数及MMP-2、MMP-9、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达均显著低于空白组(P0.01)。结论抑制鼻咽癌细胞CXCR4基因表达可显著降低癌细胞的增殖与侵袭能力,其机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。     

上调NDRG1基因表达对人胰腺癌细胞MMP-9、VEGF表达及侵袭和迁移的影响

目的：建立稳定转染含N-myc下游调节基因-1（NDRG1）的SW1990细胞株,探讨NDRG1对 SW1990细胞侵袭与迁移能力的影响及其可能的分子机制。方法经脂质体介导将含有 NDRG1重组表达质粒转染人胰腺癌细胞株 SW1990,用 G418筛选阳性细胞克隆,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot鉴定阳性细胞克隆;采用RT-PCR及Western blot检测阳性细胞克隆MMP-9及VEGF mRNA与蛋白表达;采用Transwell小室侵袭实验与划痕实验分别检测细胞侵袭及迁移能力。结果 N17克隆组、转空载体组及未转染组NDRG1 mRNA表达量分别为0.53±0.25、0.26±0.11、0.25±0.13;相应的MMP-9 mRNA表达量分别为0.33±0.18、0.71±0.45、0.76±0.42;相应的VEGF mRNA表达量分别为0.27±0.16、0.68±0.36、0.69±0.38;相应的NDRG1蛋白表达量分别为0.27±0.13、0.11±0.04、0.12±0.06;相应的MMP-9蛋白表达量分别为0.12±0.04、0.38±0.15、0.36±0.14;相应的VEGF蛋白表达量分别为0.15±0.08、0.39±0.21、0.40±0.25。较其他组,N17克隆组NDRG1 mRNA及蛋白表达量显著增加（P〈0.01）,而MMP-9、VEGF mRNA及蛋白表达量显著降低（P〈0.01）。N17克隆组、转空载体组及未转染组微孔滤膜外侧细胞数分别为31.27±11.54、58.93±17.23、60.26±19.38,N17克隆组较其他组微孔滤膜外侧细胞数显著减少（P〈0.01）。N17克隆组、转空载体组及未转染组细胞迁移距离分别为51.35±18.24、120.68±42.97、124.54±51.66,N17克隆组较其他组细胞迁移距离显著减少（P〈0.01）。结论 SW1990细胞NDRG1表达上调后,细胞侵袭和迁移能力受到显著抑制,其作用机制可能与MMP-9及VEGF表达降低有关。     

miR-381靶向HMGB1抑制子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移

目的探究miR-381调控高迁移率组蛋白1(HMGB1)对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法采用qRT-PCR检测miR-381在子宫内膜癌细胞和正常子宫内膜细胞中的表达水平。转染miR-381mimic后,检测HEC1A细胞中miR-381和HMGB1的表达水平。生物信息学预测miR-381和HMGB1的靶向关系,并用荧光素酶报告实验加以验证。细胞分为HEC1A组、miR-381mimic组、pc-HMGB1组、mimic+pc-HMGB1组,采用CCK8法检测HEC1A细胞增殖能力,Transwell和划痕实验分别检测HEC1A细胞侵袭和迁移能力,蛋白印迹法检测HEC1A细胞中Ki67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9的表达水平。结果 miR-381在正常子宫内膜细胞和癌细胞中存在表达差异。miR-381与HMGB1具有直接的靶向关系。与HEC1A组相比,miR-381组细胞增殖倍数、侵袭细胞数、划痕闭合率、Ki67、PCNA、N-cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9的表达均降低(P0.01),E-cadherin表达则增加(P0.01),pc-HMGB1组上述指标则相反(P0.01);与pc-HMGB1组相比,miR-381mimic+pc-HMGB1组细胞增殖倍数、侵袭细胞数、划痕闭合率、Ki67、PCNA、N-cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9的表达均降低(P0.01),E-cadherin表达增加(P0.01)。结论 miR-381通过靶向下调HMGB1表达,抑制HEC1A细胞增殖、侵袭和迁移。     

Caveolin-1与鼻咽癌细胞侵袭转移能力的相关性研究

目的:观察Caveolin-1(CAV-1)基因在鼻咽癌细胞株5-8F和6-10B的表达,初步探讨其与鼻咽癌细胞株侵袭转移能力的关系.方法:(1)荧光定量PCR(quantitative RT-PCR,qRT-PCR)检测CAV-1在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B和永生化鼻咽癌上皮细胞株NP69中的表达情况.(2)用免疫组化检测其在细胞株5-8F和6-10B在组织中的表达情况.结果:(1)qRT-PCR结果显示CAV-1在5-8F细胞株中的表达高于在6-10B中的表达,差异有统计学意义(P=0.014).(2)免疫组织化学结果CAV-1在5-8F和6-10B组织中也明显差异.结论:CAV-1在5-8F细胞和组织中高表达可能和其高侵袭,高转移能力相关.     

TIGAR调节肺癌细胞的增殖和侵袭能力研究

目的探讨P53下游基因TIGAR在肺癌细胞A549增殖、迁移及侵袭中的作用。方法采用siRNA技术在A549细胞中干扰TIGAR的表达,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖,小室法检测细胞迁移,肿瘤细胞侵袭实验检测细胞侵袭,免疫印迹杂交检测相关蛋白水平变化。结果在A549细胞中成功干扰TIGAR后,细胞增殖显著降低(P0.05),细胞迁移和侵袭能力显著减弱,侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达量均下调。结论 TIGAR促进肺癌细胞A549的增殖,并促进细胞的迁移和侵袭能力。     

微小RNA-150-5p抑制鼻咽癌细胞恶性增殖及增强放疗敏感性的作用研究

目的 探讨微小RNA-150-5p(miR-150-5p)在鼻咽癌组织中的表达水平及其对癌细胞增殖和放疗敏感性的影响。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞中miR-150-5p的表达水平。常规培养鼻咽癌细胞CNE2进行miR-150-5p mimic转染,分为对照组(NC组)和miR-150-5p过表达组(miR-150-5p mimic组)。采用MTT实验检测各组CNE2细胞的增殖能力;采用流式细胞仪检测各组CNE2细胞的凋亡情况;采用Western blot检测各组细胞中磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(pPI3K)、磷酸化蛋白激酶B(pAKT)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(pmTOR)的表达。结果 miR-150-5p在鼻咽癌组织中的表达水平为(0.74±0.39),低于癌旁组织中的(1.44±0.54),差异有统计学意义(t=8.140,P<0.001)。转染48 h后,miR-150-5p mimic组CNE2细胞中miR-150-5p的表达水平为(6.31±1.20),高于NC组中的(1.00±0.08),差异有统计学意义(t=7....     

沉默RORα通过Wnt信号通路促进人胃癌细胞增殖与迁移侵袭

目的:在构建沉默RORα人胃癌MGC803细胞的基础上,观察沉默RORα对MGC803细胞增殖与迁移侵袭的影响。方法:软琼脂集落形成实验、流式细胞术、细胞迁移和侵袭实验检测RORα沉默对MGC803细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭能力的影响。RT-PCR与Western blot检测RORα、Wnt1、MMP-9与TIMP3 m RNA与蛋白表达。结果:集落形成实验显示,沉默组的集落形成率128.1%明显高于对照组和空载体组(P0.05)。流式细胞术显示,沉默组S期细胞百分率39.9%较对照组26.1%和空载体组27.4%明显增加(P0.05)。迁移实验显示,沉默组迁移距离(1.76±0.19)mm明显高于对照组(1.32±0.14)mm和空载体组(1.29±0.17)mm(P0.05)。侵袭实验显示,沉默组穿膜细胞(172±27)个明显多于对照组(147±17)个和空载体组(149±14)个(P0.05)。RT-PCR与Western blot表明,沉默RORα可显著上调Wnt1与MMP-9 m RNA与蛋白与下调RORα与TIMP3 m RNA与蛋白。结论:沉默RORα可通过Wnt信号通路上调MMP-9和下调TIMP3促进MGC803细胞增殖与迁移侵袭。     

干扰miR-21调控人前列腺癌 细胞株PC-3增殖、迁移及侵袭的实验研究

目的观察干扰微小RNA-21(miR-21)对人前列腺癌细胞株PC-3增殖、迁移及侵袭的影响,并初步探讨其调控机制。方法收集对数期生长PC-3细胞株及人前列腺正常上皮细胞株RWPE-1,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测并对比其miR-21基因表达情况。取对数期生长PC-3细胞株,采用脂质体转染法将miR-21抑制剂(inhibitor)及NC inhibitor质粒转染至PC-3细胞,分别设为干扰组和空载组,另取不做处理PC-3细胞为空白组。采用倒置荧光显微镜检测转染效率;采用MTT法检测并对比各组不同时刻吸光度(OD值);采用划痕试验及Transwell试验检测并对比三组穿膜细胞数及迁移率;采用RT-PCR法检测并对比三组miR-21、基质金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP3)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因表达水平;采用蛋白免疫印迹法检测并对比三组TIMP3、MMP-9蛋白表达水平。结果 PC-3细胞miR-21相对表达量显著低于RWPE-1细胞(P 0. 05);倒置显微镜下检测转染24 h后干扰组和空载组转染效率分别为(82. 16±8. 20)%、(80. 23±8. 69)%;干扰组MTT实验不同时刻OD值均显著低于空白组和空载组(P 0. 05),空白组与空载组比较,差异均无统计学意义(P 0. 05),三组MTT实验OD值均随时间延长呈显著升高趋势(P 0. 05);干扰组12 h、24 h迁移率均显著低于空白组和空载组(P 0. 05),空白组与空载组比较,差异均无统计学意义(P 0. 05),三组24 h迁移率显著高于12 h(P 0. 05);干扰组穿膜细胞数显著少于空白组和空载组(P 0. 05),空白组与空载组比较,差异均无统计学意义(P 0. 05);干扰组miR-21相对表达量、MMP-9 mRNA和蛋白相对表达量显著低于空白组和空载组(P 0. 05),空白组与空载组比较,差异均无统计学意义(P 0. 05);干扰组TIMP3 mRNA和蛋白相对表达量显著高于空白组和空载组(P 0. 05),空白组与空载组比较,差异均无统计学意义(P 0. 05)。结论前列腺癌细胞miR-21异常高表达,干扰miR-21可抑制人前列腺癌细胞株PC-3增殖、迁移及侵袭能力,可能与上调TIMP3 mRNA和蛋白、下调MMP-9 mRNA和蛋白有关。     

Rap1GAP基因表达上调对HL-60细胞体内及体外侵袭能力的影响

目的 探讨上调Rap1 GAP基因表达对白血病细胞株HL-60细胞体外侵袭能力的影响,并构建白血病动物模型验证体外实验的结果.方法 采用实时定量PCR及Western blot法检测已构建的Venus/HL-60细胞(空载体对照组)及Rap1 GAP过表达单克隆细胞株Rap1 GAP/HL-60 (R1、R2)细胞的Rap1GAP表达水平,Transwell方法检测空载体对照组、R1、R2细胞的体外侵袭能力,实时定量PCR检测各组细胞MMP-9 mRNA表达,并通过明胶酶谱法检测MMP-2及MMP-9活性;将4周龄BALB/c裸鼠进行预处理后接种白血病细胞,观察各组裸鼠生存时间及白血病细胞在其脏器中的浸润情况.结果 R1、R2细胞的Rap1GAP表达水平分别为空载体对照组的16.2、17.3倍,侵袭率分别为(55±5)％、(59±4)％,显著高于空载体对照组的(14±4)％(P值均＜0.001).R1和R2细胞的MMP-9 mRNA表达水平增加,约为空载体对照组的12.0倍.动物模型实验结果显示接种R1细胞裸鼠(R1组)生存时间为(32.00±1.85)d,R2组为(33.37±2.50)d,空载体对照组为(43.62±2.32)d,R1组和R2组裸鼠生存时间较空载体对照组缩短(P＜0.05).R1组和R2组共有3只裸鼠出现脑膜组织浸润,脑膜组织扩增出Rap1GAP和MMP-9基因,空载体对照组裸鼠各脏器白血病细胞浸润不明显.结论 Rap1GAP增强HL-60细胞侵袭能力,同时伴随MMP-9 mRNA表达水平升高,裸鼠体内实验亦证实Rap1GAP提高了HL-60细胞体内侵袭力.     

miR-1225-5p靶向调控S100A9抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

目的探讨miR-1225-5p对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肝癌细胞系Huh7、MHCC97H和MHCCLM3及正常肝细胞系THLE-2中miR-1225-5p和S100钙结合蛋白A9(S100A9)mRNA表达水平。采用Western blot试验检测S100A9的表达水平。以Huh7细胞作为研究对象,分别转染miR-1225-5p模拟物(mimics)、S100A9的小干扰RNA至Huh7细胞,四甲基噻唑蓝染色法检测miR-1225-5p过表达或下调S100A9表达对Huh7细胞增殖的影响,Transwell检测miR-1225-5p过表达或下调S100A9表达对Huh7细胞迁移和侵袭的影响,Western blot试验检测miR-1225-5p过表达或下调S100A9表达对Huh7细胞细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、p27、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9、MMP-14蛋白表达的影响。生物信息学软件预测S100A9的3′非翻译区中含有与miR-1225-5p互补的核苷酸序列,双荧光素酶报告基因试验验证miR-1225-5p与S100A9的靶向关系。结果与正常肝细胞THLE-2比较,肝癌细胞系Huh7、MHCC97H和MHCCLM3中miR-1225-5p表达水平均降低,差异均有统计学意义(P0.05),S100A9mRNA和S100A9表达水平均升高,差异均有统计学意义(P0.05)。过表达miR-1225-5p或下调S100A9表达均可抑制Huh7细胞增殖、迁移和侵袭,以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表达(P0.05),促进p21和p27蛋白的表达(P0.05)。miR-1225-5p在Huh7细胞中负调控S100A9表达,过表达S100A9逆转了miR-1225-5p过表达对Huh7细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。结论 miR-1225-5p过表达可能通过下调S100A9的表达抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。     

E2F1对食管癌细胞株ECA109生物学功能的影响及机制

目的探讨E2F1对食管癌细胞株生物学功能的影响及其调控机制。方法食管癌细胞株ECA109分为ECA109阴性对照组(对照组)、ECA109空载体组(空载体组)和ECA109-E2F1过表达组(过表达组)。对照组仅行电转染不加入质粒载体,空载体组电转染不携带E2F1基因的质粒载体,过表达组电转染E2F1过表达质粒载体。质粒转染48h后,3组采用荧光倒置显微镜观察绿色荧光的表达情况,采用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况,采用PCR检测转录因子E2F1、KB抑制蛋白激酶(I kappa B kinase,IKK)、IKKβ、核转录因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)和survivin mRNA表达情况,采用Western blot法检测E2F1、IKKα、IKKβ、NF-κB、survivin蛋白表达情况。结果过表达组绿色荧光蛋白表现为针尖状,呈强阳性表达,空载体组绿色荧光蛋白表达呈阳性,对照组未见绿色荧光蛋白表达;转染48h后,过表达组G1期细胞比例与空载体组和对照组比较差异无统计学意义(P0.05);过表达组G2期细胞比例[(9.30±4.45)%]和早期凋亡率[(16.50±3.21)%]明显低于空载体组[(18.16±1.25)%、(31.70±5.56)%]和对照组[(17.60±4.42)%、(31.46±2.73)%](P0.05),S期细胞比例[(35.66±2.99)%]明显高于空载体组[(28.86±1.80)%]和对照组[(29.83±1.84)%](P0.05);空载体组与对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染48h后,过表达组E2F1mRNA(1.79±0.18)和蛋白(0.535±0.003)、IKKβmRNA(0.20±0.06)和蛋白(0.394±0.044)、NF-κB mRNA(4.64±0.55)和蛋白(0.043±0.001)、survivin mRNA(2.98±0.20)和蛋白(0.039±0.001)表达水平明显高于对照组[E2F1 mRNA和蛋白(1.00±0.00、0.217±0.009)、IKKβmRNA和蛋白(1.00±0.00、0.217±0.021)、NF-κB mRNA和蛋白(1.00±0.00、0.014±0.002)、survivin mRNA和蛋白(1.00±0.00、0.027±0.003)]和空载体组[E2F1mRNA和蛋白(0.95±0.03、0.212±0.020)、IKKβmRNA和蛋白(0.99±0.05、0.188±0.018)、NF-κB mRNA和蛋白(0.99±0.03、0.019±0.001)、survivin mRNA和蛋白(0.95±0.03、0.025±0.002)](P0.05),IKKαmRNA(0.60±0.14)和蛋白(0.614±0.050)表达水平低于对照组(1.00±0.00、0.817±0.055)和空载体组(0.96±0.02、0.733±0.036);对照组与空载体组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 ECA109细胞株中E2F1与survivin存在表达调控关系,E2F1对survivin的表达调控通过激活NF-κB的经典激活通路,导致了survivin的转录激活。     

卵泡抑素样蛋白5对HCCLM3细胞迁移和侵袭的影响

目的探讨卵泡抑素样蛋白5(follistatin-like 5,FSTL5)在不同肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞株中的表达及在HCCLM3细胞迁移、侵袭中的作用。方法取对数生长期HCC细胞(SMMC-7721、HepG2、HCCLM3、MHCC97H、PLC)和永生化正常肝上皮细胞LO2,采用实时荧光定量PCR法检测FSTL5mRNA相对表达量。将对数生长期HCCLM3细胞随机分为转染组和对照组,转染组转染FSTL5的表达质粒,对照组转染空白质粒;转染24h,采用实时荧光定量PCR法检测2组HCCLM3细胞FSTL5mRNA相对表达量,划痕愈合试验检测HCCLM3细胞迁移能力,Transwell小室法检测HCCLM3细胞侵袭能力,三维培养实验检测HCCLM3细胞伪足生长情况。结果FSTL5mRNA相对表达量在SMMC-7721(0.37±0.03)、HepG2(0.43±0.03)、HCCLM3(0.19±0.02)、MHCC97H(0.28±0.02)、PLC细胞(0.35±0.01)均低于LO2细胞(1.04±0.04)(P0.05),且在HCCLM3细胞表达量最低(P0.05);转染24h,转染组HCCLM3细胞FSTL5mRNA相对表达量(12.04±1.42)明显高于对照组(1.00±0.25)(P0.05),划痕愈合率[(24.7±2.4)%]、侵袭细胞数目[(11.7±2.3)%]均明显低于对照组[(86.7±3.7)%、(34.7±5.9)%](P0.05);三维培养实验结果显示,转染组HCCLM3细胞克隆球未见伪足生成,对照组可见少量伪足生成且延展性较好。结论 HCC细胞(SMMC-7721、HepG2、HCCLM3、MHCC97H、PLC)中FSTL5表达明显降低,过表达FSTL5可抑制HCCLM3细胞迁移和侵袭。