c-raf-1反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞放射敏感性的影响

目的　探讨癌基因 c- raf- 1的反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞放射敏感性的影响。方法　设立 c- raf- 1正义寡核苷酸组和非处理组 (仅加入等量的脂质体 )作对照 ,用 RT- PCR检测卵巢癌细胞处理前后 c- raf- 1表达水平的变化。用平板克隆形成试验检测人卵巢癌细胞株 SKOV3在脂质体 - c- raf- 1反义寡核苷酸作用前后受 6 0 Coγ射线不同剂量照射后的集落形成率。结果　 c- raf- 1反义寡核苷酸能抑制 c- raf- 1癌基因的表达 ,经脂质体介导的 c- raf- 1反义寡核苷酸作用的卵巢癌细胞经γ射线照射后其集落形成率较转染正义寡核苷酸组及单纯照射组明显下降 (P<0 .0 1) ,而转染 c- raf- 1正义寡核苷酸组的集落形成率与单纯照射组相比无明显差异 (P>0 .0 5 )。结论　 c- raf- 1反义寡核苷酸通过抑制 c- raf- 1的表达降低人卵巢癌细胞株 SKOV 3放射抗拒性。该作用可能与 c- raf- 1反义寡核苷酸抑制了引起细胞辐射抗拒的细胞信号转导途径有关     

Survivin反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞凋亡的影响

目的:采用survivin反义寡核苷酸(ASODN)封闭骨肉瘤细胞survivin的作用,观察其对骨肉瘤细胞系MG63增殖和凋亡的影响。方法:以脂质体为载体,介导survivin反义寡核苷酸转染人骨肉瘤细胞系MG63,用MTT法测定细胞增殖;流式细胞仪检测转染survivin反义寡核苷酸后细胞凋亡率;Westernblot及半定量RTPCR检测转染survivin反义寡核苷酸后的骨肉瘤细胞survivin蛋白及mRNA表达。结果:脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染骨肉瘤细胞系MG63后,细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡率明显增加,骨肉瘤细胞survivin蛋白及mRNA表达均明显降低。结论:脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸可以抑制细胞增殖,有效降低细胞内survivin基因的表达,促进细胞凋亡。     

反义c-myc寡核苷酸对骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响

目的研究反义c-myc寡核苷酸（c-mycASODN）对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响。方法设计c—mycASODN片段，转染入人骨肉瘤MG-63细胞，通过MTT检测、HE染色光镜观察、透射电镜超微结构及流式细胞仪（FCM）分析，观察和分析其对瘤细胞体外增殖、凋亡、细胞周期及c-myc基因蛋白的影响。结果MTT示c—mycASODN可抑制人骨肉瘤MG-63细胞的体外增殖，10．0μmol／L、作用48h效果最明显，形态学观察到典型瘤细胞凋亡特征，流式细胞仪分析证实反义c—myc寡核苷酸主要阻止瘤细胞进入S期，出现明显的凋亡峰，凋亡率达36.82％，并可抑制c-myc基因蛋白的表达。结论反义c-myc寡核苷酸可诱导人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡，对瘤细胞的增殖有抑制作用。     

反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞MTA1基因表达及侵袭性影响的研究

目的:合成人肿瘤转移相关基因(MTAl)的反义脱氧寡核苷酸,观察其转染后对人骨肉瘤MG-63细胞系中MTA1表达及骨肉瘤侵袭性的影响.方法:免疫细胞染色观察人工合成正义、反义及无意义MTA1基因片段转染人骨肉瘤细胞MG-63后,人肿瘤转移相关基因的表达;RT-PCR和蛋白质印迹法检测MTA1基因mRNA和蛋白质表达水平的变化;Boyden小室体外侵袭实验检测转染前后细胞侵袭力的变化.结果:反义寡核苷酸处理骨肉瘤细胞后,MTA1 mRNA的表达下降(吸光度之比为25.09±0.21),与正义链组、无意义链组和空白对照组(35.19±0.17、33.20±0.23和37.17±0.18)相比差异有统计学意义,P<0.05.Boy-den小室体外侵袭实验检测显示,反义寡核苷酸处理后骨肉瘤细胞的透膜能力明显下降.结论:MTA1同骨肉瘤的转移能力密切相关,反义寡核苷酸的转染可阻遏骨肉瘤细胞中MTA1的表达,并因此有可能限制骨肉瘤的侵袭和转移.     

反义血管内皮生长因子对食管癌细胞体外放射增敏作用

[目的]研究TE-1细胞转染VEGF反义寡核苷酸，观察转染后肿瘤细胞VEGF表达情况及其对放射敏感性的影响。[方法]将反义VEGF寡核苷酸经Lipofectamine^TM2000介导转染TE-1细胞；并经γ线照射。采用MTT法检测细胞生长状况，RT-PCR、Western blotting检测细胞照射前后VEGF基因的表达，流式细胞术检测细胞周期分布情况和凋亡率；克隆形成实验反映转染后细胞放射敏感性的变化。[结果]将反义VEGF寡核苷酸成功地转染人食管癌TE-1细胞中，VEGF表达水平明显降低，体外增殖反应无明显差异，细胞周期分布情况相似．未见明显凋亡发生。不同剂量照射后增殖情况无统计学差异；反义组细胞凋亡率略有上升．转染反义组细胞较未转染组细胞放射敏感性增加。[结论]转染反义VEGF寡核苷酸可抑制食管癌TE-1细胞VEGF表达，联合放射治疗，对TE-1细胞增殖无明显作用，而其放射敏感性有增强作用。     

端粒酶RNA反义寡核苷酸对白血病细胞K562增殖的影响

目的：探讨人类端粒酶RNA的反义寡核苷酸对K562细胞增殖的影响。方法：采用MTT和试验和平板集落形成实验观察反义寡核苷酸作用后K562细胞的生长情况，采用流式细胞仪分析细胞周期的改变，采用电镜观察细胞超微结构的改变，用PCR－ELISA分析细胞端粒酶活性的改变。结果：端粒酶RNA的反义寡核苷酸作用K562细胞后，细胞超微结构和细胞周期发生明显改变。端粒酶活生到明显抑制，细胞增殖受到明显抑制。结论：靶向于端粒酶RNA的反义寡核苷酸抑制白血病细胞K562的增殖。     

骨肉瘤miR-96的表达与细胞增殖和凋亡

背景与目的:微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性的非编码小分子RNA,其主要通过与靶mRNA作用抑制转录后的翻译。miR-96是在多类肿瘤细胞中高表达的小RNA分子。本研究旨在检测miR-96在骨肉瘤组织中的表达,并研究其在骨肉瘤细胞的增殖、细胞周期及凋亡中的意义。方法:运用TagMan MGB探针法检测40例骨肉瘤组织及对应的骨组织中miR-96的表达;应用反义技术降低骨肉瘤细胞(U2-OS和MG-63)中miR-96的表达;采用MTT比色法检测细胞增殖的改变;应用流式细胞技术检测骨肉瘤细胞细胞周期和凋亡情况。结果:在40例骨肉瘤组织中,62.5%(25/40)的骨肉瘤组织miR-96表达明显高于对应骨组织(P<0.05);反义miR-96转染骨肉瘤细胞U2-OS和MG-63后,miR-96的表达明显降低,U2-OS和MG-63骨肉瘤细胞生长受到明显抑制,其生长主要停滞在G0/G1期,而S期和G2/M期细胞的比例下降。另外,降低miR-96的表达,U2-OS和MG-63骨肉瘤细胞早期凋亡明显增加。结论:miR-96在骨肉瘤组织中表达明显上调,降低其表达能明显抑制U2-OS和MG-63骨肉瘤细胞的生长,并诱导细胞早期凋亡增加,miR-96可能成为骨肉瘤基因表达调控的新靶点。     

caspase-6基因诱导成骨肉瘤细胞凋亡

目的：探讨caspase6对成骨肉瘤细胞株的凋亡诱导作用。方法：应用RTPCR方法检测成骨肉瘤细胞株SOSP9607中caspase6基因的表达水平。以腺病毒adv5作载体，构建含caspase6基因的转基因载体，用脂质体包裹法转染SOSP9607细胞株， 用RTPCR方法检测转染后SOSP9607细胞中caspase6基因的表达。用MTT法检测转染caspase6对SOSP9607细胞株生长的影响。结果：成骨肉瘤细胞株SOSP9607中未检出caspase6表达。RTPCR法证实转染caspase6后SOSP9607中caspase6表达显著增强，MTT检测显示对SOSP9607细胞的生长有抑制作用，形态学观察及DNA电泳证实转染后的细胞株存在细胞凋亡特征。结论：caspase6对成骨肉瘤细胞的生长有抑制作用，并可诱导成骨肉瘤细胞凋亡。     

小鼠DOC-1R反义重组载体的构建及表达的研究

背景与目的：DOC－1R（deleted in oral cancer-1 related）基因是一个候选的抑癌基因,它与CDK2特异性结合后,抑制CDK2与cyclin形成复合物,进而对细胞周期进行调控。本研究拟构建DOC－1R反义重组质粒,并研究该基因表达受到抑制后对正常细胞增殖产生的影响。方法：小鼠DOC－1R基因筛选后构建pcDNA3-DOC-1R反义重组质粒,经细胞转染,通过细胞增殖能力测定、软琼脂培养观察DOC－1R对细胞生长状态的影响。结果：小鼠DOC－1R基因转染的NIH3T3细胞较空载体转染的细胞生长速度有较明显的差异。正义重组体pcDNA3-DOC-1R^ 可明显抑制细胞增殖,而反义重组体pcDNA3-DOC-1R^-则促进细胞的增殖。在软琼脂培养中,正义重组体在软琼脂培养基中成集落能力下降,一方面克隆形成率下降,另一方面形成的集落也普遍较小;而反义重组体明显增加了成集落能力,克隆形成率也较正义重组体有明显的增加。结论：小鼠DOC－1R基因可明显抑制细胞的生长速度和成集落能力,这一作用有助于进行正常细胞生长、增殖规律和肿瘤治疗、预防方面的研究。     

反义寡核苷酸抑制survivin基因表达及肝癌细胞生长的研究

目的:采用反义寡核苷酸抑制肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其对肝癌细胞生长的作用.方法:采用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,Western blot及原位杂交方法检测survivin蛋白及mRNA表达,流式细胞仪检测凋亡细胞比率,检测转染前后细胞贴壁率变化,并绘制细胞生长曲线.结果:survivin反义寡核苷酸转染后,肝癌细胞survivin蛋白及mRNA表达均显著降低,细胞贴壁率显著降低,细胞增殖活性明显受抑,细胞凋亡率显著增加.结论:survivin反义寡核苷酸转染可以有效降低细胞内survivin基因的表达,诱导细胞发生凋亡,抑制肝癌细胞生长.     

Stathmin基因在人成骨肉瘤细胞中的表达及意义

stathmin作为细胞信号转导分子在细胞分化及恶性肿瘤发生、发展上发挥重要作用。本研究旨在探讨Stathmin基因在人成骨肉瘤细胞中的表达,并探讨阻断其表达对该肿瘤细胞的生物学行为的影响。方法：RT-PCR及原位杂交法检测2个人成骨肉瘤细胞系及45例人成骨肉瘤组织中Stathmin基因表达情况;以高表达Stathmin基因的人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607为靶细胞、反义Stathmin(ASODN)为阻断剂,通过MTT实验观察ASODN对该细胞系的生长抑制作用,并用流式细胞仪分析其对细胞增殖周期的影响。     

胸大肌瓣加原位皮片移植修复鼻咽癌放疗后颈部复发的术后缺损

目的:胸大肌皮瓣是头颈部术后缺损常用的修复皮瓣,但由于它的臃肿常导致术后较高的并发症发生。本文将介绍我院采用胸大肌皮瓣去脂、原位皮片植皮在鼻咽癌放疗后颈部复发术后皮肤缺损修复中的应用。方法:对2007年1月-2012年1月就诊中山大学肿瘤防治中心的8例鼻咽癌根治性放疗后颈部复发侵犯颈部皮肤及皮下组织患者,采用胸大肌皮瓣去脂、原位皮片植皮修复颈部大面积皮肤及皮下组织缺损。常规取胸大肌皮瓣,切除皮瓣的皮肤及皮下脂肪,从切除的皮肤中获取表皮和真皮层植皮在胸大肌上,打包7天。结果:皮瓣大小6cm×9cm-6cm×15cm,常规测量切除的皮下脂肪厚度,平均15.13mm(n=8)。所有皮瓣及移植皮片均存活良好,所有患者对术后供区、受区外观满意。结论:本方法简便易行,创伤小,成活率高,改善胸大肌皮瓣臃肿的同时修复了颈部皮肤缺损,不仅能恢复功能,还有较好的外形。     

Gadd45介导抑癌基因BRCA1诱导的G2/M期阻滞

目前已经肯定,抑癌基因BRCAl是细胞周期监测点调控的重要因子,但BRCAl在细胞周期阻滞中的作用机制尚不完全清楚。本研究的目的是探讨Gadd45在BRCAl诱导的细胞周期阻滞中所起的作用。     

BLCAP基因cDNA的克隆及siRNA表达载体的构建

目的：克隆BLCAP基因cDNA并构建和鉴定针对于BLCAP基因的siRNA真核表达载体.方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得BLCAP基因.将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定.将合成的siRNA核酸片段退火形成双链后连接到经BamHI和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1真核表达载体,命名为pSilencer4.1-B1以及pSilencer4.1-B2,并进行酶切及测序鉴定.脂质体法转染SOSP-9607细胞系,G418筛选以及RT-PCR验证构建的真核表达载体对目的基因的干涉情况.结果：经酶切及测序鉴定,所获得的目的片段序列BLCAP基因完全相符.重组质粒中含有与理论值相符的插入片段,其测序结果与设计序列一致.经脂质体法转染后pSilencer4.1-B2可明显抑制SOAP-9607细胞的BLCAP表达.结论：成功克隆了BLCAP基因并cDNA构建和验证了其siRNA真核表达载体.     

人NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞恶性表型的逆转作用

目的:探讨NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞恶性表型的逆转作用及其在肿瘤基因治疗中的价值。方法:将构建好的人NHE1反义基因真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中,观察NHE1反义基因转染后SGC-7901胃癌细胞的细胞形态学、NHE1蛋白表达、体外生长增殖特性、双层软琼脂集落形成能力的变化。结果:NHE1反义基因转染的SGC-7901胃癌细胞形态恶性程度降低,NHE1蛋白表达明显减少,双层软琼脂集落形成能力、体外生长增殖能力降低,接触抑制恢复,细胞凋亡率增加。结论:NHE1反义基因转染能使SGC-7901胃癌细胞的NHE1蛋白表达明显下调并逆转其恶性表型,提示NHE1基因可成为肿瘤治疗的新靶点,具有一定的临床应用前景。     

The effect of epidermal growth factor receptor antisense morpholino oligomer on non-small cell lung cancer cell line

Overexpression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) has been identified as a common component of various cancer types including lung cancer. Recently morpholino oligonucleotides appeared as a promising modification for antisense applications with few toxic effects and their stability. We investigated the effect of EGFR antisense morpholino oligomer on non-small cell lung cancer (NSCLC) cell line by evaluating EGFR mRNA, protein product and cell proliferation. The EGFR antisense morpholino oligomer was designed to target the translation start site in the EGFR mRNA. The four base-mismatch morphlino oligomer was designed as a control for EGFR antisense morpholino oligomer. These morpholino oligomers were introduced into NCI-H125 cell line which showed overexpression of EGFR. The EGFR mRNA and protein expression were quantified by real time RT-PCR and ELISA, respectively. The significant repression in both EGFR mRNA and protein expression was observed for three days after single treatment with EGFR antisense morpholino oligomer. Furthermore, the growth of NCI-H125 cell line was significantly inhibited with treatment by EGFR antisense morpholino oligomer. Our results indicate that EGFR antisense morpholino oligomer represses the EGFR expression at both mRNA and protein level and inhibits the proliferation of NSCLC cell line suggesting that it may be a promising strategy as one of antisense therapies for NSCLC.     

反义寡核苷酸-萘二酰亚胺偶联物对多药耐药性肿瘤细胞的抑制作用

目的：针对人表皮癌细胞阿霉素耐药株（KB－A－1）的多药耐药性问题,探讨天然反义寡核苷酸与寡核苷酸－萘二酰亚胺偶联物对多药耐工 肿瘤细胞的抑制作用及mdr1基因表达的影响,方法：利用S－烷基化反应成功地合成了反义寡核苷酸－萘二酰亚胺偶联物,并通过MTT法和ELISA法测定天然反义寡核苷酸与寡核苷酸－萘二酰亚胺偶联物对多药耐药物性肿瘤细胞的抑制作用。结果：作用靶点不同的反义寡核苷酸对KB－A－1细胞生长的抑制能力不同。针对mdr1基因翻译起始区的寡核苷酸片段1－4对KB－A－1细胞细胞生长的抑制率分别为13．34％、14．32％、26．00％和25．37％,其中片段3的效果最好（P＜0．01）。与单独使用反义寡核苷酸相比较,萘二酰亚胺对寡核苷酸的共价修饰 提高了反义寡核苷酸对KB－A－1细胞生长的抑制。凝胶电泳实验结果也表明萘二酰亚胺对寡核苷酸的化学修饰能提高寡核苷酸抵逆解的能力。寡核苷酸及寡核苷酸－萘二酰亚胺偶联物专一性地抑制KB－1－A细胞生长,而对非多药耐药性的KB－3－1细胞株无明显影响,是由于寡核苷酸及寡核苷酸－萘二酰亚胺偶联物选择性地抑制mdr1基因表达所致。ELISA法检测结果表明寡核苷酸寡核苷酸－萘二酰亚胺偶联物可使KB－A－1细胞膜表面的mdr1基因表达产物P-gp量降低,并且寡核苷酸－萘二酰亚胺偶联物P－gp表达的程度比天然片段强烈。结论：反义寡核苷酸可专一性地抑制mdr1基因表达,使多药耐性肿瘤细胞生长受到抑制。寡核苷酸与萘二酰亚胺共价偶联能提高天然反义寡核苷酸抑制多药耐性及抵抗核酸酶降解的能力。     

Obstructive effects of ultrasonic microbubble intensifier on CHG-5 cell with survivin antisense oligonucleotides transfection

Objective:To study the effects on human glioma cell line CHG-5 by ultrasonic microbubble intensifier with survivin antisense oligonucleotides (ASODN)transfection. Methods: Antisense oligonucleotides targeting survivin mRNA was designed and synthesized.Four regimen groups were designed,group A:survivin antisense oligonucleotides transfected with ultrasonic microbubble intensifier combined with ultrasound irradiation,group B: survivin antisense oligonucleotides transfected with lipofectamine combined with ultrasound irradiation,group C:survivin antisense oligonucelotides with lipofectamine transfection.group D:blank control.The expression changes of surviving protein were measured by immunohistochemical staining and Western blotting,and MTr assay was used to measure the changes of proliferation.Results:Survivin protein expression in group A was decreased significantly in human glioma cell line CHG-5 than other groups(P＜0.05),and the proliferating rate of CHG-5 in group A was also significantly inhibited(P＜0.05).Conclusion:Ultrasonic microbubble intensifier transfection combined with ultrasound irradiation is a promising method in gene transfection effectively and noninvasively.     

erbB-2 antisense oligonucleotides inhibit the proliferation of breast carcinoma cells with erbB-2 oncogene amplification.

Amplification and overexpression of the erbB-2 oncogene is an unfavourable prognostic marker in human breast cancer and occurs in approximately 25% of breast carcinomas. We used erbB-2 antisense oligonucleotides to inhibit the proliferation of human breast cancer cell lines. erbB-2 antisense oligonucleotides (20 microM) inhibited the growth and DNA synthesis of breast cancer cell lines with an amplified erbB-2 gene by up to 60%. Control complementary sense oligonucleotides did not inhibit cellular proliferation at the same concentration but showed inhibitory effects at higher concentrations. There was no specific effect of erbB-2 antisense oligonucleotides on breast cancer cell lines that had no amplification of erbB-2. erbB-2 antisense oligonucleotides reduced erbB-2 protein levels, measured by immunohistochemistry, in a dose-dependent manner. erbB-2 sense oligonucleotides did not decrease the levels of erbB-2 protein. These data indicate that erbB-2 antisense oligonucleotides induce a specific inhibition of erbB-2 protein expression and that erbB-2 gene overexpression is important for the proliferation of the breast cancer cells that have been selected for erbB-2 amplification.