多发性骨髓瘤患者DAPK的表达及启动子区甲基化状态的研究

目的研究多发性骨髓瘤(MM)患者抑癌基因DAPK的表达及其启动子区甲基化状态,探讨其在MM发生发展中的作用。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术及实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)研究MM患者骨髓单个核细胞DAPK基因启动子甲基化发生率及其mRNA的表达水平。结果 MM患者DAPK基因启动子甲基化阳性率为18.52%,对照组中DAPK基因启动子区甲基化阳性率为0;MM组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。MM组和对照组DAPK mRNA表达情况,差异无统计学意义(P>0.05);MM患者中甲基化组低于非甲基化组;甲基化组、非甲基化组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.0167);MM患者的初治组低于复发组,初治组、复发组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.0167)。结论 DAPK基因启动子区甲基化可能是其mRNA表达的机制之一,并在MM的发病中具有一定的作用。     

结直肠癌中Kiss-1基因启动子甲基化与Kiss-1基因表达的关系

目的：研究结直肠癌中Kiss-1基因启动子甲基化状态对Kiss-1基因表达的影响。方法：应用甲基化特异性PCR （MSP）方法检测73例结直肠癌、正常结直肠组织和人结直肠癌细胞HCT116、SW480、W1116、LoVo中Kiss-1基因启动子甲基化状态,应用realtime-PCR、Western-blot技术检测相应组织和细胞中Kiss-1基因mRNA和蛋白质（Metastine）的表达量。结果：结直肠癌中Kiss-1基因甲基化阳性率（82.19%）高于正常组织（6.31%）（PSW480〉SW1116〉HCT116,差异有统计学意义（p〈0.05）。结论：结直肠癌中Kiss-1基因启动子甲基化可能引起Kiss-1基因表达下调。     

异硫氰酸苯己酯诱导Molt-4细胞p15基因去甲基化及机制研究

研究新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂异硫氰酸苯己酯（PHI）对急性T淋巴细胞性白血病Molt-4细胞p15基因的去甲基化作用及诱导沉默基因重新表达作用,并进一步探讨其作用机制。应用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测PHI作用前后Molt-4细胞株p15基因甲基化状态的变化;半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测Molt-4细胞经过PHI处理后DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、p15基因的mRNA的表达变化;用蛋白免疫印迹（Western blotting）检测Molt-4细胞经过PHI处理后的P15蛋白的表达。结果显示,PHI作用于Molt-4细胞5 d后,p15基因的甲基化程度减弱,p15基因的异常高甲基化现象被逆转,沉默的p15基因重新表达,p15 mRNA、P15蛋白表达增加,并呈浓度依赖性;PHI可下调DNMT1和DNMT3B的mRNA表达（P < 0.05）,而对DNMT3A的mRNA表达作用不明显（P > 0.05）。PHI可能通过抑制DNA甲基转移酶DNMT1和DNMT3B的活性,诱导p15基因产生去甲基化,或者（和）是通过改变p15基因附近组蛋白的乙酰化水平,导致染色体空间结构发生变化,增加转录因子的进入,从而诱导p15基因重新表达。
     

肺癌细胞株抑癌基因启动子甲基化与转录的关系

目的 通过测定3例非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株中7个抑癌基因启动子甲基化与mRNA转录之间的关系,探讨启动子甲基化在NSCLC发生中的作用.方法 应用甲基化特异性的多聚酶链反应(MSP)和RT-PCR分别检测甲基化状态和mRNA的转录水平.结果 肺癌细胞株A549发生甲基化的基因包括p16INK4a、RASSF1α、CDH1、MGMT和CDH13,而DAPK和RAR-β为去甲基化状态;SH-77发生甲基化的基因包括p16INK4a、RASSF1α、CDH1和MGMT,而DAPK、CDH13和RAR-β为去甲基化状态;SPC-A1发生甲基化的基因包括p16INK4a、CDH1、 CDH13和RAR-β,而RASSF1α、MGMT和DAPK为去甲基化状态.RASSF1α、MGMT和RAR-β等3个基因发生甲基化的细胞株其mRNA转录失活,而去甲基化状态的细胞株则存在转录活性.结论 NSCLC细胞株中抑癌基因经常发生启动子CpG岛的甲基化,并且甲基化可能与抑癌基因mRNA转录失活相关.     

脑胶质瘤中Hint1基因甲基化状态与表达的研究

目的探讨脑胶质瘤中Hint1基因启动子区的甲基化与表达情况。方法采用MSP和Western-blit法检测Hint1基因在脑胶质瘤和正常脑组织中甲基化状况及对应表达情况。实时荧光定量PCR的方法检测Hint1 mRNA的表达情况。结果经检测正常脑组织和胶质瘤Hint1基因启动子区域呈非甲基化状态,在83例胶质瘤患者脑组织中Hint1 mRNA的平均表达量为0.5190±0.0280,高于在30例正常脑组织中的平均表达量0.2236±0.0300。Hint1 mRNA的表达量与患者年龄、性别等临床特征无明显相关性而与患者的临床分期密切相关（P〈0.01）。结论脑胶质瘤中Hint1基因启动子区域呈非甲基化状态,其表达程度与患者的临床分期密切相关。     

结直肠癌患者p16基因甲基化的研究

目的检测p16基因启动子区异常甲基化发生情况,探讨p16基因异常甲基化作为结直肠癌临床辅助诊断分子生物学标志物的可能性。方法应用甲基化特异性PCR（MSP）技术,检测结直肠癌患者肿瘤组织中p16基因的异常甲基化情况。结果应用MSP方法,DukesA、B期病人和DLlkes C、D期病人p16启动子区甲基化率分别为23．8%和59．4％。结论分析患者DNA的p16基因异常甲基化有可能成为辅助结直肠癌诊断的有效方法之一。     

肿瘤细胞JWA基因启动子甲基化的初步研究

目的：探讨肿瘤细胞中JWA基因启动子甲基化的状态及其对基因转录活性的影响。方法用报告基因法检测JWA基因启动子甲基化对基因转录活性的影响，用亚硫酸氢盐测序法检测JWA基因启动子CpG岛内的甲基化位点。用甲基化特异性PCR法（methylation specific PCR，MSP）法检测不同肿瘤细胞株（U937、HL60、K562、NB4）以及在白血病患者外周血单个核细胞中JWA基因启动子甲基化的分布。亚硫氢酸盐测序法检测CpG岛内发生甲基化位点。结果用甲基化酶处理报告基因后JWA基因启动子的转录活性明显下降。用亚硫氢酸盐测序法检测肿瘤细胞株中JWA基因启动子CpG岛未发现甲基化的CpG位点。用MSP法检测U937、HL60、K562、NB4肿瘤细胞和白血病患者外周血单个核细胞的DNA样本均未发现肿瘤细胞启动子甲基化。结论JWA基因启动子甲基化可导致肿瘤细胞JWA基因的转录活性下降，但在所检测的肿瘤细胞及白血病细胞中可能无甲基化现象。     

ITP中IFN-γ和IL-4 mRNA表达与其甲基化水平的相关性研究

目的:检测免疫性血小板减少症(ITP)患者的干扰素(IFN)-γ和白细胞介素(IL)-4的mRNA表达水平及其各自基因启动子区DNA甲基化的水平.方法:取36例ITP患者(ITP组)和36例正常对照(对照组)外周血,采用实时定量PCR方法检测IFN-γ和IL-4的mRNA水平;随机抽取2组中的各10例,采用DNA甲基化修饰后测序的方法检测IFN-γ和IL-4基因启动子区的甲基化水平,并计算IFN-γ和IL-4基因的mRNA水平与其基因启动子区DNA甲基化水平的相关性.结果:与对照组相比,ITP组IFN-γ的mRNA水平增高(1.86±0.29 vs 0.83±0.14,P＜0.05),而IL-4的mRNA水平降低(0.78±0.22 vs 1.45±0.40,P＜0.05),Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)比值升高(7.11±0.60vs 3.12±1.88,P＜0.01).2组IFN-γ和IL-4基因CpG岛的位点甲基化水平和整体甲基化水平差异均无统计学意义(P＞0.05).ITP组中IFN-γ和IL-4的mRNA表达水平与基因启动子区甲基化水平不存在相关性(均P＞0.05).结论:ITP患者处于Th1极化状态,IFN-γ和IL-4的基因启动子区的甲基化水平对各自基因mRNA水平的表达不起调控作用.     

羟基喜树碱对系统性红斑狼疮患者单核淋巴细胞中p16基因表达和启动子甲基化修饰的影响

目的: 探讨羟基喜树碱(Hydroxycamptothecin, HCPT)对系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)甲基化敏感基因p16的表达和启动子甲基化修饰的影响。方法: 密度梯度离心法分离得外周血单个核细胞,使用浓度为0.25、0.5、1和2 mg·L^-1的HCPT处理SLE患者PBMC,24 h后收集细胞。MTT法检测处理后PBMC的活力。定量PCR检测p16及DNA甲基转移酶1(DNA Methyltransferase1,Dnmt1)基因mRNA 表达水平,2^-ΔΔct法分析结果。甲基化特异性PCR分析p16基因启动子区甲基化水平。结果: (1)HCPT处理24 h后,0.25、0.5和1 mg·L^-1HCPT处理组PBMC活力之间比较差异无统计学意义(P>0.05),2 mg·L^-1HCPT处理组PBMC活力与0.25、0.5和1 mg·L^-1HCPT处理组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)1 mg·L^-1HCPT处理组与对照组比较p16基因mRNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)1 mg·L^-1HCPT处理组与对照组比较Dnmt1基因mRNA表达水平降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。(4)DNA甲基化水平检测显示HCPT处理组p16基因启动子甲基化水平较对照组显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论: HCPT通过降低Dnmt1基因表达水平,下调p16基因启动子甲基化水平,从而增加SLE患PBMC中p16表达水平。     

宫颈癌DKK-3基因启动子甲基化检测及其临床意义

目的 检测宫颈癌DKK-3基因启动子甲基化情况并研究其临床意义.方法 采用甲基化特异性PCR检测宫颈癌患者和健康女性宫颈活检组织或术后病理组织DKK-3基因启动子甲基化情况,比较其差异并分析宫颈癌患者DKK-3基因启动子甲基化与临床病理因素的关系.结果 宫颈癌患者DKK-3基因启动子甲基化率显著高于健康女性（P＜0.05）;宫颈癌患者DKK-3基因启动子甲基化率在年龄、吸烟史、酗酒史和病理类型中差异均无统计学意义（P＞0.05）,在HPV感染、分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移、远处转移和Figo分期中的差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 宫颈癌患者DKK-3基因启动子甲基化率显著高于健康女性,且与病情及预后密切相关.     

Survivin在多发性骨髓瘤中的表达及其与VEGF的相关性

目的研究Survivin在多发性骨髓瘤（MM）中的表达及其与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）之间的相关性。方法采用RT-PCR和Western blot法检测骨髓瘤细胞系RPMI8226及28例MM患者（其中初治16例、复发,难治12例）,6例正常人骨髓细胞中Survivin和VEGF mRNA、蛋白质表达水平。结果骨髓瘤细胞系RPMI8226高表达Survivin和VEGF。Survivin mRNA在正常人、初治和难治／复发MM患者骨髓细胞中阳性率分别为19．8％、77．3％和80．2％,表达水平（Survivin与内参比）分别为0．07±0．03、0．37±0．12和1．2±0．31,MM患者表达率和表达水平显著高于正常人（P〈0．01）,而难治／复发MM组表达水平高于初治组（P〈0．05）。在初治和难治／复发MM组Survivin蛋白阳性率分别为43．8％和61％（P〉0．05）,难治,复发MM组表达水平明显高于初治组。VEGF在MM中的表达变化与Survivin呈相同趋势。结论Survivin和VEGF参与了MM的发病且与疾病进展有关,两者间存在协同关系。     

CyclinD1及p27蛋白在多发性骨髓瘤骨髓活检中的表达及临床意义

目的研究细胞周期蛋白D1（CyclinDl）及p27蛋白在多发性骨髓瘤（muhiplemyeloma,MM）骨髓活检组织中的表达情况及相关性,并探讨它们在MM发生、发展及转归中的意义。方法采用免疫组织化学方法,检测80例MM患者和10例缺铁性贫血患者（对照组）骨髓组织中CyclinDl和p27的蛋白表达水平及相关性。结果CyclinDl及p27蛋白在多发性骨髓瘤组和对照组中的表达率比较差异有统计学意义（P〈0．05）。CyclinDl及p27蛋白在多发性骨髓瘤组不同分期中存在明显差异（P〈0．05）,在不同分型中表达率的比较无明显差异（P〉0．05）。多发性骨髓瘤缓解组与未缓解组治疗前CyclinDl及p27蛋白表达率的比较无明显差异,治疗后存在明显差异（P〈0．05）。CyclinDl与p27蛋白在多发性骨髓瘤中的表达呈负相关（r=-0．521）。结论CyclinDl在人骨髓瘤细胞中呈过度表达并随着MM恶性程度的增加而加强。P27蛋白在MM组呈低表达,并随MM恶性程度的增加而降低;二者与多发性骨髓瘤的发生、发展及恶性程度等存在密切关系,对多发性骨髓瘤的诊断、恶性度评估及预后判断有重要意义。     

原发性结肠腺癌中E—cadherin基因异常甲基化及蛋白表达的研究

目的探讨原发性结肠腺癌组织与相应癌旁组织中E-cadherin（E-cad）基因异常甲基化改变及其蛋白表达的特点。以及其与结肠腺癌发生发展的关系。方法分别采用甲基化特异PCR（MSP）和免疫组化SP法检测40例原发性结肠腺癌和相应癌旁组织中E—cad基因甲基化状态及蛋白表达水平,并结合临床资料进行分析。结果结肠腺癌中E-cad甲基化率为70．0％,癌旁组织中为10．0％,两者有显著差异性（P〈0．01）;结肠腺癌中E—cad蛋白的表达率为32．5％,癌旁组织中为80．0％;两者有显著差异性（P〈0．01）。E—cad蛋白缺失的27例标本中有24例甲基化阳性。甲基化与蛋白缺失有明显关系（P〈0．01）。E-cad甲基化程度与患者的性别、年龄、肿瘤的大小之间差异无显著意义（P〉0．05）,但与肿瘤浸润深度、分化程度、淋巴结转移之间差异有显著意义（P〈0．05）。结论E—cad基因的异常甲基化可影响蛋白的表达,它们与结肠腺癌的发生发展有关,E—cad甲基化和蛋白表达可能作为结肠腺癌预后的候选标志物之一。     

白血病抑制因子基因在急性白血病患者中的表达及意义

目的研究急性白血病(acute leukemia,AL)患者外周血白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)mRNA的表达水平及其与AL病情、疗效和预后的关系。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测37例不同类型以及同一类型不同阶段AL患者[初治患者16例(初治亚组)、完全缓解患者12例(完全缓解亚组)、复发患者9例(复发亚组)]LIF的mRNA的表达水平,并与20例健康者(对照组)比较。结果初治亚组LIF基因mRNA阳性表达率低于对照组和完全缓解亚组(P<0.05);复发亚组LIF基因mRNA阳性表达率低于完全缓解组(P<0.05);复发亚组与初治亚组比较及完全缓解亚组与对照组比较,LIF基因mRNA阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05);LIF基因表达率在急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)患者间无显著性差异(P>0.05)。结论 LIF基因表达水平与AL患者病情变化密切相关。检测AL患者LIF基因表达情况,为AL患者检测病情、疗效评价、指导临床用药和预后判断,提供了一定的理论依据。     

老年白血病患者Survivin基因表达及临床意义

目的探讨Survivin基因在老年白血病患者白血病细胞中的表达,并分析与预后的关系。方法应用RT-PCR对32例不同时期老年急性白血病（AL）患者及5例慢性淋巴细胞白血病患者的白血病细胞Survivin基因mRNA表达情况进行检测,以10例健康人作为对照。结果 32例老年AL患者白血病细胞Survivin mRNA阳性表达率为71.87%,急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞Survivin mRNA表达率为71.42%与急性非淋巴细胞白血病（ANLL）细胞76%的表达率比较差异无统计学意义,二者均高于对照组（χ2=5.90、6.81,P〈0.05）。初治和复发AL患者白血病细胞Survivin mRNA阳性表达率分别为78.01%、84.15%,明显高于对照组（χ2=12.61、9.23,P〈0.05）,老年慢性淋巴细胞白血病患者的白血病细胞中无Survivin表达。结论老年急性白血病的发生、发展可能与Survivin基因的过度表达密切相关。     

异硫氰酸苯已酯诱导骨髓瘤U266细胞P16基因去甲基化

目的研究异硫氰酸苯己酯(PHI)对骨髓瘤U266细胞株P16基因的去甲基化作用并探讨其作用机制。方法应用半定量逆转录-聚合酶链反应检测U266细胞经过PHI处理后DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因的mRNA的表达变化,用甲基化特异性聚合酶链反应检测PHI作用前后U266细胞株P16基因甲基化状态的变化。结果使用不同浓度的PHI处理U266细胞72h后,U266细胞表达DNMT1、DNMT3a、DNMT3bmRNA的水平明显降低并呈浓度依赖性。以不同浓度的PHI处理U266细胞10d后,P16基因的甲基化状态被逐渐逆转。结论 PHI可能通过抑制DNA甲基转移酶的表达水平诱导P16基因产生去甲基化,使失活的抑癌基因重新激活,诱导瘤细胞凋亡。     

抗凋亡蛋白Livin在急性白血病中的表达

目的研究Livin在急性白血病中的表达,探讨其临床意义。方法采用半定量逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)检测40例急性白血病(AL)患者(AL组)LivinmRNA的表达水平,其中初治患者16例(初治亚组)、复发患者11例(复发亚组)、完全缓解患者13例(缓解亚组)。另选10例健康人(对照组)的标本作正常对照。结果初治亚组中LivinmRNA的表达较对照组明显升高(P<0.05),治疗缓解后的表达水平下降(P<0.05),复发时又再次升高;初治亚组Livin阳性的患者缓解率(14.3%)低于表达阴性的患者(77.8%)(P<0.05)。LivinmRNA的表达与AL患者性别、年龄无关(P>0.05)。结论 Livin基因的过度表达参与了AL的发病,并且是AL复发的高危因素。Livin基因的高表达是判断AL预后不良的指标之一。