不同泡制时间天麻酒药效成分动态溶出规律研究

目的建立一种超高效液相色谱法(UPLC)同时检测天麻酒中天麻素、对羟基苯甲醇两种药效成分的方法。通过将天麻粉和天麻片置于53%的乙醇中模拟天麻酒的酒浸过程,研究指标性药效成分的动态溶出规律。方法运用超高效液相色谱仪-二极管阵列检测器(UPLC-DAD)进行天麻素和对羟基苯甲醇的定性与定量测定。色谱条件:乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱,检测波长220 nm,柱温25℃,进样量10.0μl,流速1.0 ml/min。结果天麻素的线性方程为Y=21.341X+43.525(r=0.9997),线性范围3.2～32.0μg/mL;对羟基苯甲醇的线性方程为Y=33.673X+21.806(r=0.9995),线性范围11.68～116.8μg/mL;天麻粉组中天麻素,对羟基苯甲醇的平均回收率分别为91.09%、98.09%。天麻片组中天麻素,对羟基苯甲醇的平均回收率分别为90.52%、96.90%。结论该方法能够对天麻酒中的药用有效成分进行定性与定量测定,可以用于天麻酒的质量控制。通过研究不同泡制时间天麻酒的动态溶出规律,能够指导天麻酒的制备。     

青蒿鲨烯合酶基因打靶研究

目的通过代谢途径工程调整代谢流向,试图增大转基因青蒿Artemisia annua植株中的青蒿素产量。方法利用青蒿鲨烯合酶(SS)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因和胞嘧啶脱氨酶(CodA)基因构建基因打靶载体,并通过冻融法将载体导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens。以叶盘法转化青蒿,采用"分段选择法"筛选转基因再生植株。结果对表达GFP基因后发出绿色荧光的转基因植株,采用PCR及PCR产物杂交法,在1棵转基因植株中检测到外源GFP基因,而未检测到内源SS基因。初步证据显示,在转基因青蒿植株中,突变型SS基因已取代野生型SS基因。结论青蒿鲨烯合酶基因打靶已取得初步成功。     

天麻二羧酸-三羧酸盐载体蛋白基因的克隆及功能初探北大核心CSCD

基于天麻转录组数据,设计特异性引物,克隆天麻二羧酸-三羧酸载体蛋白编码基因GeDTC,并利用ExPASy、ClustalW、MEGA等软件对其进行生物信息学分析,利用马铃薯遗传转化体系,获得阳性转基因植株和微型薯,并对微型薯块茎的大小、质量、有机酸和淀粉含量等农艺性状进行了检测和分析,对GeDTC基因功能进行初步研究。结果显示,GeDTC开放阅读框(open reading frame)全长981 bp,编码326个氨基酸残基,相对分子质量为35.01 kDa。预测GeDTC蛋白的理论等电点为9.83,不稳定系数为27.88,亲水性平均指数为0.104,属于稳定的亲水性蛋白。GeDTC蛋白存在1个跨膜结构,无信号肽,定位于线粒体内膜。系统进化树显示,GeDTC与其他种类植物DTC蛋白之间具有较高的同源性,其中与铁皮石斛DcDTC(XP_020675804.1)同源性最高,为85.89%。运用双酶切方法构建GeDTC过表达载体pCambia1300-35Spro-GeDTC,并通过农杆菌介导转化法获得了马铃薯转基因植株,移栽收获的转基因株系微型薯和野生型株系相比体积更小,质量更轻,有机酸含量低,淀粉含量无显著差异。初步推测天麻GeDTC基因可能为三羧酸的外排通道并参与调控块茎的发育,为深入阐明天麻块茎形成的分子机制奠定了基础。     

白藜芦醇合酶基因的克隆及丹参的转化

目的为探索利用分子生物学技术培育新型药用植物的新途径,将外源的白藜芦醇合酶(RS)基因导入到丹参中表达,以改善或增加丹参的效用。方法根据已公布的核苷酸序列,利用引物悬挂延伸法,经过3次扩增,最终从葡萄基因组DNA中获得完整的RScDNA基因序列;以质粒pBin438为基础,构建含有RS目的基因的组成型植物表达载体。在根癌农杆菌介导下,利用叶盘法转化丹参,进而通过PCR、PCR-Southern杂交对不同的转基因植株进行筛选与检测。结果总共得到了45棵卡那霉素抗性植株,经PCR和PCR-Southern杂交检测,确定葡萄RS基因已整合到部分转基因丹参苗的基因组中。结论成功建立了白藜芦醇合酶基因转化丹参的体系,并获得了转基因植株。     

RP-HPLC测定天菊脑安胶囊中天麻素的含量

天菊脑安胶囊中天麻为方中君药.天麻为兰科植物天麻Gastrodia elata B1.的干燥块茎,具有平肝息风、止痉等功能,用于头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫抽搐、破伤风等病症,为传统的名贵中药材.其有效成分为天麻素(gastrodin,天麻苷)及其苷元,其含量测定方法有紫外分光度法、薄层扫描法和高效液相色谱法等[1～3].中国药典则采用高效液相色谱法[3,4].现通过改进色谱条件,建立高效液相色谱法测定天麻素的含量,方法简单,可作为该制剂的质量控制方法.     

天麻钩藤药对去天麻多糖前后天麻素的肝、肾组织分布研究

目的:研究去天麻多糖前后天麻钩藤水煎液中效应成分天麻素在高血压模型大鼠体内的组织分布。方法:分别对两组高血压模型大鼠灌胃天麻钩藤水煎液和去多糖天麻钩藤水煎液,用高效液相色谱法检测各组效应成分天麻素的含量;色谱柱:Waters TM 4.6×250 mm,RP18.5μm;前置预柱:Wondasil 4.0×l0mm,C18,5μm;流动相:乙腈-0.1%磷酸(3∶97),流速:1.0ml/min,检测波长:220nm,柱温:30℃,进样量:10μl。结果:去天麻多糖后,肝脏和肾脏中天麻素的AUC(1.354×104<3.647×104,8.559×103<8.431×104)均下降,而肾脏中下降最为明显,表明天麻多糖对天麻素在肝脏和肾脏的分布都有一定的促进作用,且对肾的促进作用最为显著;Cmax(34.84<54.02,16.34<18.55)、Ka(0.0182<0.4792,0.0369<0.0570)均下降,表明天麻多糖会促进天麻素在肝、肾分布。结论:去天麻多糖后,肝脏中天麻素的AUC减少了62.87%,表明天麻多糖对天麻素在肝脏中的分布具有促进作用。     

大肠杆菌利用L-酪氨酸生物合成天麻苷元的代谢工程研究北大核心CSCD

天麻苷元是我国名贵中药材天麻中的一种重要活性成分,也是天麻素生物合成的主要前体物质,具有抗炎、抗肿瘤以及保护脑缺血等多种药理活性,其作为主要成分的医药产品越来越受人们的青睐。当前天麻苷元的获取主要以天然提取和化学合成为主,但它们都存在一些限制其长远应用的不足,如野生和栽培天麻资源有限,化学合成需步骤多、时间长、条件苛刻的反应,且反应副产物多、反应三废不好处理等,因此如何人工制备产量大、纯度高的此类物质,已成为医药研究工作者一个亟待解决的问题。该研究以微生物代谢工程理论为指导,采用基因工程相关技术,将ThiH,pchF和pchC 3个基因导入大肠杆菌,使其成为利用L-酪氨酸合成天麻苷元的工程菌,并利用摇瓶发酵手段对该工程菌发酵生成天麻苷元的条件进行探讨。实验结果显示,该工程菌在IPTG浓度为0.5 mmol·L^(-1)、诱导温度为15℃、转化温度为40℃时,可将含200 mg·L^(-1)L-酪氨酸的M9Y培养基转化生成(69±5)mg·L^(-1)天麻苷元,这一结果为日后进一步扩大发酵规模,从而既经济又高效地生产天麻苷元奠定了基础。     

大肠杆菌CodA基因表达赋予转基因青蒿负选择表型

目的为了验证CodA基因是否适宜作为有效的青蒿基因打靶负选择标记。方法用PCR法扩增大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因CodA,经克隆和测序后插入植物基因表达载体pROK,并导入根癌农杆菌LBA4404(pAL4404)中。以共培养法转化青蒿叶盘,在添加25μg/mL卡那霉素(Kan)的N6培养基上选择青蒿转化愈伤组织并再生绿芽。将Kan抗性转基因青蒿芽转植到含有500μg/mL5-氟胞嘧啶(5-FC)和25μg/mLKan的MS培养基上继续培养2周。结果转基因青蒿芽全部死亡,而未转化青蒿芽仍正常生长,表明导入CodA基因的青蒿细胞已赋予其预期的负选择表型。经RT-PCR检测,转基因青蒿芽显示CodA阳性扩增带,而未转化青蒿芽无此特异扩增带。这一结果显示,CodA基因已在青蒿细胞中转录生成相应的mRNA,从而进一步印证了表型检测结果。结论CodA基因可作为有效的青蒿基因打靶负选择标记。     

金属硫蛋白2基因在红花中表达的初步研究

目的 获得转金属硫蛋白2(metallothionein 2,MT2)红花植株,为MT药用蛋白的生产奠定基础。方法采用Nco I/HindⅢ酶切pEASY-oleosin-MT获得oleosin-MT融合基因,将其插入到植物油体高效表达载体pOP上,构建重组质粒pOP-oleosin-MT,进行PCR和双酶切鉴定。采用冻融法将重组质粒pOP-oleosin-MT转入根瘤农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化红花,对转MT基因红花植株进行PCR检测及Southern blotting检测。结果成功构建了MT基因的植物油体表达载体pOP-oleosin-MT,获得了3株PCR检测呈阳性的转MT基因红花植株。结论建立了完善的红花再生体系,获得了转MT基因的红花植株。     

镇惊熄风方药的研究近况(续完)

<正> 二、目前,一些药理研究结果与临床疗效不尽吻合,各家实验结果尚不一致,分析原因,可能与下几点有关: 1.与药物产地(如野生天麻与栽培天麻的主要成分一致,但天麻素的含量前者高出一倍)、种类(如钩藤种类不同,钩藤总碱可相差三倍以上)、药用部位(如钩藤钩较细茎枝、混钩降压力强,老枝则差,且降压持续时间短,但此点也有不同的看法)、剂型(如钩藤醇浸液对抗五甲烯四氮唑引起的惊厥,而煎剂无效;结核散3％醋酸和稀乙醇药液抑制结核杆菌,而水煎液则无效;夏枯草制剂不同时,     

野生、退化、复壮蜜环菌对天麻产量及天麻素量的影响

目的 通过复壮已退化的蜜环菌,恢复其促进天麻生长及天麻素积累的作用.方法 将相同来源的蜜环菌Arrmillearia mellea野生菌种、该野生菌种连续无性繁殖退化的后代菌种以及退化后复壮的黹种接种到同一品种的天麻Gastrodia elata上进行栽培试验,测定大麻的生物产量和天麻素质量分数.结果 野生菌种组与退化菌种组相比较、复壮菌种组与退化菌种组相比较在天麻产量、天麻素质量分数上有显著性差异(P<0.01).结论 采用诱导子实体方法可以使退化的蜜环菌复壮,其促进天麻生长、天麻素积累的作用也得以恢复.     

家栽天麻与野生天麻质量比较

 目的 比较家栽天麻与野生天麻的质量。方法 根据多年积累的实验结果和调查数据分析研究。结果 家栽天麻与野生天麻生长的生态环境、营养条件、生长年限相同或较接近;采挖的野生天麻60%以上是抽苔开花营养被消耗的春麻;天麻苷含量家栽天麻高于野生天麻。结论 家栽天麻质量优于野生天麻。     

红花查耳酮异构酶基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

目的构建红花查耳酮异构酶(CHI)基因的植物表达载体并在拟南芥中进行超表达验证该基因的功能。方法将已经分离的红花CHI基因作为目的基因,在其两端引入Bam H I和Eco R I酶切位点,构建含有35S启动子的植物超表达载体p BASTA-CHI,通过Flora-dip法将其转化到拟南芥中,并对转基因拟南芥T2代植株进行PCR和总黄酮量检测。结果转基因拟南芥T2代植株的PCR检测,红花CHI基因已经初步整合到拟南芥基因组中,黄酮量检测表明,转红花CHI基因的拟南芥比野生型拟南芥中的黄酮量有所提高,最高提高到2.3倍。结论成功构建了含有红花CHI基因的植物表达载体,并在拟南芥中进行超表达,获得了转基因拟南芥T2植株。     

天麻及其伪品的毛细管电泳鉴别及天麻素的测定

目的：利用毛细管电泳法鉴别天麻及其4种常见伪品以及测定天麻中有效成分天麻素,方法：电泳分离条件为24mmol/L硼酸盐（pH=9.4),运行电压为16kV。结果：在该分离条件下,通过比较电泳谱图和天麻素加标实验,4种伪品与天麻可以很容易鉴别,天麻中的天麻素可以达基线分离,定量测定在15min之内完成,线性相关方程为Y＝－0．048＋7．79X(r=0.999)。结论：方法简便,加快,准确,可以作为中药天麻的质量控制方法。     

贵州野生与栽培天麻种质资源的SSR分析

目的 对贵州省野生和栽培共24个天麻基因组DNA的遗传多态性进行分析,构建其SSR指纹图谱.方法 采用改良的CTAB法提取天麻基因组DNA,采用NTSYSpc软件进行UPGMA聚类分析和遗传相似度分析.结果 改良的CTAB法能够获得纯度和浓度较高的天麻基因组DNA,PCR扩增获得较清晰的SSR指纹图谱,UPGMA聚类可...     

不同栽培措施对两种天麻物候期及蒴果的影响

目的对天麻Gastrodia elata物候期和蒴果进行研究,为克服天麻种性退化,培育优良种子,提供优质种源。方法采用完全区组试验设计的方法,进行室内盆栽试验,分析了各栽培措施对两种天麻物候期和蒴果的影响。结果从物候期看,3个种麻栽培时间中,12月栽培的红、绿天麻的现蕾期、开花期、结果期持续时间长(红天麻分别为12.50、9.80、7.25 d,绿天麻分别为12.80、10.75、7.00 d),种子成熟时间短(红天麻为19.50 d,绿天麻为18.50 d);3个种麻分级中,一、二级红、绿天麻的各物候期持续时间无显著差异(P<0.05)。从蒴果上看,现蕾初期不打尖时,3个种麻栽培时间中,12月栽培的红、绿天麻蒴果质量好,红天麻蒴果数、蒴果质量和种子生命力分别为66.50个/株、28.18 g/株、87.88%;绿天麻蒴果数、蒴果质量和种子生命力分别为63.00个/株、20.09 g/株、78.40%;3个种麻分级中,一级红天麻的蒴果质量最好(蒴果数为96.29个/株,蒴果质量达50.21 g/株),三级绿天麻的蒴果质量最差(蒴果数为40.00个/株,蒴果质量为14.90 g/株)。结论在贵州西北地区,以一级红天麻,一、二级绿天麻作种,并于12月进行栽培,现蕾初期不采用打尖处理时,可以获得优质的天麻蒴果。     

乌拉尔甘草转鲨烯合成酶基因毛状根系研究

目的:为了研究甘草酸的合成调控途径及提高甘草酸合成水平.方法:将已克隆的乌拉尔甘草鲨烯合成酶基因(GuSQS1,GenBank登录号为:AM182329)通过发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes A4的介导,转化甘草下胚轴并诱导毛状根的形成.建立的毛状根系经0.8 mg·L~(-1)的除草剂(PPT)抗性筛选、PCR和Southern blotting检测分析后,得到的转基因毛状根系经HPLC检测甘草酸(GA)含量.结果与结论:转基因毛状根中甘草酸的最高含量约为野生型毛状根的3.6倍.     

抗菌肽cecropin B和兔NP-1融合基因转化鱼腥草的研究

目的:将抗菌肽cecropin B和兔NP-1(CN)融合基因转入鱼腥草,培育鱼腥草基因工程新品种。方法:设计并合成抗菌肽融合基因CN,构建重组质粒pBI121-CN,并转入农杆菌LBA4404,以农杆菌介导法转化鱼腥草外植体,将卡那霉素筛选获得的再生抗性植株以快速筛选PCR法进一步筛选阳性植株,再提取基因组DNA进行PCR-Southern鉴定,RT-PCR分析目的基因在鱼腥草中的表达,以大肠杆菌K12抑菌圈实验和立枯丝核菌感染实验分析转基因鱼腥草抗菌能力。结果:抗菌肽基因已整合到转基因鱼腥草基因组中并表达,表现出抗菌能力增强的性状。结论:以抗菌肽融合基因CN转化鱼腥草,初步获得抗菌活性提高的转基因植株。     

Ri质粒人参转化系统的建立及鉴定

目的 :建立人参毛状根转化体系。方法 :利用含有Ri质粒的发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes感染人参Panax ginseng进行毛状根诱导 ,利用PCR技术及TLC分析方法对毛状根进行鉴定。 结果 :首次从人参带叶幼茎处诱导出毛状根 ,用激素和AS(乙酰丁香酮 )处理可提高转化率并缩短转化时间。毛状根在无激素B5培养基上生长并失去向地性 ,月增长倍数可达 50倍 (鲜重 )。PCR分析证实农杆菌Ri质粒含有rolC序列 (564bp)的T DNA已整合到人参转化株的染色体组中 ,TLC分析证明T DNA特异的表达产物冠瘿碱在转化细胞中合成。人参毛状根中人参总皂苷含量为 2.486% (干重 ) ,而人参原药材总皂苷含量为 1.403% (干重 )。结论 :人参毛状根生长迅速 ,皂苷含量高于原药材 ,该体系的建立为利用生物技术工业化生产人参活性成分奠定了基础。     

基于Group-Lasso天麻品质形成关键因子的分析

目的 为提高人工种植天麻的质量,基于Group-Lasso变量筛选构建随机森林回归模型分析影响天麻品质形成的关键因子。方法 基于Group-Lasso法,对2007—2022年天麻质量研究文献中天麻素含量及产地环境变量等数据进行变量筛选,并在筛选出的变量基础上建立随机森林回归模型及计算变量重要性得分。结果 最终选择了产区、生长状况、种质类型、产地气候类型、产地土壤类型、最热月均温、产地年降水量、产地年日照时数和无霜期9个变量,基于被选变量与天麻素含量建立随机森林回归模型,模型的均方误差（mean square error,MSE）和平均绝对百分误差（mean absolute percentage error,MAPE）分别为0.103 2和14.08%,特征重要性排序显示天麻素含量的最大影响因素是产地年降水量,其次是产地土壤类型、无霜期和产地年日照时数。结论 随机森林回归模型有相对较低的误差和较高的预估精度,更适合用于对天麻种植环境的分析和天麻素含量的估算,为人工种植天麻提供参考。